徐 磊，馬金龍

（1.大連市標準化研究院，大連 116001；2.大連民族學院生命科學學院，大連 116601）

基于人工囊泡研究跨膜蛋白的結構和功能綜述

徐 磊1，馬金龍2

（1.大連市標準化研究院，大連 116001；2.大連民族學院生命科學學院，大連 116601）

綜述近年來利用脂質體人工囊泡對跨膜蛋白在結構和功能方面的研究成果和方法，分類介紹了合成多肽片段的實驗方法、融膜多肽及細胞穿膜肽的融膜機理，并通過疏水片段整合跨膜蛋白結構及功能的研究方法。

脂質體；人工囊泡；跨膜蛋白；結構功能

膜蛋白大約占細胞總蛋白質的30%，在細胞轉運、胞內信號轉導和生長調節(jié)方面起到重要作用。根據(jù)其與脂質分子的結合方式，膜蛋白分為整合蛋白（即跨膜蛋白）、外周蛋白和脂質錨定蛋白。盡管膜蛋白在生命科學中占有重要地位，但因其難以大量表達且在體外難以保持活性而僅有少量研究比較透徹。為了維持膜蛋白的疏水結構和蛋白質活性，目前多以脂質和去垢劑整合膜蛋白，進行膜蛋白的研究。而將跨膜蛋白整合到囊泡上進行結構和功能研究則是膜蛋白研究的熱點。

近年來國外有許多專家學者對跨膜蛋白利用脂質體囊泡進行結構和功能方面的研究，在結構方面的研究有：Ca-ATP酶整合到脂質體囊泡通過NMR技術研究其結構[1]，通過固相NMR技術研究流感病毒蛋白在脂質體囊泡上的定向[2]，線粒體ATP合成酶重組脂質體囊泡進行結構研究[3]。在功能方面的研究有：抗體修飾脂質體囊泡與抗原作用研究，大腸桿菌PagP蛋白整合到脂質體囊泡,瘋牛病病毒蛋白通過糖基磷脂酰肌醇整合到固定脂質體囊泡上，質子泵跨膜蛋白整合研究，低密度脂蛋白受體整合，鈉離子通道蛋白，降鈣素蛋白，細胞色素C氧化酶，Na-K ATP酶，非肌肉組織肌動蛋白，陽離子通道RIP蛋白，ATP合成酶，細菌視紫紅質，Ca-ATP酶,天門冬氨酸受體蛋白，谷氨酸轉運蛋白研究[4]。在這里對近年來利用人工囊泡研究跨膜蛋白結構和功能的進展做一概述。

1 跨膜蛋白與脂質體囊泡的結構

1.1 跨膜蛋白的結構

跨膜蛋白在結構上主要分為兩大類：一種是跨膜區(qū)結構為α-螺旋(alpha-helix)，TM H(Transmembrane alpha-helical)；一種跨膜區(qū)-桶狀(beta-barrel)結構，即TMB(Transmembrane betabarrel)。目前發(fā)現(xiàn)，除細菌和線粒體外膜蛋白的跨膜部分折疊成β桶狀結構外，其它大多數(shù)的跨膜區(qū)均為α-螺旋結構，有一個或更多的α-螺旋構型的疏水片段形成跨膜結構，一個α-螺旋結構約含有15～25個氨基酸。膜蛋白可以通過疏水性、氫鍵和雙極性與脂雙層和水界面作用，脂雙層影響膜蛋白的結構，進而調控蛋白的活性，綜述[5-6]詳細介紹了脂雙層厚度對膜蛋白結構和組織的影響,包括多肽長度與脂雙層厚度的正、負不匹配的研究，多肽中氨基酸殘基側鏈與雙親性脂分子的相互作用以及對多肽構型的影響[5]。一級結構中氨基酸序列決定其是否跨膜和與膜內其他螺旋如何作用。疏水氨基酸殘基傾向于形成跨膜結構，而極性和可電離氨基酸殘基則會導致跨膜結構的不穩(wěn)定，例如脯氨酸，然而這樣的氨基酸也存在于許多跨膜序列中，而且在膜蛋白結構和功能中起到重要的作用。極性氨基酸可以通過形成氫鍵降低插膜所需能量，可電離氨基酸通過非電離狀態(tài)或形成鹽橋來降低在埋藏于脂雙層中所需能量消耗[6]。

