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CpG-ODN對(duì)新生大鼠缺血/缺氧性腦損傷的保護(hù)作用研究

2017-07-19 12:30馮占輝王世平馮祝婷靳艷玲
關(guān)鍵詞:腦損傷腦組織通路

黃 瑩, 葉 蘭 ,馮占輝,2,王世平,3,馮祝婷 ,靳艷玲

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,貴州 貴陽(yáng) 550025;2. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,貴州 貴陽(yáng) 550004;3. 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025)

CpG-ODN對(duì)新生大鼠缺血/缺氧性腦損傷的保護(hù)作用研究

黃 瑩1, 葉 蘭1,馮占輝1,2,王世平1,3,馮祝婷1,靳艷玲1

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,貴州 貴陽(yáng) 550025;2. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,貴州 貴陽(yáng) 550004;3. 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025)

目的 探討Toll 樣受體9( Toll- like receptor 9,TLR9) 激動(dòng)劑——含CpG 基序的寡核苷酸(CpG-ODN)對(duì)新生大鼠缺血/缺氧性腦損傷的保護(hù)作用機(jī)制。方法 50只健康7日齡新生Wistar大鼠,♀♂不限,隨機(jī)分為5組,假手術(shù)組、缺血/缺氧性腦損傷(HIBD)組、CpG-ODN低劑量組(0.35 mL·kg-1)、CpG-ODN中劑量組(1.40 mL·kg-1)、CpG-ODN高劑量組(5.60 mL·kg-1)。術(shù)后48 h對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分,光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理學(xué)改變。免疫印跡法檢測(cè)缺血/缺氧側(cè)腦組織中磷酸化p38 MAPK、TLR9表達(dá),酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)TNF-α的表達(dá)。結(jié)果 CpG-ODN低、中劑量組較模型組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低,病理學(xué)損傷減輕,而高劑量組較模型組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分升高(P<0.05),病理學(xué)損傷加重;Western blot 分析結(jié)果表明,缺血/缺氧側(cè)腦組織中磷酸p38 MAPK、TLR9蛋白表達(dá)逐漸上調(diào),TNF-α在腦組織中含量逐漸升高(P<0.05)。結(jié)論 TLR9激動(dòng)劑CpG-ODN低、中劑量可改善新生大鼠腦缺血/缺氧損傷神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及神經(jīng)系統(tǒng)功能,減輕新生大鼠缺血/缺氧性腦損傷,其機(jī)制可能是通過適度激活p38 MAPK信號(hào)通路,并分泌適量TNF-α 發(fā)揮作用。

