楊明珠，陳依春，王曉露，張堉琪，薛曉艷，封啟龍，吳博威

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030001;2. 西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西 咸陽(yáng) 712000)

鈉-鈣交換體單克隆抗體NCX-3F10對(duì)大鼠心室肌主要離子電流的影響及對(duì)缺血/再灌注誘發(fā)心律失常的抑制作用

楊明珠1，陳依春2，王曉露1，張堉琪1，薛曉艷1，封啟龍1，吳博威1

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030001;2. 西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西 咸陽(yáng) 712000)

目的 觀察NCX-3F10抗體對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞主要離子電流的影響及其對(duì)缺血/再灌注(ischemia/reperfusion , I/R)誘發(fā)心律失常的作用。方法 ① 利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄大鼠心室肌細(xì)胞Na+/Ca2+交換電流(INa/Ca)及其他主要離子電流；② 結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈建立大鼠在體及離體心臟缺血/再灌注心律失常模型，觀察抗體對(duì)心律失常的影響；③ 利用IonOptix離子影像分析系統(tǒng)觀察抗體對(duì)單個(gè)心室肌細(xì)胞鈣瞬變的影響。結(jié)果 ① 5～40 mg·L-1的NCX-3F10抗體對(duì)INa/Ca呈劑量依賴性抑制作用，其抑制外向和內(nèi)向電流的IC50分別為11.15和11.69 mg·L-1，最大抑制率分別達(dá)到61%、62%；該抗體對(duì)鈣電流(ICa-L)也有一定的抑制作用，對(duì)內(nèi)向整流鉀電流(IK1)、瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)、鈉電流(INa)均無(wú)影響；② 在離體大鼠心臟I/R組，100%大鼠發(fā)生室速，88.89%大鼠出現(xiàn)室顫；再灌注前5 min給予NCX-3F10抗體(10 mg·L-1)干預(yù)后，大鼠的室速發(fā)生率下降至44.43%，室速、室顫持續(xù)時(shí)間明顯減少(P<0.05)；③ 麻醉大鼠再灌注前5 min給予NCX-3F10抗體(50 μg·kg-1)預(yù)處理后，大鼠室早個(gè)數(shù)、室速發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間、室顫的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間均明顯降低(P<0.05)；④ 5～40 mg·L-1的NCX-3F10抗體對(duì)心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度呈劑量依賴性抑制作用。結(jié)論 NCX-3F10抗體對(duì)大鼠離體和在體心臟缺血/再灌注誘發(fā)的心律失常有明顯抑制作用，其抗心律失常效應(yīng)與抑制鈉-鈣交換電流和L-型鈣電流、減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。

鈉-鈣交換體；單克隆抗體；全細(xì)胞膜片鉗；離子電流；心律失常；缺血/再灌注

據(jù)國(guó)家心血管病中心發(fā)布的《中國(guó)心血管病報(bào)告2015》，近年來(lái)我國(guó)心血管病(CVD)死亡率仍居疾病死亡構(gòu)成的首位，其中心力衰竭、心肌缺血、缺氧等急慢性心臟疾病并發(fā)的惡性心律失常(室性心動(dòng)過(guò)速、心室顫動(dòng)等)是心血管疾病致死的主要原因之一[1-2]。然而，目前抗心律失常藥物的臨床治療效果并不理想，且大多數(shù)藥物本身又具有致心律失常的風(fēng)險(xiǎn)，因此探尋安全有效且副作用小的新型抗心律失常藥物仍亟待解決。

