艾宇潔 韓亞萍 金柯 岳明 周宜慶 李軍

210029 南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院

·論著·

SFTS病毒非結構蛋白重組質(zhì)粒的構建及其體液免疫原性研究

艾宇潔 韓亞萍 金柯 岳明 周宜慶 李軍

210029 南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院

目的 研究SFTS病毒(SFTS virus, SFTSV)的非結構蛋白(Nonstructural proteins, NSs)重組質(zhì)粒的體液免疫原性。方法 利用聚合酶鏈反應法(Polymerase chain reaction, PCR)構建真核表達質(zhì)粒pJW4303-NSs、pJW4303-NSs-opt、pJW4303-NSs-Flag；引入NheⅠ酶切位點及tPA(Tissue plasminogen activator, tPA)信號肽，構建質(zhì)粒pJW4303-tPA-NSs-opt。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK 293T細胞，蛋白質(zhì)印跡法(Western blot, WB)驗證NSs表達。NSs相關質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠，采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測SFTSV NSs特異性IgG抗體。結果 成功構建了重組NSs質(zhì)粒，WB驗證了NSs可在HEK293T細胞內(nèi)表達。pJW4303-NSs、pJW4303-NSs-opt、pJW4303-tPA-NSs-opt重組質(zhì)粒均可誘導小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性IgG，其中單優(yōu)化型質(zhì)粒pJW4303-NSs-opt的免疫原性較好，在第6、8周的IgG水平顯著高于野生型NSs質(zhì)粒，差異具有統(tǒng)計學意義。結論本研究構建的SFTSV的NSs重組優(yōu)化型質(zhì)粒具有良好體液免疫原性，其中單優(yōu)化型效果最佳。

Fund programs: National Science and Technology Major Project (2013ZX10002005-002-005)

發(fā)熱伴血小板減少綜合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)是由一種2009年在中國河南省首先發(fā)現(xiàn)的新型布尼亞病毒，SFTS病毒(SFTS virus，SFTSV)感染所致的新發(fā)傳染病[1]。SFTSV廣泛分布于中國東部20個省份[1]。SFTS的臨床表現(xiàn)通常無特異性，常表現(xiàn)為發(fā)熱、胃腸道癥狀、肌肉酸痛、局部淋巴結腫大、血小板減少和轉(zhuǎn)氨酶上升，重癥患者可繼發(fā)多器官衰竭甚至死亡，在中國平均病死率為7.8%，在日本和韓國則為50%[1,3]。與SFTS 同為白蛉熱病毒屬的一些病毒如哈特蘭病毒(Heartland virus)、馬爾索爾病毒(Malsoor virus)和獵人島病毒(Hunter Island virus)分別在美國、印度和澳大利亞從患者體內(nèi)、蝙蝠和蜱蟲上分離到[4,7]，這表明SFTSV及類SFTSV病毒為全球正在蔓延的危險病原體，威脅著人類的健康。

SFTSV基因組包含L、M、S三個片段，分別編碼病毒RNA聚合酶、糖蛋白Gn和Gc、核蛋白N和非結構蛋白NSs。目前研究發(fā)現(xiàn)，布尼亞病毒科病毒的非結構蛋白NSs可多途徑介導宿主免疫應答，且SFTSV的NSs通常被認為參與調(diào)控宿主免疫應答并且對Ⅰ型IFN(Interferon, IFN)的表達具有抑制作用[8]。但目前關于SFTSV NSs免疫原性的研究報道甚少。因此，本研究對原始序列進行密碼子優(yōu)化和信號肽引入，構建了SFTSV NSs重組質(zhì)粒，并觀察其免疫BALB/c小鼠后誘導的體液免疫應答特點，為將來SFTSV NSs致病機制的研究，SFTS的早期診斷、治療及核酸疫苗的研制提供一定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 DH5α感受態(tài)細胞、質(zhì)粒小量提取試劑盒、質(zhì)粒大量提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ、NheⅠ、T4 DNA連接酶(美國Fermentas公司)；DMEM高糖細胞培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Hyclone公司)；兔抗Flag標簽多克隆抗體(美國Proteintech公司)；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(上海生工有限公司)；ECL化學發(fā)光液(美國Pierce公司)；實驗用SPF級BALB/c雌鼠(北京維通利華實驗動物技術公司)；真核表達載體pJW4303和細胞株HEK 293T均系本實驗室保存。

