王曉菲 賈潤(rùn)清 周玉柏 管永軍 曾毅

100124 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院藥物研究所(王曉菲、賈潤(rùn)清、周玉柏、管永軍、曾毅)；100052 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(曾毅)

·論著·

HIV-1中和抗體2G12真核表達(dá)載體的構(gòu)建及活性檢測(cè)

王曉菲 賈潤(rùn)清 周玉柏 管永軍 曾毅

100124 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院藥物研究所(王曉菲、賈潤(rùn)清、周玉柏、管永軍、曾毅)；100052 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(曾毅)

目的 構(gòu)建HIV-1中和抗體全基因共表達(dá)真核質(zhì)粒載體，觀(guān)察其在293T細(xì)胞中的表達(dá)并檢測(cè)其活性。方法 合成HIV-1中和抗體2G12 輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)，與含人IgG輕、重鏈恒定區(qū)的載體分別連接，構(gòu)建出完整的2G12輕鏈和重鏈的載體，通過(guò)PCR擴(kuò)增與連接將2G12輕、重鏈全長(zhǎng)構(gòu)建到真核表達(dá)載體pVR中，同時(shí)將內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal ribosome entry site, IRES)插入到此載體中構(gòu)建雙基因表達(dá)系統(tǒng)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，ELISA檢測(cè)抗體表達(dá)效果，通過(guò)結(jié)合實(shí)驗(yàn)及中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞上清的結(jié)合活性和中和活性。結(jié)果 獲得可表達(dá)人IgG的重組雙基因真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染后上清的抗體表達(dá)量為6.43 μg/ml，并且抗體保留了原來(lái)的結(jié)合活性和中和活性。結(jié)論 所構(gòu)建的載體可表達(dá)具有較好的結(jié)合活性和中和活性的抗體，本研究為真核表達(dá)載體表達(dá)人HIV中和抗體全基因方面提供了可選擇的平臺(tái)。

Fund programs: National Science and Technology Major Project of China(2012ZX10001005)

多數(shù)HIV感染者生活在發(fā)展中國(guó)家，且近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[1]。近年來(lái)，許多研究者報(bào)道獲得HIV治療性中和抗體[2,3]。本研究使用的中和抗體2G12識(shí)別的表位是gp120表面結(jié)構(gòu)保守的低聚甘露糖[4]，是碳水化合物特異性中和抗體。2G12具有較廣泛的中和能力，中和效力生理學(xué)濃度≤25 μg/ml。抗體晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，其兩個(gè)Fab形成了一個(gè)VH區(qū)交聯(lián)互換的二聚體，是與gp120結(jié)合的主要方式。

DNA疫苗在1998年第一次被用于艾滋病臨床治療，本實(shí)驗(yàn)所使用的DNA載體pVR在臨床使用上安全性較高，而且pVR載體在國(guó)內(nèi)已被批準(zhǔn)用于HIV疫苗臨床應(yīng)用。本研究旨在探索表達(dá)人IgG的雙基因表達(dá)載體的構(gòu)建，將普通啟動(dòng)子換成內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal ribosome entry site, IRES)序列，將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞檢測(cè)其表達(dá)情況，期望改造后的抗體能夠保持原有的結(jié)合活性和中和活性，為以后探索多載體聯(lián)合使用奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，以期能夠設(shè)計(jì)出在體內(nèi)安全并且高效表達(dá)中和抗體的疫苗，達(dá)到對(duì)HIV感染者治療的目的。

