江明金，曹端文，周 健，呂燕妮，裘雅玲，溫金華，魏筱華

(南昌大學第一附屬醫(yī)院藥學部，江西 南昌 330006)

miR-124抑制GluR2參與甲基苯丙胺PC12細胞成癮

江明金，曹端文，周 健，呂燕妮，裘雅玲，溫金華，魏筱華

(南昌大學第一附屬醫(yī)院藥學部，江西 南昌 330006)

目的 探討miR-124表達在甲基苯丙胺成癮PC12細胞模型中的變化及其可能參與的調控機制。方法 培養(yǎng)PC12細胞，隨機分為6組：① 正常對照組;② 甲基苯丙胺組;③ agomir Negative Control組;④ miR-124 agomir組;⑤ agomir Negative Control+甲基苯丙胺組;⑥ miR-124 agomir+甲基苯丙胺組。處理結束后，提取細胞總RNA和蛋白，Real time PCR檢測miR-124表達，Western blot檢測谷氨酸受體2亞單位(ionotropic glutamate receptor AMPA alpha 2，GluR2)蛋白表達。結果 與正常對照組相比，甲基苯丙胺處理組PC12細胞中miR-124表達明顯降低，GluR2蛋白表達明顯升高；與agomir Negative Control+甲基苯丙胺組相比，miR-124 agomir+甲基苯丙胺組PC12細胞中miR-124表達明顯升高，GluR2蛋白表達明顯降低。結論 miR-124可能通過抑制GluR2參與了甲基苯丙胺誘導的PC12細胞成癮。

miR-124；GluR2；過表達；甲基苯丙胺；PC12細胞；成癮；AMPA

甲基苯丙胺，俗稱“冰毒”，是當前最為流行的一種新型合成毒品，其精神依賴性強、復吸率高、神經毒性大，不僅給成癮者自身造成嚴重損害，而且引起嚴重社會、經濟和公共衛(wèi)生問題。大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(rat pheochromocytoma cells，PC12)起源于神經嵴，因其在神經生長因子(nerve growth factor，NGF)誘導下，形態(tài)、結構和功能都類似于交感神經細胞，已成為一個廣泛使用的神經元體外細胞模型[1]。微小核糖核酸(microRNAs，MiRNAs)是一類長度約18～25個核苷酸的內源非編碼小分子RNAs，通過與靶基因mRNA的互補配對，在轉錄后水平上對基因的表達進行負調控，從而導致靶基因mRNA的降解或翻譯抑制。miRNA agomir是經過特殊化學修飾的miRNA激動劑，通過模擬內源性miRNA進入miRNA誘導的沉默復合體來調節(jié)靶基因mRNA的表達而發(fā)揮作用，適合進行長期的miRNA過表達功能研究。miRNAs已被發(fā)現(xiàn)存在于哺乳動物神經系統(tǒng)中并且部分在腦部富集，對中樞神經系統(tǒng)發(fā)育、神經元分化和突觸可塑性發(fā)揮重要的調控作用[2]。關于miRNAs參與藥物成癮調控的研究自2008年Pietrzykowski等[3]首次報道后迅速增多。越來越多的證據(jù)顯示，成癮性物質能誘導miRNAs表達水平的變化，而成癮相關腦區(qū)miRNAs表達的改變直接參與了對成癮行為的調節(jié)。目前，對于miRNAs與可卡因、酒精、尼古丁及阿片類成癮性藥物的研究報道較多，而對miRNAs在甲基苯丙胺成癮中的調控作用所知甚少，處于起步階段。因此，研究miRNAs在甲基苯丙胺成癮中的調控作用，對進一步揭示新型毒品的成癮機制及發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點具有重要意義。

miR-124是一個高度保守、大腦中特定表達的miRNA，占整個大腦中miRNAs的25%～48%[4]。作為中樞神經系統(tǒng)表達最豐富的miRNA，miR-124與藥物成癮密切有關。Chandrasekar等[5]報道顯示，慢性可卡因處理可導致中腦腹側被蓋區(qū)和海馬區(qū)miR-124表達明顯下調，過表達miR-124可抑制可卡因誘導的條件性位置偏愛效應的形成[6]。Qiu等[7]發(fā)現(xiàn)嗎啡處理能明顯上調小膠質細胞中miR-124表達，Xu等[8]報道氯胺酮給藥可導致海馬miR-124表達明顯升高。與成熟的神經細胞中表達類似，miR-124在PC12細胞表達豐富。先前有研究顯示，神經元中谷氨酸受體2亞單位(ionotropic glutamate receptor AMPA alpha 2，GluR2)是miR-124的一個轉錄后調控靶基因[9]。GluR2是α-氨基羥甲基異惡唑丙酸型谷氨酸受體(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate，AMPA)的一個重要亞型，AMPA受體作為腦內的一種興奮性神經遞質受體，在藥物依賴形成過程中起著十分重要的作用。本研究通過觀察甲基苯丙胺處理PC12細胞后miR-124和GluR2的表達情況，探討miR-124參與甲基苯丙胺誘導PC12細胞成癮的可能的調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 NGF誘導分化的PC12細胞，由中國科學院上海細胞庫提供。