1.2 脂質體囊泡的結構

脂質體囊泡根據(jù)其結構一般分為小單層囊泡(small unilamellar vesicle, SUV)、多層囊泡(multilayervesicle, MLV)、巨大單層囊泡(giant unilamellar vesicle,GUV)和多囊脂質體囊泡(multivesicular liposome, MVL)等。單層囊泡是由一層脂質雙分子層構成的囊泡結構，直徑為幾十～幾百nm；多層囊泡是指由若干層脂質雙分子層構成的囊泡，直徑一般在幾百nm；巨大單層囊泡和單層囊泡結構相同，但直徑可以從幾到幾十μm，可以方便地使用光學顯微鏡進行觀察；多囊脂質體囊泡是指由若干個單層或多層囊泡組成的復合囊泡，其直徑可達幾百μm，在一個大囊泡體系中包含若干個小囊泡[7]。由于囊泡的結構與細胞膜結構相似，在生物膜模擬、藥物的封裝和靶向釋放、納米粒子的合成以及用作微反應器等方面有著重要的應用價值，因此囊泡成為近年來一個熱門話題[8-10]。構成囊泡的物質要求具有雙親性（既有親水的頭部，又有疏水的尾部），如磷脂類（分為天然磷脂和合成磷脂）、非離子表面活性劑、嵌段共聚物等。生物膜主要由鑲嵌著各種蛋白質分子的磷脂雙分子層構成，各種組成分子按照一定的規(guī)律有序地排列在一起，擔負起復雜的生物機能。

2 跨膜蛋白整合到囊泡的方法

2.1 直接法

在囊泡形成過程中，直接進行蛋白整合，比如薄膜法和逆向蒸發(fā)法過程中，在水相直接將可溶或微溶蛋白加入，再進行脂質體的制作。此方法傾向于可溶性蛋白，對大多數(shù)膜蛋白來說并不適用。

2.2 化學法

采用去垢劑，跨膜蛋白因含有跨膜疏水區(qū)在水溶液中一般為聚集狀態(tài)，然而去垢劑可以用來屏蔽疏水區(qū)，使得膜蛋白很好地整合到囊泡中，之后將去垢劑去除即可，去除方法為透析、疏水樹脂或膠珠吸收、凝膠色譜分離、離子交換色譜分離等（圖1）[11-12]。一般采用稀釋、透析或疏水吸附等方法，將復合體系中的去垢劑去除，進行膜蛋白和囊泡的整合，此方法難點在于掌握去除去垢劑的速度和去垢劑的使用濃度，不同種類蛋白質和膜體系有不同要求，一般規(guī)律可參看圖1，膜蛋白在和囊泡的不同結合形態(tài)其光吸收數(shù)值會有不同，常常通過這個指標完成體系整合，因為絕大多數(shù)膜蛋白疏水性較強。而且此方法所需條件溫和，可以很好地保持膜蛋白的天然結構和活性，所以得到廣泛應用和發(fā)展。

2.3 物理法

可以采用超聲法和反復凍融法，超聲法是將組成囊泡的膜蛋白和蛋白質混合物進行超聲處理，對超聲頻率和間歇時間都有一定要求。對于對超聲和去垢劑、有機溶劑不穩(wěn)定的蛋白質，可將囊泡與跨膜蛋白混合后反復進行凍融處理，也能達到整合的效果。采用凝膠色譜、超速離心、蔗糖密度梯度離心等方法分離囊泡和其他物質，尤其是蔗糖密度梯度離心法常用來分離跨膜蛋白和脂質體囊泡的復合物，而凝膠色譜法和超速離心法多用來分離脂質體囊泡和未包封的小分子物質。

圖1 跨膜蛋白通過去垢劑輔助整合到脂質體囊泡的步驟圖示（左圖橫坐標為去垢劑濃度，縱坐標為目標溶液的光吸收數(shù)值；1表示去垢劑與囊泡融合的初始濃度，2表示去垢劑輔助整合的最大臨界濃度。）

3 脂質體囊泡在研究跨膜蛋白結構和功能上的應用

將脂質體囊泡應用在研究跨膜蛋白的結構和功能上，具有重要意義。首先，將膜蛋白正確整合到囊泡上，可以進行轉運和催化功能方面的研究而不受其他膜組分的干擾。其次，大量的膜蛋白整合到囊泡上可形成晶體結構，進行膜蛋白二維結構的研究，解決了疏水性膜蛋白無法在水溶液中形成晶體結構和天然構象的問題。

3.1 合成的疏水多肽片段

因合成多肽方法的改進和操作的可行性，合成多肽片段是研究跨膜蛋白作用簡便且有效的實驗方法，可以任意定點改變各種氨基酸殘基，進而研究一級結構中氨基酸種類對多肽的二級結構乃至蛋白質的三級結構和功能進行研究，一直以來是研究蛋白質結構和功能的重點。

合成亮氨酸疏水片段，并通過氨基酸替換研究多肽與脂雙層的作用[13]，天冬酰胺在跨膜螺旋中作用[14]，天冬氨酸在跨膜和非跨膜螺旋構象中的作用[15]，荷正電和負電氨基酸殘基在跨膜螺旋中的不同作用[16]，芳香族氨基酸在跨膜結構中的作用[17]，賴氨酸在跨膜螺旋中的作用[18]，合成聚丙氨酸多肽插膜和定向研究[19]，研究合成疏水多肽α-螺旋跨膜定向受長度及脂雙層厚度和膽固醇濃度的影響[20]，通過肽段長度控制跨膜定向及膜內螺旋的相互作用[21]，合成螺旋多肽折疊和跨膜研究[22]，堿性兩親α-螺旋多肽與酸性和中性脂質體囊泡作用研究[23]，接有PEG的多肽插膜研究[24]，親水氨基酸對跨膜螺旋橫向位置的影響[25]，合成多肽插膜機理研究[26]，通過DSC檢測研究合成多肽PADH對膜熱力學性質的影響[27]，跨膜多肽螺旋構型的插膜能量依賴于膜的組成[28]。

