陳育林，咸 婧，肖 翠，鐘月玲，蘇小妹，徐 麗，羅巧麗，程 朋，王 濤，劉 進，張 濤，陽 泰，鄒 強，李 華

(1.西南交通大學生命科學與工程學院，四川 成都 610031；2.成都醫(yī)學院科研實驗中心，四川 成都 610500；3.成都軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤診治中心腫瘤科，四川 成都 610083；4.川北醫(yī)學院臨床醫(yī)學系，四川 南充 637000)

雪膽素甲誘導非小細胞肺癌系NCI-H460和A549的凋亡效應及其作用機制初探

陳育林1，咸 婧3，肖 翠2，鐘月玲2，蘇小妹3，徐 麗4，羅巧麗3，程 朋3，王 濤3，劉 進2，張 濤3，陽 泰2，鄒 強2，李 華3

(1.西南交通大學生命科學與工程學院，四川 成都 610031；2.成都醫(yī)學院科研實驗中心，四川 成都 610500；3.成都軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤診治中心腫瘤科，四川 成都 610083；4.川北醫(yī)學院臨床醫(yī)學系，四川 南充 637000)

目的 雪膽素甲(CuⅡa)誘導肺癌NCI-H460和A549的凋亡效應及其作用機制初探。方法 利用CCK-8檢測CuⅡa對腫瘤細胞抑制活性；流式細胞術檢測CuⅡa對腫瘤細胞凋亡以及周期的影響；Western blot檢測CuⅡa對Aurora A、STAT3以及Cofilin蛋白磷酸化的影響。結果 CuⅡa對肺癌細胞NCI-H460和A549具有明顯抑制作用，其IC50分別為224.9和108.3 nmol·L-1；CuⅡa能誘導腫瘤細胞凋亡，并阻滯細胞周期于G2/M期；Western blot實驗結果顯示CuⅡa對STAT3和Cofilin的磷酸化具有抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性，CuⅡa能抑制Aurora A磷酸化，符合Aurora A激酶抑制劑抗腫瘤效應重要特征—阻滯細胞于G2/M期。結論 CuⅡa對非小細胞肺癌細胞系NCI-H460和A549具有明顯的抑制作用，CuⅡa可作為抗非小細胞肺癌的先導化合物進行下一步研究。

雪膽素甲；非小細胞肺癌；凋亡；Aurora A；Cofilin；STAT3

雪膽素甲(cucurbitacin Ⅱa，CuⅡa) 是葫蘆科雪膽屬所提取的一種四環(huán)三萜類天然化合物，是雪膽屬植物的主要活性成分。其化學名稱為 23，24-雙氫葫蘆素 F-25-乙酸酯(23，24-dihydroxycucurbitacin F-25-acetate)。近年來，CuⅡa抗腫瘤活性相繼報道。例如：CuⅡa能明顯抑制人前列腺癌細胞系PC3以及CWR22Rv1增殖，其主要機制可能是通過誘導肌動蛋白聚集，破壞微絲骨架，阻滯細胞周期的進程于G2/M期[1,2]。CuⅡa對人肺癌細胞株A549也有抑制作用，可阻滯細胞周期于G2/M期[3]，其作用機制值得深入研究。本研究擬通過人肺癌細胞株A549以及人大細胞肺腺癌細胞株NCI-H460為人肺腺癌細胞模型，探討CuⅡa的作用機制，為進一步豐富CuⅡa抗腫瘤效應及其作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 CuⅡa(純度>99%)購自成都曼思特生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)、RIP細胞裂解液、PVDF膜和ECL化學發(fā)光試劑購自Millipore公司；培養(yǎng)基高糖DMEM及雙抗(青霉素和硫酸鏈霉素)購自Hyclone；CCK-8試劑盒購自日本DoJindo公司；細胞凋亡試劑盒Annexin V-PE/7-ADD購自BD公司；細胞周期試劑盒PI染色購自碧云天公司；兔抗人p-STAT3(Tyr705)、STAT3、Cleaved-PARP、p-Cofilin(Ser3)以及Cofilin購自Cell Signaling公司；兔抗人p-Aurora A(Phospho T288)，Aurora A購自Abcam公司；兔抗人GAPDH購自杭州華安生物公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自CST公司； CuⅡa用DMSO溶解，濃度為20 mmol·L-1，凍存于-20℃，使用時用培養(yǎng)基DMEM稀釋。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) DMEM培養(yǎng)基含雙抗(100 U·L-1青霉素和100 μg·L-1硫酸鏈霉素)和10% FBS，細胞培養(yǎng)于37℃ CO2培養(yǎng)箱，CO2濃度為5%。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 細胞活性實驗 取對數(shù)生長期細胞接種96孔板，細胞密度為5 000個細胞/孔。細胞培養(yǎng)12 h，貼壁后加入不同濃度CuⅡa(32～50 000 nmol·L-1)。藥物作用48 h后加入CCK-8，作用4h，使用酶標儀測定450 nm波長光吸收值。藥物對腫瘤細胞生長抑制率按照美國國家癌癥研究所標準計算：當Ti大于Tz時，腫瘤細胞存活率/%=[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100；當Ti小于Tz時，腫瘤細胞存活率/%=[(Ti-Tz)/Tz]×100(Ti為藥物組培養(yǎng)48 h后，測定的OD值；Tz為不含藥物組起始培養(yǎng)測定的OD值；C為不含藥物組培養(yǎng)48 h后測定的OD值)。