缺血/缺氧腦損傷;腦;TNF-α;TLR9;CpG-ODN ;p38絲裂原活化蛋白激酶

新生兒窒息,或稱為新生兒缺血/缺氧性腦損傷(hypoxic-ischemic encephapathy, HIE)是指由圍產(chǎn)期引起的窒息腦損傷。新生兒窒息有較高的發(fā)病率,導(dǎo)致每年全國(guó)有約92萬(wàn)新生兒死亡[1]。已有研究學(xué)者證實(shí),誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)和組織損傷的主要分子是Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)。Toll樣受體是一類重要模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs),能夠有效地識(shí)別非己成分自身而被活化,是連接適應(yīng)性免疫應(yīng)答與細(xì)胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵蛋白[2]。本課題選用CpG-ODN是Toll 樣受體9(Toll-like receptor-9,TLR9)的激動(dòng)劑,可活化TLR9受體;CpG-ODN具有一系列重要的生物活性,能減弱腦缺血/再灌注損傷,從理論上推測(cè)這些生物活性對(duì)抗缺血/缺氧損傷應(yīng)該是十分有益的[3]。目前CpG-ODN已被作為免疫調(diào)節(jié)劑用于臨床,以及國(guó)外已將CpG-ODN 用于非霍奇金淋巴瘤、膿毒血癥、黑熱病、腫瘤等實(shí)驗(yàn)研究[4]。將來(lái)我們?nèi)缒茏C實(shí)TLR9激動(dòng)劑CpG-ODN在減輕缺血/缺氧性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)中也有極其重要作用,這無(wú)疑為缺血/缺氧腦損傷治療藥物的研究帶來(lái)新的方向。在缺血/缺氧性腦損傷中,許多胞內(nèi)外信號(hào)通路和細(xì)胞因子參與其中,p38絲裂原蛋白激酶(p38 MAPK)是MAPK主要家族成員,其信號(hào)通路是把細(xì)胞外刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi)中起重要作用,可能參與了細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、炎癥、腫瘤及其他多種疾病密切相關(guān)[5]。本研究擬觀察TLR9激動(dòng)劑CpG-ODN在大鼠缺血/缺氧性腦損傷中的作用,探討其與p38 MAPK信號(hào)通路的關(guān)系及誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor, TNF-α)的分泌,為明確其在腦中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)7 d新生Wistar大鼠 ,購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào): SCXK( 黔) 2012-0001,♀♂不限,體質(zhì)量12 g~17 g。 隨機(jī)分為5組,每組10只,假手術(shù)組只行頸部手術(shù),暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈,不結(jié)扎,不缺氧;HIBD組接受完整的缺血手術(shù)及缺氧過程;CpG-ODN低、中、高劑量組建立 HIBD 模型后1 h給藥。

1.2 試劑與藥品 p-p38 MAPK兔多克隆抗體(美國(guó)Abcam,批號(hào)GR43541-12);TLR9兔多克隆抗體(美國(guó)Abcam,批號(hào)GR2718-10);GAPDH兔多克隆抗體(Proteintech 公司,批號(hào)10494-1-AP);辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司,批號(hào)109525));10%水合氯醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠,批號(hào)20150725); TNF-α酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號(hào)E3730-1611-2);8%氧氣和92%氮?dú)饣旌蠚怏w(貴陽(yáng)同輝氣體公司,批號(hào)11298);C型CpG-ODN:ODN D-SL03(美國(guó)InvivoGen公司)。

1.3 儀器 密閉缺氧箱(自制直徑15 cm,高20 cm),ELx800-ΜV 型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek 公司),KJ-210A 型振蕩器(姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司),2001HY-6003型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma公司),ChemiDocTMXRS+型凝膠成像儀和ImageLab 圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司),DYY-7C 型電泳儀( 北京市六一儀器廠),IX71型顯微鏡(日本Olympus 公司)。

1.4 給藥方案 給藥組采用CpG-ODN滴鼻液:將合成的CpG- ODN 粉末用去離子水配制成濃度為100 μmol ·L-1的儲(chǔ)備液,使用時(shí)用PBS 稀釋到所需濃度,混勻;假手術(shù)組和模型組用相同體積生理鹽水代替。各組全部采用微量注射器吸取生理鹽水或者藥物準(zhǔn)確滴于乳鼠雙側(cè)前鼻孔內(nèi),每側(cè)鼻孔給藥低、中、高劑量,分別為0.35、1.40、5.60 mL·kg-1,術(shù)后1 h給藥。

1.5 建立缺血/缺氧腦損傷模型 選取7 d Wistar大鼠稱重,♀♂不限,術(shù)前12 h禁食,不禁水。然后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(5 mL·kg-1)后,行頸正中切口,分離左側(cè)頸總動(dòng)脈后雙重結(jié)扎,并從雙重結(jié)扎線中間剪斷血管,縫合切口。整個(gè)手術(shù)在顯微鏡下操作,待恢復(fù)90 min又將乳鼠放入密閉、透明的37℃缺氧箱中,并向缺氧箱中持續(xù)通入8%氧氣和92%氮?dú)饣旌蠚怏w,氣流量1 L·min-1,維持缺氧2 h,待幼鼠蘇醒后放回母鼠身邊繼續(xù)喂養(yǎng)。以乳鼠蘇醒后爬行過程向左轉(zhuǎn)圈, 提起尾時(shí)左前肢屈曲為造模成功標(biāo)志。