表1 擴(kuò)增目的基因和Linker的引物序列

1 材料與方法

1.1 材料 中和抗體2G12的VH、VK由大連寶生物工程有限公司合成(GenBank參考序列號(hào)：FJ444042), 所需引物由北京六合通生物技術(shù)有限公司合成。293T細(xì)胞和DH5α感受態(tài)均保存于本室，HIV假病毒由本室采用轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞方式獲得。限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司。Goat anti-Human kappa IgG、Goat anti-Human lambda IgG、Goat anti-Human IgG-Fc HRP購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 2G12-pVR/LIH的構(gòu)建AgeI、SalI-HF酶切PMD19T/2G12-VH、基于PBR322的克隆載體AbVec-hIgG1；AgeI、BsiWI酶切PMD19T/2G12-VK、基于PBR322的克隆載體AbVec-IgKappa，構(gòu)建重組質(zhì)粒AbVec-2G12-H、AbVec-2G12-L。PCR擴(kuò)增AbVec-2G12-Lc(712 bp)、AbVec-2G12-Hc(1 425 bp)、IRES(622 bp)序列，擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)膠回收，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，挑取單克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR酶切鑒定及測(cè)序鑒定，對(duì)鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，膠回收。構(gòu)建pVR/Linker45，將合成的Linker45與pVR空載體連接。上述膠回收的片段分別與pVR/Linker45連接，轉(zhuǎn)化挑取單克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR酶切鑒定及測(cè)序鑒定，最終獲得2G12-pVR/LIH載體。引物設(shè)計(jì)如表1：

1.3 2G12-pVR/LIH重組載體的表達(dá) 提前24 h將狀態(tài)良好的293T細(xì)胞接種于T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，同時(shí)設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)，采用5% CO2、37 ℃條件培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)基為10% FBS的DMEM，至細(xì)胞密度達(dá)80%～90%；2G12-pVR/LIH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑為FuGENE HD(瑞士Roche公司)，分別在轉(zhuǎn)染后48 h、76 h、96 h、120 h取少量細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。培養(yǎng)120 h后收集細(xì)胞上清進(jìn)行純化，離心后用0.22 μm濾器進(jìn)行過(guò)濾，用1 mmol/L Tris調(diào)節(jié)上清pH值至8.0，采用Nab(tm) protein A 柱(美國(guó)Thermo公司)親和純化獲得2G12抗體。

1.4 2G12抗體分子的Western blot鑒定 將純化的抗體使用4%～20%的預(yù)制膠進(jìn)行非還原SDS-PAGE電泳(120 V, 1 h)，陰性對(duì)照為pVR空載體，電泳結(jié)束后，使用半干電轉(zhuǎn)儀將抗體轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶4 ℃封閉過(guò)夜，以Goat Anti-Human IgG-AP為二抗(1∶500稀釋)，室溫孵育2 h，TBST洗膜，進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)抗體分子大小。

1.5 ELISA檢測(cè)2G12抗體表達(dá)及結(jié)合活性 抗體表達(dá)檢測(cè)方法，以Goat anti-Human kappa和Goat anti-Human lambda包被酶標(biāo)板，使用濃度為2 μg/ml，50 μl/孔，4 ℃過(guò)夜，洗板，洗液為PBST(含0.05% Tween的PBS，pH 7.5)。每孔加5%脫脂奶200 μl，置37 ℃溫箱封閉2 h，洗板。加入PBS稀釋的細(xì)胞上清及標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃放置1 h，洗板5遍。加入 1∶7500 稀釋的二抗Goat anti-Human IgG-Fc HRP，50 μl/孔，37 ℃孵育1 h，洗板，避光顯色，終止液終止顯色反應(yīng)，450/630 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度。

抗體結(jié)合活性檢測(cè)，采用終濃度為100 ng/孔的D7324抗體(愛(ài)爾蘭Aalto Bio Reagent公司)包被酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜，洗板，脫脂奶封閉 2 h，洗板，加入gp120，孵育1 h，洗板，加入細(xì)胞上清孵育1 h，洗板，加入二抗孵育1 h，洗板，顯色，檢測(cè)吸光度值。

1.6 HIV微量中和實(shí)驗(yàn) 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入稀釋到50 μg/ml的2G12抗體，25 μl/孔，加入稀釋好的假病毒，25 μl/孔，同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組，各組均設(shè)置3孔平行對(duì)照孔，陰性對(duì)照為含10% FBS的DMEM。37 ℃孵育1 h后加入TZM-bl細(xì)胞，細(xì)胞用DMAE-Dextran調(diào)整到濃度為2×105/ml，每孔加入50 μl細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)48 h，裂解細(xì)胞，Bright-Glo Luciferase Assay System(美國(guó)Promega公司)檢測(cè)熒光素酶活性(Relative luminescence units, RLU)。

