胡兢晶 王波 蘇海浩 丁俊彩 郭媛媛 謝斌華 伍苑賓 蔡麗君 郭夢杰

511442 廣州，廣東省婦幼保健院兒科

·論著·

應(yīng)用外部引導(dǎo)序列切割人巨細(xì)胞病毒UL148 RNA的研究

胡兢晶 王波 蘇海浩 丁俊彩 郭媛媛 謝斌華 伍苑賓 蔡麗君 郭夢杰

511442 廣州，廣東省婦幼保健院兒科

目的 研究人巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV)臨床病毒株UL/b′區(qū)域UL148基因功能及抗HCMV治療新策略，應(yīng)用DNA性質(zhì)外部引導(dǎo)序列(External guide sequences，EGS)在體外抑制UL148 RNA的表達(dá)。 方法 應(yīng)用RNA structure生物軟件模擬UL148 RNA二級結(jié)構(gòu)，選擇二級結(jié)構(gòu)相對簡單的區(qū)域設(shè)計(jì)EGS，并合成EGS核苷酸序列。應(yīng)用PCR方法分別擴(kuò)增UL148及M1RNA基因，克隆至T7啟動子下游，在T7 RNA聚合酶的作用下，體外轉(zhuǎn)錄UL148 RNA及M1RNA，其中UL148以32P標(biāo)記并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。混合EGS、M1RNA及UL148 RNA于切割反應(yīng)液中，反應(yīng)1 h后，進(jìn)行尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，Typhoon掃描儀觀察結(jié)果。 結(jié)果 根據(jù)UL148 RNA二級結(jié)構(gòu)選取第58～72位堿基作為EGS結(jié)合區(qū)域，其切割位點(diǎn)位于57位，針對此區(qū)域設(shè)計(jì)EGS57，并在體外進(jìn)行EGS57與UL148 RNA結(jié)合的二級結(jié)構(gòu)的模擬，可形成M1RNA天然作用底物類似的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在T7 RNA聚合酶的作用下，分別在體外轉(zhuǎn)錄M1RNA及UL148 RNA，其大小均與預(yù)期相符。經(jīng)切割反應(yīng)，可獲得與預(yù)期切割位點(diǎn)相符的切割條帶。 結(jié)論 EGS57可切割UL148 RNA，其切割位點(diǎn)準(zhǔn)確，與預(yù)期相符。該研究為進(jìn)一步探討UL148基因功能提供有效基因沉默工具。

Fund programs: National Natural Science Foundation of China (81070516)；Natural Science Foundation of Guangdong Province of China (2015A030313726,9151008901000085)；Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province(A2015133,A2009078)

人巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV)是一種β皰疹病毒，其基因組龐大。在人群中感染普遍，大多數(shù)人為潛伏感染或無癥狀感染，多數(shù)人在HCMV感染后可獲得免疫[1, 2]。HCMV感染與心血管疾病及腫瘤的發(fā)生相關(guān)[3, 4]。

目前HCMV的致病機(jī)理尚不明確，Cha等[5]在1996年的研究中發(fā)現(xiàn)HCMV臨床病毒株Toledo存在一個獨(dú)特的UL/b′基因結(jié)構(gòu)區(qū)域，該區(qū)域包括UL133～UL151在內(nèi)的至少19個開放閱讀框(Open reading frame, ORF)，在實(shí)驗(yàn)室株的反復(fù)傳代過程中該區(qū)域的基因逐漸丟失，隨著該區(qū)域基因的丟失病毒也喪失了毒力，推測該區(qū)域與HCMV的致病密切相關(guān)。研究已證實(shí)該區(qū)域的多個基因在HCMV感染過程中發(fā)揮重要作用，其中UL141和UL142編碼產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)細(xì)胞受體的表達(dá)來逃避NK細(xì)胞的識別和殺傷[6, 7]；UL144基因編碼的蛋白與腫瘤壞死因子超家族成員結(jié)合，參與病毒的免疫逃避[8, 9]。