1.6 乳鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分 各組大鼠腦缺血/缺氧48 h后,參照Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能行為評(píng)分:0分,無(wú)任何神經(jīng)功能損失癥狀;1分,輕微局灶性神經(jīng)功能損失(缺血/缺氧區(qū)對(duì)側(cè)前肢伸展不完全);2分,中度局灶性神經(jīng)功能損失(行走過程中,向缺血/缺氧區(qū)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈);3分,重度局灶性神經(jīng)功能損失(行走過程中向缺血/缺氧區(qū)對(duì)側(cè)傾倒);4分,不能自發(fā)行走,存在意識(shí)水平障礙;5分,大鼠死亡。

1.7 HE染色 每組取5只大鼠,于手術(shù)后48 h,深麻醉下斷頭取腦組織,經(jīng)10%甲醛溶液固定3 d后,常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色,光鏡觀察病理結(jié)果。

1.8 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 模型復(fù)制成功48 h后,將各組大鼠麻醉處死,每組取5只大鼠損傷側(cè)大腦(右腦),稱量,用剪刀將組織盡量剪碎,以適量RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)吹打混勻,在冰上放置30 min(每隔10 min渦旋1次),4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min,取上清(總蛋白),-80 ℃保存,然后參照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書,測(cè)定腦組織裂解液中蛋白濃度。接著進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳,用12%分離膠,5%濃縮膠,BCA法測(cè)定蛋白濃度,每孔總蛋白上樣量為30 μg,90V電泳30 min,120 V電泳90 min。PVDF膜轉(zhuǎn)膜90 min,用TBST洗膜5 min×3次,5%BSA室溫封閉1.5 h,加入一抗TLR9( 1 ∶2 000)、p-p38 MAPK(1 ∶1 000),4℃過夜,TBST洗5 min×3次,加入羊抗兔的二抗( 1 ∶5 000) ,常溫孵育2 h,TBST洗5 min×3次,最后用配制化學(xué)發(fā)光檢測(cè)底物工作液A液、B液按1 ∶1混勻,取適量滴加在PVDF膜上后,吸去多余發(fā)光底物工作液,在凝膠成像儀上曝光顯色,并測(cè)定灰度值。

1.9 ELISA法檢測(cè)TNF-α含量 模型復(fù)制成功48 h后處死大鼠,稱取腦組織約40 mg置于盛有冰醋酸緩沖液的玻璃勻漿器中,勻漿后將組織粉碎的懸浮液轉(zhuǎn)至試管內(nèi),靜置并離心取上清液,測(cè)定蛋白濃度。ELISA法測(cè)定TNF-α 含量(試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司),測(cè)定方法嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明操作,設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能行為缺陷評(píng)分 手術(shù)后48 h,各組大鼠除假手術(shù)組外,均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺失,如行走向?qū)?cè)傾倒或旋轉(zhuǎn),提尾時(shí)缺血/缺氧腦區(qū)對(duì)側(cè)前肢不能伸直等。Longa評(píng)分結(jié)果見Tab 1。各組進(jìn)行比較表明,模型組、CpG-ODN高劑量組Longa評(píng)分高于假手術(shù)組(P<0.01);CpG-ODN低、中劑量預(yù)處理組Longa評(píng)分低于模型組(P<0.05)。

2.2 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果 光鏡×400倍視野下,伊紅染胞質(zhì)呈粉色,蘇木精染胞核呈藍(lán)色。假手術(shù)組大腦皮層組織結(jié)構(gòu)可見,未見明顯病理改變,神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞大小、形態(tài)、數(shù)量及排列正常規(guī)則,細(xì)胞核圓而大,核仁清晰,無(wú)明顯水腫,極少見凋亡征象。模型組灶性區(qū)域大腦組織結(jié)構(gòu)破壞,神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞變性壞死伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)及膠質(zhì)細(xì)胞增生,胞質(zhì)水腫,細(xì)胞核深染,固縮,細(xì)胞脫失明顯,鏡下可見凋亡細(xì)胞。TLR9激動(dòng)劑CpG-ODN低、中劑量組神經(jīng)元形態(tài)和排列較模型組有所改善,與假手術(shù)組的形態(tài)和排列相似,其中以中劑量組改善最為明顯,相反,高劑量組神經(jīng)元形態(tài)和排列與模型組相似,不能改善大腦損傷(Fig 1)。