1.1.2 藥品與試劑 鹽酸甲基苯丙胺，國家麻醉品實驗室，批號1212-9802。RPMI medium 1640 basic(1×)、FBS(fetal bovine serum，Qualified)、HS(horse serum，Qualified)、胰酶及Penicillin-streptomycin(pen strep)，美國Gibco(life technologies)公司；二甲基亞砜(DMSO)，天津市大茂化學試劑廠；噻唑藍(MTT)，Sigma公司；micrONTMrno-miR-124 agomir、micrONTMagomir Negative Control #22，廣州市銳博生物科技有限公司；miRNeasy Mini Kit，QIAGEN公司；SYBR?PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR Kit，TaKaRa公司；兔抗GluR2多克隆抗體，Millipore公司；兔抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗，博士德公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，碧云天生物技術研究所。

1.1.3 實驗儀器 BCM-1000A超凈臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；HERAcell 240i二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司；IX53熒光倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；HC-3018R高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；HVE-50高壓滅菌鍋，HIRAYAMA MANUFACTURING公司；Stratagene Mx3005P型Real-time PCR儀，美國安捷倫公司；Bio-Rad梯度PCR儀、Mini-PROTEAN 3垂直電泳及轉移槽，美國Bio-Rad公司；ChemiImager 5500凝膠成像儀，美國Alpha Innotech公司。

1.2 方法

1.2.1 PC12細胞培養(yǎng) 將PC12細胞置于預先配制好的完全培養(yǎng)基(RPMI 1640+10%滅活馬血清+5%胎牛血清+0.5%雙抗)，在飽和濕度，37℃恒溫的5% CO2濃度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細胞匯合至70%后傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT檢測甲基苯丙胺處理的PC12細胞活力 將PC12細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)48 h后，吸凈培養(yǎng)基，加入梯度稀釋好的甲基苯丙胺(10、50、100、200 μmol·L-1)各100 μL，每個藥均設置空白對照，每個濃度6個復孔。96孔板于培養(yǎng)箱中孵育48 h，每孔加入20 μL 0.5% MTT，培養(yǎng)箱孵育4 h，顯微鏡下觀察，水不溶性的藍紫色結晶甲臢沉積在細胞中，停止孵育，盡量棄去板內液體，各組每孔加入100 μL DMSO，水平搖床搖幾分鐘，使結晶充分溶解，酶標儀490 nm波長測OD值。

1.2.3 甲基苯丙胺處理PC12細胞 將PC12細胞接種于96孔板中，接種1×105個細胞至含有1 mL完全培養(yǎng)基的12孔板中，當細胞匯合度大于50%(使給藥時的細胞密度在50%～80%)時，棄去孔中的培養(yǎng)基，加入含甲基苯丙胺的培養(yǎng)基，加藥后將12孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，提取細胞的總RNA和蛋白。

1.2.4 PC12細胞轉染miR-124 agomir 接種1×105個細胞至含有1 mL完全培養(yǎng)基的12孔板培養(yǎng)皿孔中，當細胞生長密度大于50%時，棄去孔中的培養(yǎng)基，加入含miR-124 agomir或agomir Negative Control的培養(yǎng)基，輕輕吹打、混勻后，將12孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h進行轉染。轉染成功后，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去12孔板中的培養(yǎng)基，加入含甲基苯丙胺的培養(yǎng)基，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，提取細胞的總RNA和蛋白。