1.2 NSs序列的克隆和NSs重組質(zhì)粒構建 以SFTSV HB29病毒株作為參考序列，由南京金斯瑞生物技術有限公司合成NSs的野生型基因序列(GenBank: HM745932.1)，同時在該序列上下游分別引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位點序列，克隆到載體pUC57內(nèi)，即質(zhì)粒pUC57-NSs。對pUC57-NSs及pJW4303進行HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，獲得的目的片段通過T4 DNA連接酶裝載入線性化真核表達載體內(nèi)，隨后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞；小提質(zhì)粒后進行酶切鑒定并送基因測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pJW4303-NSs(野生型NSs質(zhì)粒)。在pJW4303-NSs質(zhì)粒中NSs的3′端添加Flag標簽，由上海復百奧生物科技有限公司合成，構建質(zhì)粒即pJW4303-NSs-Flag(Flag標簽NSs質(zhì)粒)，用于驗證NSs蛋白的細胞表達。

1.3 單優(yōu)化型和雙優(yōu)化型NSs質(zhì)粒的構建 以SFTSV HB29為參考病毒株，運用OptimumGeneTM軟件對NSs序列進行分析，并將其與哺乳動物不一致的密碼子偏好位點替換為哺乳動物偏好的密碼子，同時保持氨基酸序列不變，所得到的優(yōu)化序列即NSs-opt，分別在該序列5′ 端和3′ 端引入HindⅢ和BamHⅠ兩個酶切位點，隨后將合成的序列NSs-opt裝載到載體pUC57內(nèi)，得到質(zhì)粒pUC57-NSs-opt。上述兩種酶酶切后獲得NSs-opt基因片段，使用T4 DNA連接酶裝載入線性化真核載體pJW4303，轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切和測序鑒定正確后得到質(zhì)粒pJW4303-NSs-opt，即單優(yōu)化型NSs質(zhì)粒。以pUC57-NSs-opt為模版，以5′端含NheⅠ酶切位點序列的tPA-NSs-opt F: GTCACTTCGCTAGCTCGCTGAGCAAATG CTCC為上游引物，以5′端含BamHⅠ酶切位點序列的tPA-NSs-opt R: GAGCTCGGATCCCT ATTAGACCTCCTTCGGGAGG為下游引物，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物及真核載體pJW4 303分別經(jīng)NheⅠ和BamHⅠ酶切，所得基因片段使用T4 DNA連接酶裝載入線性化載體pJW4303，轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切測序正確后得到雙優(yōu)化型NSs質(zhì)粒pJW4303-tPA-NSs-opt。

1.4 重組質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染 在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中使用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素)培養(yǎng)HEK293T細胞至對數(shù)生長期，細胞密度達70%～90%時，分別將野生型、單優(yōu)化型、雙優(yōu)化型及Flag標簽的NSs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞內(nèi)，pJW4303作陰性對照，48～72 h后收集細胞上清和細胞裂解，于-20 ℃保存。

1.5 NSs重組質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠 本實驗選取BALB/c小鼠為實驗鼠，設置3個實驗組(野生型、單優(yōu)化型、雙優(yōu)化型)和空載體對照組(pJW4303，下文均稱作空載體組)，7只/組，以100 μg/只的劑量肌注、體內(nèi)電轉(zhuǎn)染法導入小鼠體內(nèi)。選取0、2、4周3個時間點進行免疫，采血時間為每次免疫前和免疫后6、8周，血清保存于-20 ℃。

1.6 Western blot檢測SFTSV NSs的表達 將轉(zhuǎn)染帶Flag標簽的NSs質(zhì)粒和載體質(zhì)粒收獲的培養(yǎng)上清和裂解液進行SDS-PAGE電泳。上樣量為20 μl/孔，隨后冰上轉(zhuǎn)PVDF膜并孵育1 h，5%脫脂奶粉封閉，室溫孵育2 h，加入1∶2000稀釋的兔抗Flag多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。洗膜后加入1∶5000稀釋的羊抗兔IgG于37 ℃共孵育1 h，洗膜，ECL化學發(fā)光液顯色。β-actin用作內(nèi)參，相對分子質(zhì)量大小為43×103。