2 結(jié)果

圖1 Western blot 鑒定抗體2G12∶2G12-pVR/LIHFig.1 Identification of antibody by Western blot

2.1 2G12抗體分子的Western blot鑒定 對(duì)所獲得的抗體進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，2G12泳道可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為150×103左右的條帶，與預(yù)期相符，且未見(jiàn)其他明顯雜帶，對(duì)照組泳道在相應(yīng)位置未見(jiàn)明顯條帶，表明構(gòu)建的2G12-pVR/LIH質(zhì)粒可以有效表達(dá)2G12全基因抗體，見(jiàn)圖1。2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系的表達(dá) 2G12-pVR/LIH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h、72 h、96 h、120 h分別取上清做ELISA檢測(cè)表達(dá)情況，結(jié)果顯示隨時(shí)間的增加，抗體的表達(dá)量逐漸上升，48 h檢測(cè)抗體表達(dá)量較低，72 h檢測(cè)抗體表達(dá)量為4.56 μg/ml，到120 h檢測(cè)抗體的表達(dá)量達(dá)到6.43 μg/ml。對(duì)表達(dá)的抗體進(jìn)行純化后獲得濃度為101 μg/ml的抗體。

2.3 2G12抗體結(jié)合活性檢測(cè) 取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清以捕獲ELISA檢測(cè)抗體的結(jié)合活性，結(jié)果表明不同稀釋濃度的細(xì)胞上清與gp120均可有效結(jié)合，抗體在0.6 μg/ml左右達(dá)到結(jié)合的高峰，在0.02 μg/ml時(shí)結(jié)合活性很弱，且結(jié)合活性與抗體濃度呈正相關(guān)，見(jiàn)圖2。

圖2 抗體結(jié)合能力檢測(cè)Fig.2 Detection of antibody binding capacity

2.4 表達(dá)2G12抗體中和活性的檢測(cè) 采用純化后的單克隆抗體2G12分別與4種不同亞型的9種HIV假病毒(包括CRF07-BC亞型S19-15和22-5，CRF08-BC亞型GX75-20和189-52，B亞型QH0692.42、SF162和TR0.11，C亞型Du422.1和ZM53M.PB12)在TZM-bl 細(xì)胞中進(jìn)行中和活性檢測(cè)，對(duì)CRF07-BC亞型S19-15和B亞型SF162的IC50分別是0.83 μg/ml和3.15 μg/ml，對(duì)其他7種假病毒株的IC50都大于25 μg/ml,結(jié)果顯示表達(dá)的抗體對(duì) CRF07-BC 亞型假病毒 S19-15 和B亞型假病毒 SF162 有中和活性。

3 討論

在HIV的感染過(guò)程中，機(jī)體產(chǎn)生的針對(duì)HIV的中和抗體可以通過(guò)中和游離的病毒顆粒起到抗病毒作用，同時(shí)也可以作用于被HIV感染的細(xì)胞，從而達(dá)到控制HIV感染的目的。近年來(lái)，隨著對(duì)HIV-1包膜糖蛋白結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)的逐漸深入，以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)被動(dòng)免疫的研究，中和抗體在控制HIV-1感染方面的作用越來(lái)越清楚，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)中也都表現(xiàn)出了良好的效果，特別是Caskey等[5]報(bào)道的一類(lèi)叫做3BNC117的HIV抗體，I期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示該抗體具有非常好的病毒中和活性，部分受試者一周內(nèi)病毒載量下降到最低水平，證明中和抗體治療是有效的治療方法。隨著中和抗體的研究越來(lái)越深入，如何使中和抗體在體內(nèi)獲得安全高效的表達(dá)，從而達(dá)到部分或完全中和體內(nèi)病毒的目的，一直是中和抗體研究非常重要的問(wèn)題。同一載體上同時(shí)表達(dá)兩個(gè)或者多個(gè)外源基因在生物學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，通過(guò)在雙基因之間插入IRES序列構(gòu)建合適的載體從而獲得兩個(gè)或者多個(gè)外源基因的高效轉(zhuǎn)移與表達(dá)。IRES序列源于某些病毒和細(xì)胞的 mRNA 5′ 端的一段非翻譯區(qū)[6]。在上游啟動(dòng)子的控制下，IRES 序列能和與之相連的基因進(jìn)行同時(shí)轉(zhuǎn)錄。本研究探索通過(guò)IRES原件的引入嘗試構(gòu)建表達(dá)2G12的雙基因表達(dá)載體獲得成功。