1.2.3 克隆形成實驗 取對數(shù)生長期細胞接種6孔板，細胞密度為200個細胞/孔，細胞培養(yǎng)12 h，貼壁后加入不同濃度CuⅡa。藥物作用細胞24 h后，換新鮮含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2～3 d換1次培養(yǎng)基。培養(yǎng)14 d，用甲醇固定10 min，用結晶紫進行染色10 min，計算克隆群落。

1.2.4 細胞凋亡實驗 取對數(shù)生長期細胞接種于24孔板，細胞密度為5×104個細胞/孔，細胞培養(yǎng)12 h貼壁后，加入不同濃度CuⅡa(400～1 600 nmol·L-1)。藥物作用12 h，收集細胞，按照凋亡試劑盒Annexin V-PE/7-ADD(BD公司)說明書進行操作，避光染色30 min，用BD公司Accuri C6流式細胞儀進行檢測。

1.2.5 細胞周期實驗 取對數(shù)生長期細胞鋪板于6孔板中，細胞密度為5×105個細胞/孔，細胞培養(yǎng)12 h貼壁后，加入不同濃度CuⅡa(400～1 600 nmol·L-1)。藥物作用48 h，收集細胞。按照周期試劑盒PI染色(碧云天)說明書進行操作，37℃避光染色30 min，用BD公司Accuri C6流式細胞儀進行檢測。

1.2.6 Western blot實驗 取對數(shù)生長期細胞至培養(yǎng)皿中，細胞密度為5×105個細胞/孔，細胞培養(yǎng)12 h貼壁后，加入不同濃度CuⅡa(400～3 200 nmol·L-1)。藥物作用12 h，收集蛋白樣品，采用BCA法測定蛋白濃度，蛋白(80～100 )μg上樣，進行SDS-PAGE電泳后，在恒流(250～350 mA)條件下電轉60 min，用5%的脫脂奶粉進行封閉(1～2 h)，4℃搖床過夜孵育一抗，用TBST清洗3次，每次5～10 min，用辣根過氧化物酶供價的二抗37℃孵育2 h，TBST洗膜3～5次，每次5～10 min，加入化學發(fā)光液，凝膠圖像處理系統(tǒng)觀察并分析結果。

2 結果

Fig 1 Effect of CuⅡa on NCI-H460 and A549cell proliferation and clone formation

A: Cell counting Kit-8 assay of non-small cell lung cancer lines treated with different dose of CuⅡa; B: Clone formation rate of NCI-H460 and A549 cell treated or untreated with CuⅡa at 200 nmol·L-1concentration

2.1 CuⅡa對NCI-H460和A549腫瘤細胞增殖的影響 CCK-8結果表明：CuⅡa處理NCI-H460和A549細胞48 h后，兩種細胞株的增殖均受到明顯抑制，且呈現(xiàn)劑量依賴性關系(Fig 1A)。CuⅡa對肺癌細胞系NCI-H460和A549的IC50分別為：108.3、224.9 nmol·L-1。用100、200 nmol·L-1分別處理NCI-H460和A549細胞24 h(Fig 1B)，克隆形成率分別為(10.1±2.5)%和(6.7±2.4)%，與空白組對照差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明CuⅡa能明顯抑制NCI-H460和A549腫瘤細胞增殖。