3.2 融膜多肽及細胞穿膜肽的研究

融膜多肽是一類可以改變細胞膜雙層結構曲率變化的多肽，包括病毒產(chǎn)生的抗菌多肽和動植物分泌的毒素，例如蛇毒、峰毒等，通過與細胞膜結合而插入細胞膜，改變細胞膜中脂質雙層結構曲率的變化，進而導致細胞膜通透性增加，使細胞凋亡。今年來，通過與脂質體囊泡在體外的相互作用，研究其融膜機理，稱為這方面的研究熱點。例如：合成Bcl-2蛋白C端多肽與脂質體作用導致囊泡包封物的泄露研究[29]，全新合成融膜多肽與脂質體囊泡表面嵌合的研究[30]，溶血素E蛋白頭部N端添加7個疏水性氨基酸殘基增強其跨兩性脂膜的能力[31]，合成泡沫病毒融膜多肽對脂質體囊泡的影響[32]，合成融膜肽從脂質體囊泡內部促使膜融解的研究[33]等等。

細胞穿膜肽（CPP）是一類能攜帶大分子物質進入細胞的短肽，其穿膜能力不依賴經(jīng)典的胞吞作用，經(jīng)過對天然存在的細胞穿膜肽的生物化學性質研究，已經(jīng)逐漸掌握了細胞穿膜肽的一些共有特性，這類物質均為帶有正電荷的長短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基，二級結構皆具有α-螺旋的空間構象。利用這些特性，目前已人工合成了穿透力更強、效率更高的穿膜肽PEp-1、MPG，并且成功地攜帶大分子物質進入細胞發(fā)揮生物學活性，因而引起廣大科學家研究的熱情。大多在體外以脂質體囊泡作為模擬細胞研究細胞穿膜肽，如合成PenArg, PenLys和Pen2W2F穿膜肽與脂質體囊泡的作用[34]，合成TatP59W, TatLys-P59W和R7W穿膜肽，研究與不同直徑脂質體囊泡的作用[35]，合成β七肽衍生物與脂質體囊泡作用[36]。

3.3 通過疏水片段研究其蛋白結構及功能

通過基因工程和蛋白質工程的研究，可以得到要研究功能蛋白的一級結構序列和對應的基因序列，科研工作者已經(jīng)總結出來大量蛋白質的一級結構序列并構建了蛋白質數(shù)據(jù)庫。除將目的蛋白通過大量表達提純外，也可以選擇部分功能片段進行人工合成來對跨膜蛋白的結構和功能進行推測，目前主要的研究成果如表1。

表1 利用脂質囊泡與跨膜功能蛋白中的疏水片段整合研究蛋白結構及功能一覽

4 展望

膜蛋白尤其是跨膜蛋白在細胞新陳代謝及信號轉導中起到?jīng)Q定性作用，也是當今科學研究的重點和難點，但因其疏水性強，在表達、結構分析以及功能研究方面困難重重。而利用脂質囊泡體系構建仿生環(huán)境在膜蛋白研究領域開辟了一個嶄新的途徑，也突破了很多膜蛋白研究的瓶頸，例如膜蛋白表達對細胞毒性的影響、膜蛋白三維結構的復位及生物活性的保留、膜蛋白功能的研究等。隨著新材料、新技術的出現(xiàn)，通過與脂質囊泡研究的結合和改進，不僅可以用來作為膜蛋白研究的工具，未來更可以出現(xiàn)人工仿生細胞，不僅在膜蛋白研究領域占有重要地位，更將為未來的細胞仿生學等多個領域作出貢獻。

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Overview of Research on the Structure and Function of Transmembrane Proteins based on Artificial Vesicles

XU Lei1, MA Jin-long2
(1. Dalian City Institute of Standardization, Dalian, Liaoning 116001, China; 2. Life Science College, Dalian Nationalities University, Dalian, Liaoning 116601, China)

This review focuses on the recent research results and methods on the structure and function of transmembrane protein with the use of liposome artificial vesicles. And it classifies the experiment methods of synthetic peptide fragments, and the mechanism of melt membrane polypeptides and cell penetrating peptides. It tries to review the structure and function of transmembrane protein based on hydrophobic fragment.

liposome; artificial vesicles; transmembrane protein; structure function

Q51

A

1672-6286(2017)02-0058-09

徐磊，男，高級工程師，主要從事生物技術標準體系建設研究工作。