1.2.5 Real-time PCR檢測PC12細胞中miR-124表達 按照QIAGEN公司的RNA提取試劑盒miRNeasy Mini Kit說明書進行PC12細胞總RNA提取。RNA濃度、純度和完整性檢測合格后，參照試劑盒說明書進行Poly(A)加尾和反轉錄反應。Poly(A)加尾和反轉錄反應條件為：50℃ 60 min，85℃ 5 s。按照Real-time PCR引物設計原則設計引物，以U6作為內參對照，引物的序列見Tab 1，所設計的引物用于大鼠來源的基因。所有PCR引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。按照SYBR?PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR試劑盒的操作說明書配制Real-time PCR反應體系。Real-time PCR反應條件為：95℃預變性10 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。分別擴增miR-124和U6的DNA片段。采用2-ΔΔCT法對Real-time PCR結果進行數(shù)據(jù)分析，計算ΔCT(域循環(huán)數(shù))=CT(目的基因)-CT(內參基因)，ΔΔCT=ΔCT(甲基苯丙胺或過表達處理組)-ΔCT(正常對照組)，差別倍數(shù)=2-ΔΔCT，其中正常對照組的數(shù)值均為1。

Tab 1 Primers of polymerase chain reaction

1.2.6 Western blot檢測PC12細胞中GluR2蛋白表達 按照每孔PC12細胞加相應比例的RIPA裂解液進行裂解，4℃，14 000×g離心后取上清(蛋白)分裝于0.5 mL離心管中，BCA法檢測蛋白濃度，其余-80℃保存。取總蛋白30 μg進行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳；濕轉100 V，90 min將蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育2 h。用Image-Pro Plus 6.0圖象處理軟件分析目的條帶的積分光密度(IOD)，與相應加樣孔內參β-actin IOD的比值表示目的蛋白的表達強度。以對照組灰度值設為1。

2 結果

2.1 甲基苯丙胺對PC12細胞活力的影響 觀察了PC12細胞施加不同濃度甲基苯丙胺48 h后細胞的活力，發(fā)現(xiàn)當甲基苯丙胺濃度超過50 μmol·L-1以后，細胞活力開始下降，當濃度達到100 μmol·L-1后，細胞活力明顯降低(Fig 1)。因此，接下來實驗中，我們以50 μmol·L-1的終濃度作為甲基苯丙胺的最大安全劑量。

Fig 1 Effect of methamphetamine on PC12 cell viability(±s,μmol·L-1)

**P<0.01vs0 μmol·L-1

2.2 PC12細胞中miR-124的表達 與正常對照組比較，甲基苯丙胺處理組PC12細胞中miR-124表達明顯降低(P<0.01)。與agomir Negative Control組比較，miR-124 agomir組PC12細胞中miR-124表達明顯升高(P<0.01)，表明PC12細胞轉染miR-124 agomir后，成功使miR-124過表達。與agomir Negative Control組比較，agomir Negative Control+甲基苯丙胺組PC12細胞中miR-124的表達明顯降低(P<0.01)；與agomir Negative Control+甲基苯丙胺組比較，miR-124 agomir+甲基苯丙胺組PC12細胞miR-124表達明顯升高(P<0.01)(Fig 2)。

Fig 2 Measurement of miR-124 expressionin PC12 cells by Real-time PCR(±s)

1:control group;2:methamphetamine group;3:agomir Negative Control group;4:miR-124 agomir group;5:agomir Negative Control+methamphetamine group;6:miR-124 agomir+methamphetamine group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsagomir negative control group;△△P<0.01vsagomir negative control+methamphetamine group

2.3 PC12細胞中GluR2蛋白的表達 與正常對照組比較，甲基苯丙胺處理組PC12細胞中GluR2蛋白表達明顯升高(P<0.01)。與agomir Negative Control組比較，agomir Negative Control+甲基苯丙胺組PC12細胞中GluR2蛋白表達明顯升高(P<0.01)；與agomir Negative Control+甲基苯丙胺組比較，miR-124 agomir+甲基苯丙胺組PC12細胞GluR2蛋白表達明顯降低(P<0.01)(Fig 3)。

Fig 3 Detection of expression of GluR2 protein in PC12 cells by Western blot(±s)

1:control group;2:methamphetamine group;3:agomir negative control group;4:agomir negative control+methamphetamine group;5:miR-124 agomir+methamphetamine group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsagomir negative control group;△△P<0.01vsagomir Negative control+methamphetamine group