2.2 CuⅡa誘導肺癌細胞NCI-H460和A549凋亡 不同濃度CuⅡa作用NCI-H460和A549肺癌細胞株12 h后， Annexin V-PE/7-ADD雙染標記，經(jīng)細胞流式儀檢測。隨著CuⅡa濃度的增加，細胞凋亡比例明顯增加，NCI-H460的凋亡比例由4.3%增長到30.3%，而A549的凋亡比例由2.4%增加到24.6%(Fig 2A)。Western blot檢測CuⅡa檢測相關蛋白，隨著CuⅡa濃度的增加，凋亡活化標志片段Cleaved-PARP的表達量明顯增加(Fig 2B)，說明CuⅡa能誘導肺癌細胞系NCI-H460和A549凋亡。

2.3 CuⅡa阻滯細胞周期于G2/M期并抑制Aurora A磷酸化 肺癌細胞NCI-H460和A549經(jīng)不同濃度CuⅡa處理后檢測其對細胞周期的影響。隨著CuⅡa作用濃度增加，G2/M期細胞比例不斷增加，NCI-H460細胞G2/M期比例由22.2%增加到45.3%，而A549細胞G2/M期比例由26.5%增加到51.2%(Fig 3A)。Western blot結果顯示CuⅡa抑制AuroraA磷酸化(Fig 3B)，且呈現(xiàn)劑量依賴性，s2770作為陽性對照。

2.4 CuⅡa抑制STAT3及Cofilin磷酸化 Western blot結果表明(Fig 4)，CuⅡa能抑制STAT3(Fig 4A)和Cofilin(Fig 4B)磷酸化，而STAT3和Cofilin的表達量并無明顯變化。隨著CuⅡa濃度增大，其抑制STAT3和Cofilin蛋白磷酸化越明顯，呈現(xiàn)出劑量依賴性，Ruxolitinib作為STAT3抑制劑對照。

3 討論

本實驗以CuⅡa為研究對象，探究CuⅡa對人肺癌細胞株A549和NCI-H460增殖的影響及其作用機制。結果顯示CuⅡa能明顯抑制肺癌細胞系NCI-H460和A549增殖，且呈現(xiàn)劑量依賴性。一方面，CuⅡa誘導凋亡活化標志片段Cleaved-PARP的表達，促進細胞凋亡，另一方面抑制Aurora A、STAT3以及Cofilin磷酸化，使細胞滯留于G2/M期。

已知蛋白激酶信號通路介導多種重要細胞生理反應，是人體一系列疾病重要發(fā)生機制[4]。STAT3作為轉錄因子的重要成員之一，廣泛表達于多種組織和各類細胞[5]，可被JAK激酶激活發(fā)生酪氨酸磷酸化，廣泛參與了腫瘤細胞增殖，并且對非小細胞肺癌的化療耐受起到了關鍵作用，阻斷JAK/STAT3通路是抑制腫瘤細胞增殖的重要策略[6]。Zheng等[7]通過加入選擇性JSI-124抑制JAK/STAT3信號通路，抑制了肺癌細胞系A549的增殖并誘導凋亡。Jiang等[8]采用青藤堿，可抑制STAT3磷酸化進而抑制肺癌細胞侵襲。本研究在小分子單體CuⅡa抑制肺癌細胞NCI-H460和A549的結果基礎上，進一步發(fā)現(xiàn)CuⅡa能夠抑制STAT3的磷酸化，這可能是CuⅡa抑制肺癌細胞增殖的重要機制之一。

Fig 2 Apoptosis of lung cancer cell lines NCI-H460 and A549 treated with CuⅡa and the expression of Cleaved-PARP

A:Flow cytometric analysis of cell lines apoptosis induced by different dose of CuⅡa; B: The expression of cleaved-PARP in the NCI-H460 and A549 cells treated with different dose of CuⅡa was determined by Western blot

Fig 3 CuⅡa treatment caused G2/M phase cell cycle arrest and inhibit Aurora phosphorylation in NCI-H460 and A549 cells

A: CuⅡa caused G2/M phase cell cycle arrest in NCI-H460 and A549 cells at in a dose-dependent manner; B: CuⅡa inhibited Aurora A phosphorylation in a dose -dependent manner

Fig 4 CuⅡa inhibited dephosphorization of STAT3 and Cofilin

A: CuⅡa inhibited STAT3 phosphorylation in a dose-dependent manner in NCI-H460 and A549 cells pretreated with CuⅡa; B: CuⅡa caused Cofilin dephosphorylation in NCI-H460 and A549 cells