外部引導(dǎo)序列(External guide sequences，EGS)技術(shù)利用RNase P(原核生物來源的RNase P催化核心為377個核苷酸的M1RNA)對底物二級結(jié)構(gòu)的識別，而非序列特異性，人工設(shè)計(jì)小分子核酸序列EGS與靶mRNA互補(bǔ)，并與mRNA特異性結(jié)合后，模擬tRNA的雙鏈莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，使M1RNA識別，并不可逆的切割靶mRNA，在mRNA水平沉默基因的表達(dá)[10]。

本研究在前期的基礎(chǔ)上[11]，應(yīng)用EGS基因沉默技術(shù)，設(shè)計(jì)以HCMV UL148特定位點(diǎn)為靶目標(biāo)的EGS小分子核酸工具，特異性切割UL148基因表達(dá)，以期為研究UL148基因功能及抗HCMV治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 Ex Taq聚合酶、核酸內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、T7 RNA polymerase、RNase抑制劑、RNase-free DNase I、質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖回收試劑盒均購買自大連寶生公司；牛血清白蛋白組分Ⅴ購自北京鼎國公司；α-32P-UTP購自北京福瑞公司。

含 HCMV臨床病毒株(D2) UL148 基因的質(zhì)粒 pMD148為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；載體質(zhì)粒 pGEM-T-Easy 購自基因公司；載體質(zhì)粒pUC18購自大連寶生公司；基因測序及寡核苷酸片段合成由北京英俊公司完成；同位素標(biāo)記 RNA marker為本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 UL148 RNA 制備 以pMD148為模板[10]，設(shè)計(jì)上游引物UL148-F：5′-AGCGGGCCCTGTTGCGCTTGCTGTTCACGCTC-3′及下游引物UL148-R：5′-AGCGAGCTCCTACCGACGCCGCGACACCAGGT-3′。擴(kuò)增體系：模板1 μl、上下游引物各1 μl、dNTP 4 μl、Ex Taq聚合酶0.5 μl、10×Ex Taq Buffer 5 μl、加滅菌水至50 μl。反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 45 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物純化后，經(jīng)ApaⅠ與SacⅠ酶切與相應(yīng)酶切后的pGEM-T-Easy質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化、篩選克隆成功的質(zhì)粒測序。鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pGEM148。

為提高體外切割效率及更好的暴露切割位點(diǎn)，體外轉(zhuǎn)錄UL148小片段作為靶基因。將構(gòu)建成功的pGEM148重組質(zhì)粒為模板，以UL148-A1(5′-TGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGC-3′)和UL148-A2(5′-TCCACGATCCGGGAGAGCGTTTCTAG A-3′)為引物，擴(kuò)增UL148基因小片段轉(zhuǎn)錄模板，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為UL148-A，其大小為500 bp。以32P-UTP標(biāo)記，以UL148-A為模板，體外轉(zhuǎn)錄UL148-A RNA，反應(yīng)條件及體系：2.5 mmol/L rNTP 10 μl、RNasin 1.5 μl、牛血清白蛋白 V(2.5 mg/ml) 2.5 μl、10×轉(zhuǎn)錄緩沖液5 μl、加滅菌水至50 μl，混合均勻后加入線性DNA模板 5 μl、32P-UTP 1 μl、T7 RNA聚合酶1 μl，37℃孵育 2～4 h。

1.3 M1RNA的制備 以O(shè)li MF5′-CGAGAATTCTAATACGACTCACTATAGAAGCTGACCAGACAGTCGCCG-3′及Oli MR5′-ACTAAGCTTAGGTGAAACTGACCGATAAGCC-3′為引物，以大腸埃希菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增大腸埃希菌M1RNA基因，經(jīng)EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切后與相應(yīng)的酶切后的pUC18連接，測序鑒定正確的重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ線性化后，制備成大腸埃希菌M1RNA轉(zhuǎn)錄模板，加入T7 RNA聚合酶，體外轉(zhuǎn)錄M1RNA，反應(yīng)體系及條件同UL148-A體外轉(zhuǎn)錄。