3 討論

大量的研究表明，苯丙胺類導致PC12細胞興奮成癮的作用時間約在48 h左右[10-11]。時間太短無法建立起成癮模型，太長又因本身的細胞毒作用易導致神經細胞的衰亡，因此本實驗中我們設計甲基苯丙胺作用細胞的時間為48 h，以模擬細胞成癮的時間。首先我們考察了不同濃度甲基苯丙胺處理48 h對細胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)當甲基苯丙胺濃度超過50 μmol·L-1后，細胞活力開始下降，當濃度達到200 μmol·L-1后，細胞活力明顯降低，因此接下來實驗中，我們以50 μmol·L-1的終濃度作為甲基苯丙胺的最大安全劑量，排除由于甲基苯丙胺本身的興奮性毒性使細胞死亡而對實驗結果造成影響。

miRNAs在甲基苯丙胺成癮中的作用日益受到關注[12]。miR-124作為中樞神經系統(tǒng)中含量最豐富的miRNA，在甲基苯丙胺成癮形成過程中可能發(fā)揮著重要的調控作用。本實驗結果顯示，甲基苯丙胺處理48 h能使PC12細胞中miR-124表達明顯降低。實驗中，我們觀察發(fā)現(xiàn)，甲基苯丙胺處理PC12細胞后，細胞突起變短，有聚集成團現(xiàn)象。先前有研究顯示，miR-124能促進神經細胞突起生長[13]，因此我們推測甲基苯丙胺使PC12細胞突起變短是由于其下調miR-124表達所致。對miR-124靶基因進行預測，發(fā)現(xiàn)miR-124與GluR2的3′UTR保守區(qū)域存在多個結合位點。先前有研究報道，額顳癡呆關聯(lián)的社會行為學損傷小鼠皮層miR-124表達明顯降低，進一步實驗發(fā)現(xiàn)miR-124通過調控Gria2(即GluR2)參與了其損傷機制[9]。GluR2是AMPA受體的一個重要亞型，其在AMPA受體中的相對含量決定了AMPA受體的功能特性。在成癮性藥物作用下，中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)及相關腦區(qū)神經元AMPA受體功能或數(shù)量早期即發(fā)生了一系列的變化，從而進一步介導了許多后續(xù)效應的發(fā)生與維持，AMPA受體的改變可能是觸發(fā)藥物成癮的“扳機”。因此，我們利用Western blot檢測GluR2蛋白表達，與miR-124表達結果剛好相反，甲基苯丙胺處理使PC12細胞中GluR2蛋白表達明顯升高，這與先前研究[14]報道甲基苯丙胺可誘導大鼠紋狀體和前額葉皮層GluR2表達明顯升高相一致。

為了進一步驗證miR-124是否通過抑制GluR2參與了甲基苯丙胺誘導的PC12細胞成癮，我們通過轉染miR-124 agomir使PC12細胞中miR-124過表達。結果顯示：轉染miR-124 agomir 24 h后，觀察到PC12細胞中miR-124表達明顯升高，表明PC12細胞轉染miR-124 agomir后，成功使miR-124過表達。并且我們觀察發(fā)現(xiàn)，轉染agomir對PC12細胞的生長狀態(tài)沒有明顯影響。因此，轉染成功后，我們進一步給予甲基苯丙胺處理，結果發(fā)現(xiàn)：與甲基苯丙胺處理的PC12細胞相比較，過表達miR-124能使PC12細胞中GluR2蛋白表達明顯降低。因此，本研究結果表明，miR-124可能通過抑制GluR2參與了甲基苯丙胺誘導的PC12細胞成癮。

綜上所述，我們利用50 μmol·L-1甲基苯丙胺處理PC12細胞48 h，模擬甲基苯丙胺成癮細胞模型，發(fā)現(xiàn)甲基苯丙胺處理可使PC12細胞中miR-124表達明顯降低，并且其作用可能與其抑制GluR2表達相關。但miR-124參與甲基苯丙胺成癮的具體分子機制仍待體內實驗的進一步研究闡明。

(致謝：本實驗在南昌大學第一附屬醫(yī)院臨床藥理研究室實驗室完成，感謝全體實驗室人員在實驗中給予的幫助和支持！)

[1] Wang W L, Dai R, Yan H W, et al. Current situation of PC12 cell use in neuronal injury study[J].IntJBiotechnolWellnessInd, 2015, 4(2):61-6.

[2] Im H I, Kenny P J. MicroRNAs in neuronal function and dysfunction[J].TrendsNeurosci, 2012, 35(5):325-34.

[3] Pietrzykowski A Z, Friesen R M, Martin G E, et al. Posttranscriptional regulation of BK channel splice variant stability by miR-9 underlies neuroadaptation to alcohol[J].Neuron, 2008, 59(2):274-87.

[4] Lagos-Quintana M, Rauhut R, Yalcin A, et al. Identification of tissue-specific microRNAs from mouse[J].CurrBiol, 2002, 12(9):735-9.