研究表明，多種室性心律失常的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)異常有關(guān)。在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的諸多結(jié)構(gòu)中，鈉-鈣交換體(Sodium-calcium exchanger，NCX)就是一種關(guān)鍵的鈣調(diào)節(jié)蛋白。在生理狀態(tài)下，鈉-鈣交換體(NCX)通過(guò)正向(Na+入胞，Ca2+外排)和反向(Ca2+入胞，Na+外排)兩種轉(zhuǎn)運(yùn)模式對(duì)胞內(nèi)的Ca2+進(jìn)行快速精準(zhǔn)的調(diào)控，并廣泛參與或調(diào)節(jié)細(xì)胞電活動(dòng)、肌肉收縮、神經(jīng)和腺體分泌、細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育等多種生理活動(dòng)[3-4]。在病理狀態(tài)下，NCX與心律失常、心力衰竭等多種心臟疾病密切相關(guān)。有研究表明，在心肌缺血/再灌注損傷、心力衰竭等情況下，心肌細(xì)胞NCX表達(dá)增加、功能上調(diào)，反向模式的鈉-鈣交換活動(dòng)(即Ca2+入胞，Na+外排)增強(qiáng)，并有可能參與了心肌鈣超載及心律失常的發(fā)生[5-6]。

既然多種心臟疾病并發(fā)的心律失常與NCX活動(dòng)異常有關(guān)，那么就有可能通過(guò)對(duì)NCX的功能活動(dòng)進(jìn)行干預(yù)以抑制心律失常的發(fā)生。對(duì)NCX結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的研究證實(shí)，α肽段(包括α-1和α-2)是NCX發(fā)揮作用的關(guān)鍵肽段[7-9]，因此，本研究選取鈉-鈣交換體分子中起關(guān)鍵作用的α-2肽段為抗原制備獲得NCX單克隆抗體，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察了該抗體對(duì)成年大鼠心室肌細(xì)胞Na+/Ca2+交換電流(INa/Ca)及其他主要離子電流的作用，并進(jìn)一步研究了該抗體對(duì)缺血/再灌注性心律失常的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(220～230)g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCK-(軍)2014-0013。自由進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)環(huán)境室溫控制在(25±2)℃，每天光照12～14 h。

1.2 藥品與試劑 5′-三磷酸腺苷二鈉(Na2-ATP)、三磷酸腺苷鎂鹽(Mg-ATP)、4-氨基吡啶(4-AP)、5′-三磷酸腺苷二鉀(K2-ATP)、牛磺酸(Taurine)、HEPES、L-谷氨酸(L-Glutamic)、氫氧化銫(CsOH)、氯化鋇(BaCl2)、氯化四乙胺(TEA-Cl)、氯化銫(CsCl)、乙二胺四乙酸(EGTA)、哇巴因(Ouabain)、尼非地平(Nifedipine)、磷酸肌酸二鈉鹽(Na2-phosphocreatine)、二甲基亞砜(DMSO)、Fura-2AM均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；NaCl、KCl、NaH2PO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、KCl、MgCl2均購(gòu)自Sangon Biotech公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。能穩(wěn)定分泌NCX-3F10抗體的細(xì)胞株由NCX α-2第840～877位氨基酸殘基肽段免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合而成，由美國(guó)Invitrogen公司完成；NCX-3F10抗體的純化由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司完成。

1.3 主要儀器與設(shè)備 膜片鉗放大器(Axopatch200B)和數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Digidate1440A)(美國(guó)Axon Instruments公司)；Langendorff心臟灌流系統(tǒng)(澳大利亞AD Instruments公司);BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);BPS-4灌流裝置(美國(guó)Ala Scientific Instruments Inc公司)。

1.4 主要溶液配制

1.4.1 臺(tái)氏液(mmol·L-1) NaH2PO40.33，NaCl 140，KCl 5.4，MgCl21.0，glucose 10.0，HEPES 5.0，CaCl21.8，使用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.38。

1.4.2 KB液(mmol·L-1) HEPES 10.0，KCl 40.0，Taurine 20.0，KH2PO425.0，EGTA 1.0，glucose 10.0，MgSO43.0，L-谷氨酸50.0，使用KOH調(diào)節(jié)pH至7.38。