1.7 ELISA檢測SFTSV NSs血清特異性IgG抗體 收獲的雙優(yōu)化型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上清與PBS以1∶5比例稀釋后包被酶標板，4 ℃過夜。洗板后5%脫脂奶粉封閉，37 ℃孵育2 h，洗板后分別加入各組重組質(zhì)粒免疫血清，起始濃度1∶200，隨后進行1∶2倍比稀釋，37 ℃孵育1 h，洗板后加入1∶2000稀釋的HRP標記的山羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，洗板，TMB顯色15 min，終止顯色后于630 nm參考波長、450 nm測試波長條件下測定吸光度值。定義A450 nm≥0.05且大于等于陰性對照組吸光度值2.1倍的值為陽性。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，對小鼠免疫后NSs特異性IgG抗體滴度進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，非正態(tài)分布則采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗比較不同重組質(zhì)粒的組間差異，采用雙側(cè)檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定 將構建的重組質(zhì)粒進行雙酶切，并將酶切鑒定正確的質(zhì)粒pJW4303-NSs、pJW4303-NSs-opt、pJW4303-tPA-NSs-opt送上海生工生物工程有限公司測序，質(zhì)粒pJW4303-NSs的測序結果與GeneBank中公布的SFTSV基因組序列經(jīng)BLAST軟件比對結果一致。質(zhì)粒pJW4303-NSs-Flag的目的基因序列與pJW4303-NSs一致。質(zhì)粒pJW4303-NSs-opt、pJW4303-tPA-NSs-opt的測序結果經(jīng)DNAMAN 8.0軟件與密碼子優(yōu)化的基因序列比對，序列一致。以上結果證實重組野生型、單優(yōu)化型、雙優(yōu)化型NSs質(zhì)粒的構建均正確。

2.2 NSs蛋白的細胞表達鑒定 SFTSV NSs相對分子質(zhì)量約34×103。采用Western blot 檢測pJW4303-NSs-Flag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后收獲的上清和裂解物，結果發(fā)現(xiàn)在目的條帶位置均出現(xiàn)一條明顯表達條帶，說明NSs蛋白在293T細胞中有表達并可分泌到胞外，但在HEK293T細胞上清中表達的量較少，說明僅有部分蛋白分泌到胞外。陰性對照pJW4303在收獲的轉(zhuǎn)染細胞上清和裂解物均未檢測到目的蛋白表達(圖1)。

1: pJW4303轉(zhuǎn)染細胞上清；2: pJW4303轉(zhuǎn)染細胞裂解；3: pJW4303-Nss-Flag轉(zhuǎn)染細胞上清；4: pJW4303-Nss-Flag轉(zhuǎn)染細胞裂解圖1 SFTSV NSs在HEK293T細胞中的表達1: supernatants of HEK 293T cells transfected with pJW4303；2: lysates of HEK 293T cells transfected with pJW43033; 3.supernatants of HEK 293T cells transfected with pJW4303-NSs-Flag；4: lysates of HEK 293T cells transfected with pJW4303-NSs-FlagFig.1 Expression of SFTSV NSs in HEK 293T cells

2.3 BALB/c小鼠免疫血清NSs特異性抗體IgG應答趨勢及其滴度 將免疫小鼠血清以1∶200比例稀釋，ELISA法檢測IgG抗體水平(圖2)，發(fā)現(xiàn)各組免疫前和pJW4303組免疫后2、4、6、8周均未檢測出IgG抗體；而在免疫后4周的野生型、單優(yōu)化型、雙優(yōu)化型組血清中均可以檢測到特異性抗體IgG，單優(yōu)化型組和雙優(yōu)化型組隨著免疫次數(shù)增加特異性IgG水平逐漸升高，在8周達最高峰。其中單優(yōu)化型組IgG水平升高明顯，優(yōu)于野生型組和雙優(yōu)化組。

圖2 免疫前后小鼠血清抗SFTSV NSs特異性抗體IgG應答時間曲線Fig.2 Timeline of anti-SFTSV NSs antibody IgG in the serum before and after immunization in mice