1.4 EGS設(shè)計(jì) 根據(jù)EGS設(shè)計(jì)原則[14]及UL148基因序列特點(diǎn)，選取UL148基因的58～72位為EGS結(jié)合區(qū)域，設(shè)計(jì)與該區(qū)域結(jié)合的DNA性質(zhì)EGS。它包括3′結(jié)合區(qū)序列、額外環(huán)、T莖環(huán)及5′結(jié)合區(qū)序列。EGS與UL148 RNA結(jié)合后形成類似于ptRNA的多變區(qū)域與T莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并在EGS的3′末端形成一個-CCA游離末端。

1.5 切割反應(yīng) 將底物RNA與EGS混合放入80℃水浴5 min，在冰上稍放，加入與底物等濃度量的M1RNA，在切割緩沖液(pH7.5，100 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NH4Cl，50 mmol/L Tris)中37℃反應(yīng)1 h。以8% 7 mol/L尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并使用Typhoon掃描儀觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 pGEM148質(zhì)粒鑒定 UL148基因克隆入pGEM-T-EASY質(zhì)粒后，將目的片段置于T7啟動子下游。重組質(zhì)粒經(jīng)質(zhì)粒直接電泳，PCR及雙酶切驗(yàn)證，其PCR產(chǎn)物大小為951 bp，其條帶均與預(yù)期大小相符，并經(jīng)序列測定證實(shí)pGEM148重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 UL148小片段體外轉(zhuǎn)錄 以UL148-A1、UL148-A2為引物，以pGEM148重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增UL148-A小片段(圖1A)，其PCR產(chǎn)物為UL148-A小片段體外轉(zhuǎn)錄模板，以32P-UTP標(biāo)記，體外轉(zhuǎn)錄UL148-A RNA其條帶大小為500 bp，結(jié)果與預(yù)期相符，成功在體外獲得32P標(biāo)記的UL148-A RNA(圖1B)。

2.3 EGS設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)EGS57與UL148 RNA的58～72位結(jié)合。EGS57序列為： ATCATAGTCGTGCGGTCTCCGCGCGCAGGTTCAAATCCTGCGGCTAGCGCCA，其中CATAGTC為3′結(jié)合區(qū)序列，GGCTAGC為5′結(jié)合區(qū)序列，與UL148 RNA結(jié)合后形成和ptRNA極為類似的結(jié)構(gòu)，使核酶P識別該結(jié)構(gòu)并在UL148 RNA結(jié)合部位的5′端進(jìn)行不可逆的切割。

2.4 M1RNA重組質(zhì)粒鑒定與體外轉(zhuǎn)錄模板制備 重組質(zhì)粒pUC-M1經(jīng)質(zhì)粒直接電泳、PCR及雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒大小為3 063 bp(圖2B)，PCR鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物為377 bp(圖2A)，均與預(yù)期相符。最終經(jīng)序列測定證實(shí)pUC-M1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。以自備RNA maker為參照，BindⅢ酶切線性化后的pUC-M1質(zhì)粒作為模板，以32P-UTP標(biāo)記，在T7 RNA聚合酶的作用下，以尿素變性聚丙烯酰胺凝膠分離，掃描后可見377 bp大小的清晰條帶(圖2C)，證實(shí)在體外成功獲得核酶M1RNA。

2.5 細(xì)胞外切割 EGS57切割后產(chǎn)物與預(yù)期大小相符(圖3)，證實(shí)EGS57可在準(zhǔn)確位點(diǎn)切割目標(biāo)基因UL148 RZHNA。

注：1：RNA marker，2：切割產(chǎn)物，3：底物UL148-A RNA圖3 EGS57體外切割UL148-A RNA結(jié)果1: RNA marker，2: Cleavage product，3: UL148-A RNA substrateFig.3 Assay of EGS57 cleavage UL148-A RNA in vitro

3 討論

HCMV是先天性感染最重要的病毒之一，可引起嚴(yán)重的后遺癥，是移植失敗及移植術(shù)后死亡的重要病因。目前藥物治療已有很大進(jìn)展，但由于毒副作用在一定程度上限制了藥物的應(yīng)用。因此尋求一種有效控制HCMV感染的新策略尤為重要。