1.4.3 Na+/Ca2+交換電流(INa/Ca)電極內(nèi)液(mmol·L-1) 4-AP 20.0，HEPES 5.0，磷酸肌酸鈉鹽5.0，MgCl213.0，天門冬氨酸鉀42.0，K2-ATP 10.0，EGTA 42.0，CaCl229.0，使用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.30。細(xì)胞外液(mmol·L-1)：BaCl21.0，glucose 10.0，CaCl21.8，NaCl 140.0，MgCl22.0，HEPES 5.0，CsCl 2.0，使用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.38。分別加入尼非地平1.0 μmol·L-1，哇巴因20 μmol·L-1，BaCl21.0 mmol·L-1，CsCl 2.0 mmol·L-1分別阻斷L-型鈣通道、鈉-鉀泵和鉀通道。

1.4.4 L-型鈣電流(ICa-L)電極內(nèi)液(mmol·L-1) MgCl21.0，EGTA 1.0，Na2-ATP 4.0，CsCl 130.0，TEA-Cl 10.0，HEPES 20.0，CaCl20.4，使用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.20。細(xì)胞外液為臺(tái)氏液。

1.4.5 內(nèi)向整流鉀電流(IK1)電極內(nèi)液(mmol·L-1) K2-ATP 3.0，KCl 150.0，EGTA 5.0，MgCl21.0，4-AP 5.0，HEPES 5.0，Mg-ATP 1.0，使用KOH調(diào)節(jié)pH至7.30。細(xì)胞外液為加入0.5 mmol·L-1CdCl2的臺(tái)氏液，以阻斷L-型鈣通道。

1.4.6 瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)電極內(nèi)液(mmol·L-1) KCl 150.0，MgCl21.0，EGTA 5.0，ATP-K23.0，HEPES 5.0，使用KOH調(diào)節(jié)pH至7.30。細(xì)胞外液為加入0.2 mmol·L-1BaCl2，0.1 mmol·L-1CdCl2的臺(tái)氏液，以分別阻斷L-型鈣通道及內(nèi)向整流鉀通道。

1.4.7 鈉電流(INa)電極內(nèi)液(mmol·L-1) EGTA 11.0，KCl 130.0，Na2ATP 5.0，HEPES 10.0，MgCl22.0，CaCl21.0，4-AP 5.0，使用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.20。細(xì)胞外液(mmol·L-1)：NaCl 60.0，MgCl22.5，glucose 10.0，4-AP 5.0，HEPES 5.0，蔗糖80.0，CsCl 5.0，CdCl20.1，使用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.40。

1.5 全細(xì)胞膜片鉗記錄

1.5.1 大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞急性分離 取健康SD大鼠，斷頭頸動(dòng)脈放血后，快速開胸取心臟，修剪后經(jīng)主動(dòng)脈逆行插管懸掛于Langendorff灌流裝置上，以100%氧氣充灌的無(wú)鈣臺(tái)氏液恒壓(75 cm H2O)、恒溫(37℃)灌流心臟8 min后改為酶液(含膠原酶P 0.07～0.1 g·L-1)循環(huán)灌流15～20 min，待心臟變大、變軟后剪取心室肌組織置于KB液中剪碎，輕輕吹打5 min，過(guò)濾得到單個(gè)細(xì)胞，KB液中保存，室溫下靜置3 h。

1.5.2 電壓鉗模式記錄大鼠單個(gè)心肌細(xì)胞INa/Ca、ICa-L、IK1、Ito、INaINa/Ca記錄：運(yùn)用斜坡電壓刺激程序記錄INa/Ca。全細(xì)胞記錄狀態(tài)下，以鉗制電位-40 mV，給予從+60 mV～-120 mV的斜坡電壓刺激(90 mV·s-1)，用5.0 mmol·L-1的NiCl2特異性阻斷Na+/Ca2+交換電流，NiCl2阻斷前后的電流差即為Ni2+敏感Na+/Ca2+交換電流。

ICa-L記錄：記錄L-型鈣電流(ICa-L)的電極內(nèi)液用CsCl取代KCl，TEA-Cl取代NaCl分別排除鉀、鈉電流的干擾。鉗制在-40 mV以失活T-型鈣通道和鈉通道。給予細(xì)胞0.2 Hz、500 ms、躍階10 mV從-40 mV～+60 mV的去極化脈沖刺激激活L-型鈣電流，即可產(chǎn)生一組內(nèi)向電流。利用鈣通道阻斷劑維拉帕米(0.1 mmol·L-1)可完全阻斷L-型鈣電流的特性，證明記錄到的是ICa-L。為了防止L-型鈣電流“rundown(衰減)”現(xiàn)象的發(fā)生，在全細(xì)胞記錄模式形成5～20 min內(nèi)記錄。膜電流大小使用電流密度表示，即單細(xì)胞電流值(pA)/細(xì)胞膜電容值(Cm)，pA/pF。