[5] Chandrasekar V, Dreyer J L. microRNAs miR-124, let-7d and miR-181a regulate cocaine-induced plasticity[J].MolCellNeurosci, 2009, 42(4):350-62.

[6] Chandrasekar V, Dreyer J L. Regulation of miR-124, Let-7d, and miR-181a in the accumbens affects the expression, extinction and reinstatement of cocaine-induced conditioned place preference[J].Neuropsychopharmacology, 2011, 36(6):1149-64.

[7] Qiu S, Feng Y, LeSage G, et al. Chronic morphine-induced microRNA-124 promotes microglial immunosuppression by modulating P65 and TRAF6[J].JImmunol, 2015, 194(3):1021-30.

[8] Xu H, Zhang J, Zhou W, et al. The role of miR-124 in modulating hippocampal neurotoxicity induced by ketamine anesthesia[J].InterJNeurosci, 2015, 125(3):213-20.

[9] Gascon E, Lynch K, Ruan H, et al. Alterations in microRNA-124 and AMPA receptors contribute to social behavioral deficits in frontotemporal dementia[J].NatMed, 2014, 20(12): 1444-51.

[10]Kantor L, Park Y H, Wang K K, et al. Enhanced amphetamine-mediated dopamine release develops in PC12 cells after repeated amphetamine treatment[J].EurJPharmacol, 2002, 451(1): 27-35.

[11]Kantor L, Zhang M, Guptaroy B, et al. Repeated amphetamine couples norepinephrine transporter and calcium channel activities in PC12 cells[J].JPharmacolExpTher, 2004, 311(3): 1044-51.

[12]江明金, 李 嬋, 林瑩波, 等. MiRNAs在苯丙胺類興奮劑成癮中作用的研究進展[J]. 中國藥理學通報, 2015, 31(10)：1352-5.

[12]Jiang M J, Li C, Lin Y B, et al. Research progress on the role of miRNAs in amphetamine-type stimulants addiction[J].ChinPharmacolBull, 2015, 31(10):1352-5.

[13]Yu J Y, Chung K H, Deo M, et al. MicroRNA miR-124 regulates neurite outgrowth during neuronal differentiation[J].ExpCellRes, 2008, 314(14):2618-33.

[14]Sim?es P F, Silva A P, Pereira F C, et al. Methamphetamine changes NMDA and AMPA glutamate receptor subunit levels in the rat striatum and frontal cortex[J].AnnNYAcadSci, 2008, 1139(1):232-41.

MiR-124 involves in methamphetamine addiction in PC12 cells by inhibiting GluR2

JIANG Ming-jin, CAO Duan-wen, ZHOU Jian, LYU Yan-ni, QIU Ya-ling, WEN Jin-hua,WEI Xiao-hua
(DeptofPharmacy,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China)

Aim To investigate the change of miR-124 expression in methamphetamine-induced addiction in PC12 cells and the possible regulatory mechanism that it involves.Methods PC12 cells were randomly divided into 6 groups as follows: control group, methamphetamine group, agomir Negative Control group, miR-124 agomir group, agomir Negative Control+methamphetamine group and miR-124 agomir+methamphetamine group. After the treatment, the total RNA and protein were extracted in PC12 cells. The expression of miR-124 was measured by Real-time PCR and the expression of GluR2 was determined by Western blot in PC12 cells.Results Compared with those in the control group, the expression of miR-124 was remarkably decreased and the expression of GluR2 was significantly increased in the methamphetamine group in PC12 cells. Compared with those in the agomir Negative Control+methamphetamine group, the expression of miR-124 was remarkably increased and the expression of GluR2 was significantly decreased in the miR-124 agomir+methamphetamine group in PC12 cells.Conclusion MiR-124 might involve in methamphetamine-induced addiction in PC12 cells by inhibiting GluR2.

miR-124; GluR2; overexpression; methamphetamine; PC12 cells; addiction; AMPA

2017-02-09；

2017-05-23

國家自然科學基金資助項目(No 81660591，81560632)

江明金(1988-)，男，博士，藥師，研究方向：中藥及其有效成分抗藥物成癮的分子機制，E-mail：comity2006@126.com； 魏筱華(1964-)，女，主任藥師，碩士生導師，研究方向：臨床藥理學，通訊作者，E-mail：wxh-hello@163.com

時間：2017-6-7 19:04 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170607.1904.038.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.07.019

A

1001-1978(2017)07-0982-05

R329.24；R392.11；R749.61；R971.7；R971.93；R977.9