已知CuⅡa誘導肺癌細胞凋亡并阻滯細胞周期于G2/M期，但其機制尚未見報道。與細胞周期調控密切相關的Aurora A激酶參與了細胞分裂的多個生理過程，如中心粒的成熟和分離，紡錘體的形成，染色體的分離和胞質分裂等[9]。已有一些Aurora A激酶抑制劑被發(fā)現(xiàn)，例如：Chinn等[10]用Aurora A抑制劑MK-5108處理多種非小細胞肺癌細胞株，抑制細胞增殖并滯留細胞于G2/M期。另外，通過下調或抑制Aurora A基因表達，也能抑制腫瘤細胞增殖并誘導G2/M期阻滯[11-12]。本研究證實CuⅡa明顯抑制Aurora A激酶蛋白磷酸化，導致其活性受到抑制，進而影響細胞分裂過程，阻滯腫瘤細胞于G2/M期，發(fā)揮抗腫瘤效應。

研究同時還發(fā)現(xiàn)CuⅡa與葫蘆素B等傳統(tǒng)葫蘆素類似物一樣，能夠抑制Cofilin磷酸化。Cofilin作為Cofilin家族一員，在調節(jié)肌動蛋白的動力學[13]，維持細胞形態(tài)以及細胞分裂起到重要作用[14-15]，其磷酸化被抑制導致肌動蛋白聚集、細胞形態(tài)及分裂異常。推測CuⅡa抑制Cofilin磷酸化是誘導腫瘤細胞凋亡重要機制。

綜上所述，CuⅡa能明顯抑制人肺癌細胞系NCI-H460和A549增殖并誘導凋亡，其效應機制可能是抑制Aurora A、STAT3以及Cofilin多種信號通路的結果。CuⅡa能抑制與腫瘤異常增殖多種信號通路，其多靶點協(xié)同抗腫瘤效應機制為該重要天然產(chǎn)物后續(xù)研究提供了理論依據(jù)。

(致謝：本實驗在成都醫(yī)學院科研實驗中心完成的，感謝各位老師和同學對本實驗提供的幫助和支持。)

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Effects of cucurbitacin Ⅱa on apoptosis of human lung cancer cell lines NCI-H460 and A549 and its mechanism

CHEN Yu-lin1，XIAN Qing3，XIAO Cui2，ZHONG Yue-ling2，SU Xiao-mei3，XU Li4，LUO Qiao-li3，CHENG Peng3，WANG Tao3，LIU Jin2，ZHANG Tao3，YANG Tai2，ZOU Qiang2，LI Hua3
(1.SchoolofLifeScienceandEngineering,SouthwestJiaotongUniversity,Chengdu610031,China;2.ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China;3.CancerCenter,ChengduMilitaryGeneralHospital,Chengdu610083,China;4.DeptofClinicalMedicine,NorthSichuanMedicalCollege,NanchongSichuan637000,China)

Aim To study the apoptosis effect of cucurbitacin Ⅱa on non-small cell lung cancer cell lines NCI-H460 and A549 and its underlying mechanism.Methods Cell viability was assessed by CCK-8 assay. The apoptosis effect and cell cycle arrest were detected by Flow cytometry. Western blot was employed to detect the related protein.Results The proliferation of lung cancer cell lines NCI-H460 and A549 was inhibited by CuⅡa, which showed cytotoxic activity with IC50values of 224.9 nmol·L-1and 108.3 nmol·L-1against NCI-H460 and A549 respectively. CuⅡa induced the cells apoptosis and cell cycle arrest at G2/M phase. The results of Western blot showed CuⅡa inhibited the phosphorylation of STAT3 and Cofilin in a dose-dependent manner. Further, CuⅡa inhibited the phosphorylation of Aurora A, in line with the important characteristics of anti-tumor effect of Aurora A kinase inhibitor with blocking cells in the G2/M phase.Conclusion CuⅡa has obvious anti-tumor effect against non-small cell lung cancer, which suggests its value as a lead compound for lung cell carcinoma.

curcerbitacin Ⅱa；non-small-cell lung cancer；apoptosis；Aurora A；Cofilin；STAT3

2017-01-20，

2017-03-08

國家自然科學基金面上項目(No 81273530)；成都軍區(qū)十二五重大項目(No B14005)；醫(yī)院研究型課題重大項目(No 2013YG-A004)

陳育林(1990-)，男，碩士生，研究方向：腫瘤免疫及藥物小分子,E-mail：1015062445@qq.com； 鄒 強(1971-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：自身免疫性疾病發(fā)病機制與治療藥物篩選，通訊作者，E-mail:qiangzou99@gmail.com； 李 華(1971-)，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：疾病基因組學與腫瘤免疫，通訊作者，E-mail：huali99@gmail.com

時間：2017-6-7 19:04 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170607.1904.016.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.07.008

A

1001-1978(2017)07-0922-06

R284.1；R329.25；R329.28；R734.202.2；R979.1