IK1記錄：記錄內(nèi)向整流鉀電流(IK1)的細(xì)胞外液為加入0.5 mmol·L-1CdCl2(用以阻斷ICa-L)的臺(tái)氏液。鉗制電位-40 mV，給予細(xì)胞0.5 Hz、500 ms、躍階10 mV從-120 mV～+20 mV的去極化脈沖刺激激活I(lǐng)K1。膜電流大小使用電流密度表示，即單細(xì)胞電流值(pA)/細(xì)胞膜電容值(Cm)，pA/pF。

Ito記錄：測(cè)定瞬時(shí)外向鉀電流時(shí)，維持電壓-40 mV，給予階躍脈沖至+50 mV，持續(xù)1 000 ms激活I(lǐng)to。膜電流大小使用電流密度表示，即單細(xì)胞電流值(pA)/細(xì)胞膜電容值(Cm)，pA/pF。

INa記錄：測(cè)定鈉電流時(shí)，維持電位-80 mV，給予去極化至-10 mV，以持續(xù)50 ms的躍階脈沖激活I(lǐng)Na。膜電流大小使用電流密度表示，即單細(xì)胞電流值(pA)/細(xì)胞膜電容值(Cm)，pA/pF。

1.6 大鼠缺血/再灌注心律失常的記錄

1.6.1 大鼠離體心臟缺血/再灌注心律失常的記錄 取SD大鼠，用40 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，開胸離體心臟后，懸掛于Langendorff裝置上主動(dòng)脈逆行灌流，記錄心電圖，待心臟穩(wěn)定后，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)，造成局部缺血30 min，松扎后再灌注30 min。統(tǒng)計(jì)再灌注后30 min內(nèi)期前收縮個(gè)數(shù)、室速的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間、室顫的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)分組如下：① 假手術(shù)組(sham)：臺(tái)氏液持續(xù)灌流，LAD下只穿線不結(jié)扎；② I/R組：臺(tái)氏液持續(xù)灌流，結(jié)扎LAD 30 min后，松扎再灌注30 min；③ NCX-3F10抗體+再灌注組：臺(tái)氏液持續(xù)灌流，結(jié)扎LAD 30 min，再灌注前5 min用含10 mg·L-1NCX-3F10抗體的臺(tái)氏液灌流。

1.6.2 大鼠在體心臟缺血/再灌注心律失常的記錄 取SD大鼠用水合氯醛(30 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于鼠板上，BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖，除去頸部、胸部皮毛，做氣管插管，沿3～4肋做縱向切口分離皮膚、肌層，暴露心臟，打開心包膜，輕掀左心耳，于左心耳根部下方肺動(dòng)脈圓錐旁以無(wú)創(chuàng)縫合線穿過(guò)冠狀動(dòng)脈左前降支，取雙線頭共同套過(guò)一約0.6 cm長(zhǎng)塑料管，沿雙線向下壓塑料管至心臟表面，以蚊式止血鉗固定，阻斷血流，心電圖顯示ST段抬高(≥0.15 mV)為缺血結(jié)扎成功，放松蚊式止血鉗使冠脈血流再通為再灌注。結(jié)扎冠脈左前降支，局部缺血15 min，松扎后再灌注15 min，給藥時(shí)間為再灌注前5 min由尾靜脈注射。觀察再灌注15 min內(nèi)室性心律失常的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間、室性期前收縮(VPB)個(gè)數(shù)。實(shí)驗(yàn)分組如下：① 假手術(shù)組(sham)：LAD只穿線，其他操作同模型組，尾靜脈注射1 mL生理鹽水(NS)；② I/R組：結(jié)扎LAD 15 min，松扎再灌注15 min；③ NCX-3F10抗體+再灌注組：再灌注前5 min尾靜脈注射NCX-3F10抗體50 μg·kg-1；④ 利多卡因(lidocaine)+再灌注組：再灌注前5 min尾靜脈注射Lidocaine 7.5 mg·kg-1。