Fig 1 The rat brain tissue (HE staining×400)

A: Sham; B: HIBD group; C: CpG-ODN low group; D: CpG-ODN middle group; E: CpG-ODN high group

Tab 1 Effects of CpG-ODN on nerve deficit score after hypoxic-ischemic brain damage(HIBD) in neonatal rats(±s,n=10)

*P< 0.05vssham;#P< 0.05vsHIBD

2.3 大鼠腦組織中TLR9、p-p38 MAPK蛋白表達(dá) 如Fig 2所示,假手術(shù)組中大鼠腦組織中TLR9、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)較少;與假手術(shù)組比較,模型組及CpG-ODN各劑量組大鼠腦組織中TLR9、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)明顯上調(diào);與模型組比較,CpG-ODN中、高劑量組大鼠腦組織中TLR9、p-p38 MAPK 蛋白表達(dá)明顯上調(diào);與CpG-ODN中劑量比較,CpG-ODN高劑量組大鼠腦組織中TLR9、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)明顯上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 各組大鼠腦組織TNF-α的表達(dá) CpG-ODN低、中、高劑量組大鼠腦組織TNF-α表達(dá)高于假手術(shù)組和模型組,CpG-ODN高劑量組大鼠腦組織TNF-α表達(dá)高于低劑量組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Tab 2)。

3 討論

HIE是指由于圍產(chǎn)期缺氧窒息而導(dǎo)致的腦缺血缺氧性損傷,病死率高,即使存活可遺留不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,包括腦癱、癲癇、精神發(fā)育遲緩、注意力不集中、記憶力減退以及學(xué)習(xí)能力喪失等?;谄鋰?yán)重的臨床后果,迫切需要對(duì)缺血/缺氧性腦損傷的機(jī)制進(jìn)行深入的研究,進(jìn)而發(fā)現(xiàn)有效的干預(yù)措施[6]。治療HIE的手段通常有亞低溫治療、常規(guī)藥物治療、高壓氧治療等,但未見報(bào)道采用免疫劑進(jìn)行治療,本課題試圖采用免疫刺激劑適度激活腦內(nèi)p38 MAPK信號(hào)通路來(lái)減輕缺血/缺氧性腦損傷[7]。

Tab 2 Effect of CpG-ODN on expressions

*P<0.05vssham;#P<0.05vsHIBD;△P<0.05vsCpG-ODN middle

Fig 2 Expression of target protein in rat brain

A: Sham; B: HIBD group; C: CpG-ODN low group; D: CpG-ODN middle group; E: CpG-ODN high group.*P<0.05vsSham group;#P<0.05vsHIBD group;△P<0.05vsCPG-ODN middle group.

