張龍真, 郭 佳,2, 顧 華, 房健民(.同濟(jì)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,上海 200092; 2.煙臺(tái)榮昌制藥股份有限公司,山東 煙臺(tái) 264006)

重組抗c-Met嵌合抗體的構(gòu)建及其利用慢病毒快速表達(dá)

張龍真1, 郭 佳1,2, 顧 華1, 房健民1
(1.同濟(jì)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,上海 200092; 2.煙臺(tái)榮昌制藥股份有限公司,山東 煙臺(tái) 264006)

文章采用兼并引物逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)從特異性分泌抗人c-Met阻斷型單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3E1D7中擴(kuò)增抗體重、輕鏈可變區(qū)基因(VH和VL)。通過(guò)重疊延伸PCR(splice overlap extension PCR,SOE-PCR)方法分別將鼠源VH與人IgG1的重鏈恒定區(qū)基因Cγ1相連,鼠源VL與人IgG1的輕鏈恒定區(qū)基因Cκ相連獲得嵌合抗體重鏈基因(H)和輕鏈基因(L)。將嵌合抗體重、輕鏈基因連接到慢病毒表達(dá)載體中,經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定成功構(gòu)建了慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pRRL-CMV-ch3E-H和pRRL-CMV-ch3E-L。磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,表達(dá)的嵌合抗體經(jīng)Protein A Sepharose 4B親和層析柱純化,通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)抗體的完整性,ELISA法檢測(cè)嵌合抗體的特異性抗原結(jié)合活性及人源性。感染慢病毒的293T細(xì)胞上清純化后,經(jīng)SDS-PAGE分析,可見(jiàn)25 kDa嵌合抗體輕鏈和50 kDa的嵌合抗體重鏈蛋白。且純化后的嵌合抗體能夠與c-Met抗原特異性結(jié)合成功獲得重組抗人c-Met嵌合抗體,該抗體減少了鼠源成分,降低了免疫原性,利用慢病毒可以快速獲得大量重組抗體蛋白,為該抗體藥物的體內(nèi)外評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

抗人間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子;肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子;嵌合抗體;慢病毒表達(dá)載體;生物學(xué)活性

人間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(c-Mesenchymal epithelial transition factor,c-Met)是一類具有自主磷酸化活性的跨膜受體,屬于酪氨酸激酶受體超家族成員,也是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)已知的唯一受體[1]。其被受體激活后介導(dǎo)細(xì)胞信息傳遞,調(diào)控細(xì)胞骨架重排,是細(xì)胞增殖、分化和運(yùn)動(dòng)的重要調(diào)節(jié)因素。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),c-Met在我國(guó)發(fā)病率較高的肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、腦膠質(zhì)瘤等腫瘤組織中呈現(xiàn)異常高表達(dá)、突變或活性改變[2-5]。且HGF/c-Met信號(hào)通路的激活程度與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[6-7]。目前,c-Met已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研究的一個(gè)重要靶點(diǎn)。2011年8月,第1個(gè)c-Met激酶抑制劑藥物克唑替尼膠囊(crizotinib)獲得FDA批準(zhǔn)用于治療晚期和ROS1陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌[8]。目前,還沒(méi)有FDA批準(zhǔn)的抗c-Met的中和抗體藥物。傳統(tǒng)鼠源抗體在人體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)(human anti-mouse antibody,HAMA),且不能有效地活化補(bǔ)體和Fc受體相關(guān)的免疫效應(yīng),抑制了其臨床應(yīng)用。而基因工程改造后的人鼠嵌合抗體很好地解決了該問(wèn)題[9]。本研究在獲得阻斷HGF與c-Met結(jié)合的中和抗體3E1D7基礎(chǔ)上,對(duì)其進(jìn)行人源化結(jié)構(gòu)改造。構(gòu)建、表達(dá)了抗人c-Met的人-鼠嵌合抗體ch3E1D7,并對(duì)其結(jié)構(gòu)和活性進(jìn)行分析,為研制靶向c-Met的抗腫瘤抗體藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞

HEK293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;克隆載體pCR-Blunt購(gòu)自Invitrogen公司;感受態(tài)大腸桿菌DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;分泌抗c-Met中和抗體的雜交瘤細(xì)胞株3E1D7、慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pRRL-CMV、質(zhì)粒pcDNA3.1-Cκ(含有人IgG1輕鏈恒定區(qū)基因Cκ)和質(zhì)粒pcDNA3.1-IgG1(含有人IgG1重鏈恒定區(qū)基因Cγ1)均為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑

各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Taq酶、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及DNA marker均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自MN公司;無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Promega公司;TRIzol總RNA提取試劑購(gòu)自Invitrogen公司;DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Gibco公司;商品化人c-Met胞外區(qū)重組蛋白購(gòu)自R&D公司;羊抗人IgG-HRP購(gòu)自sigma;Protein A Sepharose 4B 購(gòu)自美國(guó)Pharmacia公司。本研究中所用引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,引物名稱及序列見(jiàn)表1所列。