1.7 大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞鈣瞬變測(cè)定 取1 mL酶解好的大鼠心室肌細(xì)胞懸液于試管中，加入5 μmol·L-1熒光染料Fura2-AM，室溫下避光孵育30 min；孵育完畢后棄上清，加入臺(tái)氏液混勻后靜置8～10 min，棄上清，重復(fù)清洗3次。將負(fù)載有熒光染料的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用吸管吸取1～2滴細(xì)胞懸液滴入倒置顯微鏡的細(xì)胞槽內(nèi)貼壁10 min后，用臺(tái)氏液持續(xù)灌流10 min，速度為1～2 ml·min-1；用10 V電壓以0.5 Hz的頻率給予場(chǎng)刺激觸發(fā)細(xì)胞收縮，在高倍鏡下選取長(zhǎng)桿狀、紋理清晰、表面光滑，隨刺激穩(wěn)定收縮的心室肌細(xì)胞作為觀察對(duì)象。用IonOptix離子影像分析系統(tǒng)同步記錄測(cè)量單個(gè)心室肌細(xì)胞鈣瞬變。待細(xì)胞收縮穩(wěn)定后可以開始給藥干預(yù)。鈣瞬變用F340/F380比值的變化幅度ΔCa表示。

2 結(jié)果

2.1 NCX-3F10抗體對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞離子電流的影響

2.1.1 NCX-3F10抗體對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa/Ca的影響

2.1.1.1 正常成年大鼠心室肌細(xì)胞INa/CaINa/Ca的測(cè)定是在電壓鉗模式下，以鉗制電位-40 mV，給予從+60 mV～-120 mV的斜坡電壓刺激(90 mV·s-1)，用5.0 mmol·L-1的NiCl2特異性地阻斷鈉-鈣交換電流，NiCl2阻斷前后的電流差即為Ni2+敏感鈉-鈣交換電流(Fig 1)。

2.1.1.2 NCX-3F10抗體對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa/Ca的影響 研究結(jié)果顯示，5～40 mg·L-1濃度范圍內(nèi)NCX-3F10抗體對(duì)INa/Ca呈現(xiàn)出劑量依賴性抑制作用(n=8，P<0.05)。在鉗制電位為+50 mV和-100 mV時(shí)，NCX-3F10抗體抑制外向和內(nèi)向鈉-鈣交換電流的IC50分別為11.15和11.69 mg·L-1，最大抑制率分別達(dá)到61%，62%(Tab 1，F(xiàn)ig 2)。

Tab 1 Inhibitory effect of NCX-3F10 antibody on Na+/Ca2+exchange current in ventricular myocytes of rats(n=8)

Membrane current density is expressed as membrane current(pA) per cell capacitance(pF).*P<0.05vscontrol

Fig 1 Measurement of Ni2+ sensitive Na+-Ca2+exchange current(INa/Ca) in rat ventricular myocytes

A:current-voltage relationship before(a) and after(b) application of 5.0 mmol·L-1NiCl2;B:Ni2+-sensitiveINa/Caa-b

2.1.2 NCX-3F10抗體對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞ICa-L的影響 在電壓鉗模式下測(cè)定ICa-L，ICa-L峰值電壓均在10 mV。在5～40 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，隨著NCX-3F10抗體濃度增大，ICa-L密度由-4.22±0.18減小到-3.03±0.15，經(jīng)臺(tái)氏液灌流洗脫后，電流密度部分恢復(fù)(Tab 2，F(xiàn)ig 3)。

2.1.3 NCX-3F10抗體對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞IK1、Ito及INa的影響 NCX-3F10抗體干預(yù)后結(jié)果顯示：在5～40 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，NCX-3F10抗體對(duì)IK1、Ito、INa均無(wú)明顯影響。