TLR9屬于TLRs家族之一,主要識(shí)別細(xì)菌DNA的CpG基序,識(shí)別外源病原微生物的侵入,便可啟動(dòng)一系列信號(hào)傳導(dǎo),作為自身免疫系統(tǒng)的重要組成部分在炎癥反應(yīng)中扮演著不可或缺的角色。本課題選用TLR9激動(dòng)劑CpG-ODN是人工模擬細(xì)菌DNA合成的寡聚核苷酸分子,具有細(xì)菌DNA的活性,能刺激免疫系統(tǒng)的活化并誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物產(chǎn)生免疫反應(yīng)的寡核苷酸片段,其活化TLR9,然后通過信號(hào)傳導(dǎo)激活B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及產(chǎn)生各種細(xì)胞因子,最終導(dǎo)致免疫網(wǎng)絡(luò)自身抗體產(chǎn)生和自身抗體產(chǎn)生的失衡;同時(shí)也發(fā)現(xiàn),把CpG換成CpG基序甲基化或者GpC均可使免疫模擬細(xì)菌DNA刺激作用消失[8]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,膠質(zhì)細(xì)胞尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞形成了中樞神經(jīng)系統(tǒng)防御反應(yīng)的第一防線。TLR9主要分布于小膠質(zhì)細(xì)胞,還分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元上[9]。在此研究中,采用滴鼻劑給予外源配體CpG-ODN方式,主要刺激TLR9活化,清除病原體,此過程參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫調(diào)節(jié);由于血腦屏障是由內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接形成物理屏障,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外界組織交換的主要場(chǎng)所,所以可以阻擋大分子物質(zhì)進(jìn)入大腦內(nèi),限制腦與血之間的物質(zhì)的交換,并在大腦微環(huán)境的穩(wěn)定中起到重要作用;雖然新生大鼠大腦發(fā)育不完全,血腦屏障通透性相對(duì)較高,但此藥是否能夠通過血腦屏障還不能確定,所以本研究采用鼻式給藥,使藥物避開血腦脊液屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng),提高藥物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的有效濃度[10]。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶,廣泛存在與大多數(shù)哺乳動(dòng)物中,可以被一系列的細(xì)胞外信號(hào)刺激,例如生長(zhǎng)因子、物理應(yīng)激、炎性細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)菌復(fù)合物等所激活,MAPK激活后進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用,并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng),調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育和凋亡,所以MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)分裂、分化及凋亡的調(diào)節(jié)中起到重要的作用。MAPK家族主要包括3個(gè)成員:細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2) 、c-Jun氨基末端激酶( c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38 MAPK。ERK主要參與細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育等;JNK和p38則更多地參與應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、纖維化、細(xì)胞的凋亡等,屬于應(yīng)激激活蛋白激酶[11]。p38 MAPK是MAPK家族中的重要成員,激活p38 MAPK通路,誘導(dǎo)p38 MAPK的磷酸化可使胰腺癌的細(xì)胞凋亡,還可以保護(hù)心臟缺血/再灌注損傷腦缺血/缺氧損傷,但如果過度活化將反而促進(jìn)炎癥反應(yīng),加快心肌細(xì)胞凋亡[12]。本實(shí)驗(yàn)研究表明,缺血/缺氧性腦損傷新生大鼠在免疫刺激劑CpG-ODN作用下,TLR9受體被激活,受體與藥物相結(jié)合,空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,通過胞內(nèi)TIR區(qū)域招募銜接蛋白MyD88依賴途徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo),其中信號(hào)傳導(dǎo)環(huán)節(jié)會(huì)涉及到MAPK的激活,于是我們通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)p-p38 MAPK蛋白隨之上調(diào),說明p38 MAPK信號(hào)通路在此過程也被激活,此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。

同時(shí)研究表明,p38 MAPK激活后磷酸化的p38 MAPK會(huì)分泌炎癥因子誘發(fā)免疫反應(yīng)[14]。我們通過ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè),其下游的TNF-α隨給藥劑量的增加而逐漸上調(diào)。TNF-α是一種生物作用非常廣泛的細(xì)胞因子,由單巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,有免疫調(diào)節(jié)作用,參與發(fā)熱和炎癥反應(yīng)等功能,具有很強(qiáng)的抗炎和抗腫瘤作用。TNF-α的水平和許多疾病的診斷、分期及預(yù)后都有很密切的關(guān)系,在體內(nèi),TNF-α起到雙刃劍的作用,一方面,若其適度表達(dá),則可以激活機(jī)體的抗感染免疫,增強(qiáng)免疫細(xì)胞吞噬和清除外界微生物的能力,還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。相反,如果TNF-α過度表達(dá),便會(huì)造成機(jī)體免疫系統(tǒng)的紊亂,導(dǎo)致機(jī)體免疫平衡的破壞,產(chǎn)生機(jī)體組織的損傷,導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[15]。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TLR9激動(dòng)劑CpG-ODN低、中劑量可能通過刺激TLR9的表達(dá),進(jìn)一步適度激活p38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路,使p38 MAPK磷酸化,分泌適量炎癥細(xì)胞因子發(fā)揮抗炎癥反應(yīng),從而減輕大腦缺血/缺氧性腦損傷,與CpG-ODN中劑量相比,高劑量組由于過度激活了p38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路,分泌大量炎癥細(xì)胞因子加重炎癥反應(yīng)的進(jìn)行。本研究從7日齡大鼠的角度證實(shí)了TLR9激動(dòng)劑CpG-ODN中劑量對(duì)損傷大腦具有明顯的保護(hù)作用,并探討了p38 MAPK信號(hào)通路在CpG-ODN干預(yù)大腦缺血/缺氧損傷中的作用,從而篩選出最佳治療劑量組,為缺血/缺氧性腦損傷治療提供了可能的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Protective effect of CpG-ODN conditioning on hypoxic/ischemic brain damage in neonatal rats