本研究通過(guò)構(gòu)建雙基因表達(dá)載體成功的表達(dá)了2G12，表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)中和活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其活性與已公布數(shù)據(jù)相近[7]，保持了原有的生物活性，目前國(guó)內(nèi)尚未有采用引入IRES原件表達(dá)HIV中和抗體雙基因的文獻(xiàn)報(bào)道，這可以為以后構(gòu)建表達(dá)人IgG的雙基因表達(dá)載體奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)所使用的DNA載體pVR的抗性基因是卡那霉素，在臨床使用比較安全，并且能夠防止抗性基因整合到人基因組中而產(chǎn)生抗生素的耐藥性，pVR載體在國(guó)內(nèi)已被批準(zhǔn)用于HIV疫苗的臨床應(yīng)用。本研究中選擇DNA載體作為表達(dá)中和抗體的工具主要原因是其免疫原性低的特點(diǎn)，在探索載體聯(lián)合使用方面具有非常重要的意義，后期本課題組將繼續(xù)探索表達(dá)人IgG的雙基因表達(dá)策略，以期能夠獲得外源基因在體內(nèi)的高效持續(xù)表達(dá)。

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(本文編輯：呂新軍)

Construction of HIV-1 broadly neutralizing antibody gene eukaryotic expression vector and detection of its biological function

Wang Xiaofei, Jia Runqing, Zhou Yubai, Guan Yongjun, Zeng Yi

Institute of Materia Medica,College of Life Science and Bioengineering,Beijing University of Technology, Beijing 100124, China(Wang XF, Jia RQ, Zhou YB, Guan YJ, Zeng Y); State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100052, China(Zeng Y)

Jia Runqing, Email:nmjrq520@163.com；Guan Yongjun, Email: guanyj12@gmail.com；Zeng Yi, Email:zengyicdc@sina.com

Objective To construct a recombinant double gene co-expressing plasmid of HIV-1 broadly neutralizing antibody and to detect its expression in 293T cell line. Methods HIV-1 neutralizing antibody 2G12 variable region of light chain (VL) and heavy chain (VH) was synthesized, and ligated with vectors containing human IgG constant regions of light and heavy chain to construct a complete 2G12 light and heavy Chain. The VL and VH of 2G12 and IRES were cloned into eukaryotic expression vector pVR by PCR amplification and then the recombinant plasmid was transfected into 293T cells. Expression of the antibody in cell supernatant was detected by ELISA. Binding and neutralizing activity of the cell supernatant were tested by ELISA and micro-neutralization assays. Results The recombinant double gene eukaryotic expression vector which can express human IgG was constructed successfully. The expression level of the supernatant was 6.43 μg/ml, and the antibody retained the binding and neutralizing activity. ConclusionsThe constructed vector can express the antibody with binding and neutralizing activity, this study provides a good platform for the expression of human HIV neutralizing antibody in the eukaryotic expression vector.

HIV; Neutralizing antibody; DNA vector

賈潤(rùn)清，Email:nmjrq520@163.com；管永軍，Email: guanyj12@gmail.com；曾毅，Email:zengyicdc@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.004

HIV；中和抗體；DNA載體

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2012ZX10001005)

2016-11-01)