Fig 2 Inhibitory effect of NCX-3F10 antibody on Na+/Ca2+exchange current in ventricular myocytes of rats

A:Current-voltage relationship before(a, control) and after application of 40 mg·L-1antibody against NCX-3F10(b), respectively. Trace c, after application of 5.0 mmol·L-1NiCl2;B:Ni2+-sensitiveINa/Cabefore(a-c) and after(b-c) application of NCX-3F10 antibody at 40 mg·L-1, respectively

Tab 2 Inhibitory effect of NCX-3F10 antibody on L-type calcium current in ventricular myocytes of rats(n=8)

Membrane current density is expressed as membrane current(pA) per cell capacitance(pF).*P<0.05vscontrol

2.2 NCX-3F10抗體對(duì)離體及在體大鼠心臟缺血/再灌注誘發(fā)心律失常的影響

2.2.1 NCX-3F10抗體對(duì)離體大鼠心臟缺血/再灌注性心律失常的影響 研究結(jié)果顯示，10 mg·L-1的NCX-3F10抗體即可明顯抑制大鼠離體心臟缺血/再灌注性心律失常的發(fā)生。在I/R組，100%大鼠發(fā)生室速，88.89%大鼠出現(xiàn)室顫，在再灌注前5 min給予NCX-3F10抗體干預(yù)后，大鼠的期前收縮個(gè)數(shù)、室速室顫發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間均明顯降低(P<0.05)(Tab 3，F(xiàn)ig 4)。

Tab 3 Effects of NCX-3F10 antibody on ischemia-reperfusion induced arrhythmias in (ex vivo )rat hearts(n=9)

VPB:ventricular premature beats;VT:ventricular tachycardia;VF:ventricular fibrillation. 3F10:NCX-3F10.*P<0.05vssham;#P<0.05vsreperfusion

Tab 4 Effects of NCX-3F10 antibody on ischemia-reperfusion induced rat arrhythmias in vivo(n=6)

VPB:ventricular premature beats;VT:ventricular tachycardia;VF:ventricular fibrillation.3F10:NCX-3F10.*P<0.05vssham;#P<0.05vsreperfusion;ΔP<0.05vslidocaine

Fig 3 Inhibitory effect of NCX-3F10 antibody on L-type calcium current in ventricular myocytes of rats

2.2.2 NCX-3F10抗體對(duì)大鼠在體心臟缺血/再灌注性心律失常的影響 結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠偶見(jiàn)室性早搏，并未見(jiàn)其他類型的心律失常發(fā)生。I/R組大鼠100%發(fā)生室性心律失常，以頻發(fā)的室早、室速、室顫為主，并伴隨有ST段的明顯抬高，與對(duì)照組相比有明顯差異，再灌注前5 min給予50 μg·kg-1的NCX-3F10抗體預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)再灌注期室早的個(gè)數(shù)、室速的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間、室顫的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間均明顯降低(P<0.05)(Tab 4)。

2.3 NCX-3F10抗體對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞鈣瞬變的影響 在5～40 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，隨著NCX-3F10抗體濃度增大，鈣瞬變幅度(ΔCa)由0.42±0.13減小到0.27±0.11(P<0.05)(Tab 5，F(xiàn)ig 5)。

3 討論

本研究首次選取NCX α-2(840-877)肽段作為抗原制備獲得NCX-3F10單克隆抗體，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄觀測(cè)了該抗體對(duì)INa/Ca、ICa-L、IK1、Ito和INa的作用，并進(jìn)一步觀察了該抗體對(duì)大鼠離體和在體缺血/再灌注性心律失常的影響及其對(duì)單個(gè)心室肌細(xì)胞鈣瞬變的作用。結(jié)果表明，NCX-3F10抗體對(duì)心肌鈉-鈣交換電流和鈣瞬變幅度呈劑量依賴性抑制作用，對(duì)鈣電流也有一定的抑制作用，對(duì)其他離子電流均無(wú)影響。此外，該抗體對(duì)大鼠缺血/再灌注性心律失常具有明顯的抑制作用。