HUANG Ying1, YE Lan2, FENG Zhan-hui1,2, WANG Shi-ping1,3, FENG Zhu-ting1, JIN Yan-ling1
(1.DeptofPharmacology,BasicMedicalCollegeGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China; 2.DeptofNeurology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China; 3.TheFunctionalScienceLaboratory,BasicMedicalCollege,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China)

Aim To study the therapeutic effect of CpG-ODN, an agonist of Toll-like receptor 9 (TLR9), on hypoxic/ischemic encephapathy in neonatal rats and investigate the mechanisms. Methods Fifty healthy 7-day-old neonatal Wistar rats (in either gender, weighing 12~17g) were randomly divided into sham operation group, HIBD group, and CpG-ODN low group(0.35 mL·kg-1), CpG-ODN middle group(1.40 mL·kg-1), CpG-ODN high group(5.60 mL·kg-1). The neurological function was scored after 48h operation; ten rats of each group was executed respectively and brains tissue was taken; HE staining was used to observe the brain pathological changes. Western blot assay was used to detect the expressions of TLR9 and phosphor-p38 mitogen-activated protein kinases(p-p38 MAPK), and enzyme linked immunosorbent assay ( ELISA) method was adopted to detect TNF-α expression. Results The CpG-ODN low, middle group were improved in impairment significantly compared with the HIBD group, and the brain pathological change was lessened, while the CpG-ODN high group was impaired significantly compared with the HIBD group (P<0.05), and brain pathological change was sharpened. Western blot showed the up-regulation in TLR9 and p-p38 MAPK and a significant increase of the expression of TNF-α in the brain tissue in CpG-ODN group with statistical difference in HIBD group and sham operation group(P<0.05). Conclusions The neuro-behavioral score and nervous system function can be improved and the hypoxic/ischemic brain damage can be reduced in neonatal rats in the CpG-ODN low, middle group. The protective mechanisms may be suitably via activating p38 MAPK signaling pathway to promote p38 MAPK phosphory1ation and up-regulation of the expression of TNF-α in the brain tissue of rats.

hypoxic/ischemic brain damage; cerebral; TNF-α; TLR9; CpG-ODN; p38 mitogen activated protein kinase

2017-02-20,

2017-05-15

貴州省科技廳基金(2014-3)廳校聯(lián)合項(xiàng)目[黔科合LG字(2011)006號(hào)];貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目[黔科合平臺(tái)人才 (2016)5625]

黃 瑩(1990-),女,碩士生,研究方向:神經(jīng)藥理學(xué),E-mail:411150221@qq.com; 葉 蘭(1975-),女,副教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向:神經(jīng)藥理學(xué),通訊作者,E-mail:469612112@qq.com

時(shí)間:2017-6-7 19:04 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170607.1904.028.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.07.014

A

1001-1978(2017)07-0956-06

R-332;R322.81;R345.57;R722.12;R845.22;R977

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