隨后將各組各時間點吸光度值陽性的小鼠血清樣本進行1∶2倍比稀釋，起始稀釋濃度為1∶200，通過ELISA法比較各組滴度水平(圖3)。結果發(fā)現(xiàn)，免疫4周后3組最高稀釋倍數(shù)均為1∶800，單優(yōu)化型IgG滴度顯著高于空載體pJW4303組，兩組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.013)。在免疫后6周，野生型、單優(yōu)化型、雙優(yōu)化型組最高稀釋倍數(shù)分別為1∶400、1∶3200、1∶3200，且單優(yōu)化型質(zhì)粒顯著高于空載體pJW4303組和野生型質(zhì)粒組，差異具有統(tǒng)計學意義(單優(yōu)化型v.s. 空載體組：P=0.00016；單優(yōu)化型v.s. 野生型：P=0.034)；免疫后8周，野生型組和雙優(yōu)化型組分別升高至1∶3200，1∶25600，單優(yōu)化型組最高稀釋倍數(shù)升高至1∶102400，滴度值顯著高于空載體組及野生型組，且組間差異有統(tǒng)計學意義(單優(yōu)化型v.s. 空載體：P=0.000158；單優(yōu)化型v.s. 野生型：P=0.035)。

圖3 免疫后4、6、8周BALB/c小鼠血清抗NSs特異性IgG抗體滴度水平Fig.3 The levels of anti NSs-specific IgG in th serum of BALB/c mice at 4, 6, 8 weeks after immunization

3 討論

SFTSV NSs通過抑制宿主細胞IFN-β天然抗病毒反應參與病毒感染[9]，但目前對于NSs的免疫原性缺乏深入研究?？紤]到既往文獻報道SFTSV非結構蛋白的免疫原性較弱，本研究通過對SFTSV非結構蛋白NSs基因序列進行密碼子優(yōu)化、tPA信號肽引入等方法，成功構建3個含SFTSV NSs序列的重組質(zhì)粒并通過免疫BALB/c小鼠觀察其誘導的體液免疫應答特點。研究發(fā)現(xiàn)：野生型、單優(yōu)化型、雙優(yōu)化型組均有特異性IgG抗體應答，單優(yōu)化型組抗體水平明顯高于野生型組，表明單優(yōu)化型NSs質(zhì)粒可誘導更好的免疫應答，免疫原性更強。

本研究中野生型NSs質(zhì)粒特異的IgG水平與空載體組差異無統(tǒng)計學意義，表明野生型NSs免疫原性較弱，無法誘導有效的免疫應答。Van等[10]發(fā)現(xiàn)布尼亞病毒屬的布尼安維拉病毒(Bunyamwera virus，BUNV)的NSs免疫原性低，且抗體只在蛋白酶體降解時發(fā)揮特定作用；Fernandez等研究揭示動物自然感染裂谷熱病毒(Rift valley fever virus, RVFV)后只有55%能檢測到NSs相關抗體，同樣提示RVFV的NSs免疫原性較低[11]，說明其他布尼亞病毒科的NSs也具有弱免疫原性的特點，與本研究發(fā)現(xiàn)一致。因此，對SFTSV NSs基因序列進行密碼子優(yōu)化，并構建含優(yōu)化序列的重組質(zhì)粒對研究其體液免疫特點具有重要的意義。密碼子優(yōu)化作為提高蛋白表達的策略之一如今被廣泛應用，通過將目的基因原有的、與宿主細胞使用偏好不同的密碼子位點，替換成更接近宿主細胞使用偏好的密碼子并保持編碼的氨基酸序列不變，從而獲得較高水平的異源蛋白表達[12]。文獻研究也表明對野生型基因序列進行密碼子優(yōu)化能誘導更強的抗原應答從而增強免疫原性，特別在外源表達系統(tǒng)中尤為明顯[13]，與本研究結論相符。