Fig 4 Effects of NCX-3F10 antibody on ischemia-reperfusion induced arrhythmias in ex vivo rat hearts

A:Representative ECG traces in rats of different groups;B:a: Normal ECG trace;b:Premature ventricular contraction bigeminies;c:Ventricular tachycardia(VT); d: Premature ventricular contraction trigrminies; e: Ventricular fibrillation(VF); f: Recovered ECG trace

Fig 5 Effect of NCX-3F10 antibody on calcium transients in rat ventricular myocytes3F10: NCX-3F10(40 mg·L-1)

Tab 5 Effect of NCX-3F10 antibody on calcium transients in rat ventricular myocytes(n=7)

ΔCa:amplitude of calcium transient.*P<0.05vscontrol

缺血性心臟病是臨床常見(jiàn)疾病，在缺血早期最有效的治療措施是使堵塞的冠脈血管再通，但恢復(fù)血流灌注后常會(huì)出現(xiàn)心肌頓抑、代謝障礙等一系列改變，其中以室性心律失常(室性期前收縮、室性心動(dòng)過(guò)速、心室顫動(dòng)等)最為嚴(yán)重。大量研究表明，缺血/再灌注損傷的發(fā)生與鈣超載、氧自由基增多、心肌纖維能量代謝障礙、炎癥反應(yīng)、酸中毒等機(jī)制相關(guān)[10-13]，其中各種原因?qū)е碌拟}超載是引發(fā)心律失常的重要機(jī)制。NCX作為維持心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的重要結(jié)構(gòu)，與心肌細(xì)胞鈣超載密切相關(guān)[14]。本研究離體和在體實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，NCX-3F10抗體對(duì)大鼠缺血/再灌注性心律失常具有明顯的抑制作用。結(jié)合膜片鉗和細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)，NCX-3F10抗體的抗心律失常效應(yīng)與其抑制NCX和L-型鈣通道，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，NCX-3F10單克隆抗體對(duì)ICa-L也表現(xiàn)出一定程度的抑制作用。為闡明這一現(xiàn)象，我們利用DNAstar軟件對(duì)NCX α-2(840～877)肽段氨基酸序列和L-型鈣通道α-1C亞基的氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì)。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，NCX α-2(840～877)肽段與構(gòu)成L-型鈣通道第三結(jié)構(gòu)域孔環(huán)的第1 411～1 485氨基酸序列具有20%的相似性(Fig 6)。我們推測(cè)，二者之間的序列相似性，可能是NCX-3F10抗體對(duì)L-型鈣通道產(chǎn)生交叉反應(yīng)的基礎(chǔ)。

按照NCX的9次跨膜二級(jí)結(jié)構(gòu)模型[15]，位于NCX分子第7～8跨膜段之間的α-2肽段主要在胞內(nèi)側(cè)。那么，本研究NCX-3F10抗體是如何從胞外側(cè)發(fā)揮作用的？近年來(lái)基于NCX晶體結(jié)構(gòu)的研究，有人提出了NCX 10次跨膜的新結(jié)構(gòu)模型[16-17]。與以往相比，二者主要區(qū)別在于第7跨膜段之后肽鏈的空間排列，根據(jù)新的NCX結(jié)構(gòu)模型，α-2序列則可能暴露于細(xì)胞外側(cè)。我們推測(cè)，本研究所用NCX抗體可能通過(guò)與α-2上暴露于膜外側(cè)的某些氨基酸位點(diǎn)結(jié)合而產(chǎn)生效應(yīng)。有關(guān)抗體與α-2結(jié)合的確切氨基酸位點(diǎn)，將是我們今后進(jìn)一步研究的課題。

Fig 6 Amino acid alignments of α-2 of Na+/Ca2+exchanger(upper) and pore region of L-type Ca2+ channel(lower)

Residues identical between two segments are in bold and indicated with asterisks

綜上，本研究證實(shí)，NCX-3F10抗體可明顯抑制缺血/再灌注性心律失常的發(fā)生，我們推測(cè)，其抗心律失常機(jī)制與該抗體抑制NCX和L-型鈣通道、減輕胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。