EGS是基于RNase P發(fā)展的一種基因沉默技術(shù)，RNase P是細(xì)胞自身的天然核酶，無明顯的毒性?；谄渥陨砑夹g(shù)特點(diǎn)，EGS作為基因治療的一種小分子核酸藥物，具有良好的前景，為抗HCMV治療提供了一個新的手段和思路。

本研究選取DNA性質(zhì)EGS在體外實(shí)驗(yàn)中顯示出較好的切割效率。目前基于EGS技術(shù)的研究多為RNA性質(zhì)，雖然其切割效率高，但合成成本高，易降解，不便于運(yùn)輸及保存，操作過程要求嚴(yán)格，在一定程度上限制了它的發(fā)展。目前DNA性質(zhì)EGS研究較少，其切割效率較RNA性質(zhì)EGS低，主要原因是它與mRNA親和力較低，增加劑量可提高效率，但它本身成本低，易于合成、保存及運(yùn)輸，無明顯細(xì)胞毒性[12, 13]，切割位點(diǎn)準(zhǔn)確具有可選擇性，是較為理想的基因沉默工具。

UL148基因位于UL/b′區(qū)域，其基因功能尚不明確。一項(xiàng)在恒河猴CMV的研究中發(fā)現(xiàn)：與HCMV UL148核酸序列高度同源的Rh159基因與恒河猴CMV的細(xì)胞嗜性相關(guān)[14]。目前有關(guān)人類HCMV UL148基因功能尚不明確，本課題組已對該基因進(jìn)行了大量前期研究，在HCMV感染細(xì)胞中檢測到該基因mRNA的表達(dá)，并且該基因存在RGD、蛋白激酶C等多個重要翻譯后修飾位點(diǎn)，這些都高度提示HCMV UL148基因極有可能是重要的功能基因。本課題研究獲得的特異性切割UL148基因的EGS57，為進(jìn)一步研究UL148基因提供有效基因沉默工具，也為明確該基因功能奠定了基礎(chǔ)。

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(本文編輯：唐瀏英)

Effective inhibition of human cytomegalovirus UL148 gene expression by external guide sequences in vitro

Hu Jingjing, Wang Bo, Su Haihao, Ding Juncai, Guo Yuanyuan, Xie Binhua, Wu Yuanbin, Cai Lijun, Guo Mengjie

Department of Pediatrics, Guangdong Provincial Maternal and Child Health Hospital, Guangzhou 511442, China

Wang Bo, Email: dr.wangbo@163.com

Objective To investigate the UL148 gene function of human cytomegalovirus (HCMV) low passage clinic isolate and new strategies for anti-HCMV treatment, the DNA-based external guide sequences (EGSs) were designed to inhibit UL148 RNA expression. Methods UL148 RNA secondary structure was analyzed by RNA structure technique, an appropriate region was chosen for DNA-based EGS57 synthesis, targeted the UL148 RNA. The M1RNA and UL148 RNA were generated by PCR for transcription in vitro. The UL148 RNA and M1RNA were transcribed in vitro under the function of T7 RNA polymerase. The UL148 was labelled by32P. The cleavage reactions were carried out by mixing up EGS, M1RNA with UL148 RNA for 1 h. The products were separated by urea denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and detected with Typhoon Phosphor Imager. Results UL148 RNA ranged from 58 to 72 sites was the binding position, and 57 was a cleavage site. EGS57 was designed and synthesized. EGS57 was combined with UL148 RNA to form the natural substrate of M1RNA. UL148 RNA and M1RNA were synthesized through T7 RNA polymerase catalyzing, and the products were conformed. After cleaving reactions, DNA-based EGS57 was shown to be able to cleave UL148 RNA efficiently in vitro by a complex with M1RNA. ConclusionsUL148 RNA was cleaved efficiently by EGS57, and the cleaving site was conformed as expectation. It will provide the gene silent tool effectively for further study the function of UL148 gene.

Human cytomegalovirus; External guide sequences; UL148; Clinic isolate

王波，Email: dr.wangbo@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.001

人巨細(xì)胞病毒；外部引導(dǎo)序列；UL148；臨床病毒株

國家自然科學(xué)基金(81070516)；廣東省自然科學(xué)基金(2015A030313726，9151008901000085)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(A2015133，A2009078)

2016-03-17)