tPA信號肽一般被認為可以有效促進蛋白的分泌，誘導較強的體液免疫[14]。本實驗成功構建了在密碼子優(yōu)化基礎上引入tPA信號肽的雙優(yōu)化型重組質(zhì)粒，但是通過檢測免疫小鼠體內(nèi)的特異性IgG水平，發(fā)現(xiàn)單優(yōu)化型質(zhì)粒的免疫應答顯著優(yōu)于雙優(yōu)化型質(zhì)粒，且雙優(yōu)化型與野生型組間IgG水平差異無統(tǒng)計學意義。理論上密碼子優(yōu)化和tPA信號肽引入的雙重優(yōu)化應可誘導比單一密碼子優(yōu)化更強的免疫應答，本實驗組以往關于SFTSV的核蛋白N的免疫原性研究中，密碼子優(yōu)化基礎上引入tPA信號肽也可進一步加強核蛋白N的體液免疫原性[15]。本實驗結果顯示雙優(yōu)化組未能誘導進一步體液免疫應答，原因仍需進一步研究。針對該結果擬在后續(xù)研究中，擴大樣本量，進一步確認雙優(yōu)化型組的免疫效果，并探討其機制以采取更好的優(yōu)化策略。其次，tPA信號肽對蛋白表達影響機制，需要進一步探討，擬在后繼研究中，構建單獨引入tPA信號肽的重組質(zhì)粒，以便進一步觀察研究。

本實驗局限之處在于未直接驗證3個重組質(zhì)粒NSs蛋白的表達，原因在于：1)目前無商品化NSs抗體；2)本實驗原使用小鼠免疫血清作為一抗以檢測NSs蛋白表達，但多次重復實驗均未出現(xiàn)目的條帶，考慮血清成分較復雜，NSs表達量較少；在ELISA可以檢測到抗NSs特異性IgG而WB中未檢測到NSs抗體，推測NSs抗體可能以識別構象表位為主而非線性表位，具體需要進一步改進實驗方法繼續(xù)研究。

綜上所述，本實驗成功構建了3個SFTSV NSs重組質(zhì)粒，其中單優(yōu)化型重組質(zhì)?？烧T導高水平的免疫應答，具有較好體液免疫原性，為后續(xù)進一步研究SFTSV NSs特異性保護功能奠定基礎，為大量NSs抗體的獲得、制備及進一步研究SFTSV非結構蛋白NSs的致病機制提供了有利條件。

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(本文編輯：呂新軍)

Construction of the recombinant plasmids encoding nonstructural proteins of SFTS virus and immunogenicity study

Ai Yujie, Han Yaping, Jin Ke, Yue Ming, Zhou Yiqing, Li Jun

First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China

Li Jun，Email：dr-lijun@vip.sina.com

Objective To study the construction and humoral immunogenicity of the recombinant plasmids encoding nonstructural proteins(NSs) of severe fever with thrombocytopenia syndrome(SFTS) virus(SFTSV). Methods Recombinant plasmids encoding NSs gene and optimized NSs gene of SFTSV were constructed by polymerase chain reaction(PCR) and cloned into eukaryotic expression vector pJW4303, which were named pJW4303-NSs and pJW4303-NSs-opt, respectively. Then, the plasmid pJW4303-NSs was tagged with Flag, named pJW4303-NSs-Flag. Meanwhile,NheI restrict site and tissue plasminogen activator(tPA) signal sequence were inserted to construct bi-optimized recombinant plasmid named pJW4303-tPA-NSs-opt. All plasmids were identified by sequencing. The transient expression of NSs was confirmed by Western blotting in human embryonic kidney 293T cells. The NSs-specific IgG antibodies in BALB/c mice which were immunized by intramuscular injection with electroporation were examined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Results The recombinant plasmids pJW4303-NSs, pJW4303-NSs-opt, pJW4303-tPA-NSs-opt and pJW4303-NSs-Flag were successfully constructed. The expression of NSs was confirmed in lysates and supernatants of 293T cells. The NSs-specific IgG responses of all three recombinant plasmids were detected by ELISA in BALB/c mice. It was found that optimized recombinant plasmid pJW4303-NSs-opt elicited higher levels of the NSs-specific IgG than that of pJW4303-NSs in week 6, 8 which induced stronger immune response. Conclusions The recombinant plasmids encoding SFTSV NSs possess the satisfied immunogenicity. In addition, the plasmid pJW4303-NSs-opt could induce the strongest humoral immune response.

Severe fever with thrombocytopenia syndrome(SFTS) virus; Nonstructural protein; Recombinant plasmid; Humoral immune response

李軍，Email: dr-lijun@ vip. sina. com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.013

SFTS病毒；非結構蛋白；重組質(zhì)粒；體液免疫應答

國家科技重大專項(2013ZX10002005-002-005)

2017-01-16)