(致謝：本研究在山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系、細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室提供的儀器及技術(shù)支持；感謝趙錄英老師在實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面給予的指導(dǎo)。)

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Investigation of effects of monoclonal antibody NCX-3F10 against Na+/Ca2+exchanger on rat cardiac ionic currents and its suppression on ischemia-reperfusion induced cardiac arrhythmias

YANG Ming-zhu1,CHEN Yi-chun2,Wang Xiao-lu1,ZHANG Yu-qi1,XUE Xiao-yan1,FENG Qi-long1,WU Bo-wei1
(1.DeptofPhysiology,ShanxiMedicalUniversity,KeyLaboratoryofCellularPhysiologyofShanxiProvinceandMinistryofEducation,Taiyuan030001,China; 2.DeptofMedicine,TibetNationalitiesUniversity,XianyangShanxi712000,China)

Aim To observe the effect of antibody NCX-3F10 on the main ion current of rat ventricular myocytes and its effect on arrhythmias induced by ischemia/reperfusion(I/R).Methods ① The whole-cell patch clamp technique was employed to record the Na+/Ca2+exchange current(INa/Ca) and other major ion currents in rat ventricular myocytes.② The rat models of arrhythmia induced by ischemia/reperfusion were established by ligating the left coronary artery toinvivoandinvitro.Then the effects of antibody on the arrhythmia were observed.③ The IonOptix ion imaging system was used to observe the effect of antibody on calcium transients in single ventricular myocytes.Results ① The antibody NCX-3F10 dose-dependently inhibitedINa/Cafrom 5 to 40 mg·L-1. The IC50for outward and inward currents was 11.15 and 11.69 mg·L-1, and the maximum inhibitory rates were 61% and 62%, respectively. The antibody also had an inhibitory effect on calcium current(ICa-L), and had no significant effect on inward rectifier potassium current(IK1), transient outward potassium current(Ito) and sodium current(INa). ② In the isolated rat heart group I/R, 100% rats showed ventricular tachycardia, and 88.89% rats had ventricular fibrillation. After administration of antibody NCX-3F10(10 mg·L-1) 5 min before reperfusion, the incidence of ventricular tachycardia decreased to 44.43%(P<0.05), and the duration of ventricular tachycardia and ventricular fibrillation was also shortened remarkably(P<0.05). ③ In the anesthetized rats after administration of antibody NCX-3F10(50 μg·kg-1) 5 min before reperfusion, the incidence and duration of ventricular tachycardia,the incidence and duration of ventricular fibrillation, and total number of ventricular premature beats were significantly decreased(P<0.05).④ From 5 to 40 mg·L-1, NCX-3F10 antibody decreased calcium transient amplitude in rat single ventricular myocytes dose-dependently(P<0.05).Conclusions The NCX-3F10 antibody shows significant arrhythmic effects on ischemia-reperfusion induced arrhythmia in rats bothinvitroandinvivo, the underlying mechanism of which is related to NCX and L-type calcium current inhibition and calcium overload reduction by the NCX antibody.

Na+-Ca2+exchanger; monoclonal antibody; whole-cell patch clamp technique; ion current; cardiac arrhythmia; ischemia-reperfusion

2017-02-22,

2017-03-20

山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目(No 2015012003-08)；山西省高等學(xué)校優(yōu)秀青年學(xué)術(shù)帶頭人支持項(xiàng)目；高校“131”領(lǐng)軍人才工程優(yōu)秀中青年拔尖創(chuàng)新人才

楊明珠(1990-)，女，碩士生，研究方向：心肌電生理，E-mail: 15386745259@163.com; 封啟龍(1976-)，男，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心肌電生理，通訊作者，Tel:0351-4135768, E-mail: fengqilong@163.com

時(shí)間：2017-6-7 19:04 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170607.1904.020.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.07.010

A

1001-1978(2017)07-0934-08

R-332；R322.11；R331.38；R392.11 ；R541.7