表1 引物名稱及序列

1.3 親本基因的擴(kuò)增及測(cè)序

TRIzol法從分泌抗人c-Met的雜交瘤細(xì)胞株3E1D7中提取細(xì)胞總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以合成的cDNA為模板,分別利用引物P1、P2和P3、P4擴(kuò)增鼠單抗3E1D7的重、輕鏈可變區(qū)VH和VL基因。同時(shí),以質(zhì)粒pcDNA3.1-IgG1為模板,以P5、P6為引物擴(kuò)增出人IgG1重鏈恒定區(qū)基因Cγ1。以質(zhì)粒pcDNA3.1-Cκ為模板,以P7、P8為引物擴(kuò)增出人IgG1輕鏈恒定區(qū)基因Cκ。擴(kuò)增條件為:98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性15 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,32個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min。將上述擴(kuò)增基因分別連入克隆載體pCR-Blunt中,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,送蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4 嵌合抗體完整重、輕鏈基因的擴(kuò)增

利用P9、P10和P11、P12引物,通過(guò)重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)連接鼠源可變區(qū)基因與人源恒定區(qū)基因,得到完整的嵌合抗體重、輕鏈基因。再次克隆測(cè)序鑒定,分別得到含有嵌合抗體完整重鏈的質(zhì)粒pCR-Blunt-ch3E-H和完整輕鏈的質(zhì)粒pCR-Blunt-ch3E-L。

1.5 嵌合抗體慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

分別將pCR-Blunt-ch3E-H和pCR-Blunt-ch3E-L質(zhì)粒用AgeⅠ和SalⅠ雙酶切,同時(shí)用AgeⅠ和SalⅠ酶切慢病毒表達(dá)載體pRRL-CMV。用T4連接酶將目的片段和慢病毒表達(dá)載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α,篩選陽(yáng)性克隆,對(duì)獲得慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pRRL-CMV-ch3E-H和pRRL-CMV-ch3E-L進(jìn)行酶切及DNA序列測(cè)定。

1.6 嵌合抗體在293T細(xì)胞中的表達(dá)

1.6.1 綠色熒光蛋白的表達(dá)

接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞,待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～60%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。嵌合抗體組將5.4 μg慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锖?.0 μg慢病毒表達(dá)質(zhì)粒(pRRL-CMV-ch3E-H與pRRL-CMV-ch3E-L各為2.5 μg)用基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸至84 μL,利用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。同時(shí),以含有綠色熒光蛋白的空載體(pRRL-CMV-GFP)作為陽(yáng)性對(duì)照,以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293T細(xì)胞作為空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h后病毒包裝成功,換完全DMEM培養(yǎng)基,加入工作濃度的助感染劑polybrene,以利于病毒顆粒進(jìn)一步感染293T細(xì)胞。感染24 h后通過(guò)熒光顯微鏡觀察慢病毒感染后的293T細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

1.6.2 檢測(cè)H、L鏈基因mRNA的表達(dá)

收集感染后24 h的293T細(xì)胞,TRIzol法提取總RNA,將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR法鑒定嵌合抗體在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。以P9、P6為上、下引物擴(kuò)增嵌合抗體重鏈基因片段,以P11、P8為上、下游引物擴(kuò)增嵌合抗體輕鏈基因片段。

1.7 嵌合抗體的純化

收集293T細(xì)胞培養(yǎng)上清液,將其經(jīng)0.45 μm的濾膜過(guò)濾。將濾過(guò)的培養(yǎng)液與PBS緩沖液等體積混合,采用Protein A Sepharose 4B親和層析柱純化,操作方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將收集的洗脫液進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳分析。BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 嵌合抗體ch3E1D7生物學(xué)活性檢測(cè)

ELISA法檢測(cè)抗體活性。將人c-Met胞外區(qū)重組蛋白按照每孔200 ng進(jìn)行過(guò)夜包被,次日封閉后,加入倍比稀釋的嵌合抗體ch3E1D7。以親本鼠源抗體作為對(duì)照,37 ℃孵育2 h,PBST洗板3次,每次5 min,再加入HRP標(biāo)記的羊抗人IgG Fc片段,37 ℃孵育1 h,顯色,測(cè)定OD450數(shù)值。該值為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果分析

2.1 表達(dá)載體構(gòu)建鑒定

利用設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增單克隆抗體3E1D7的重、輕鏈可變區(qū)VH和VL基因及人IgG1重鏈恒定區(qū)Cγ1基因和輕鏈恒定區(qū)Cκ基因，如圖1所示。1.5%瓊脂糖凝膠結(jié)果顯示,鼠源VH和VL基因的PCR產(chǎn)物分別可見(jiàn)約400、370 bp的特異性條帶,人源Cγ1和Cκ基因的PCR產(chǎn)物可見(jiàn)約1 000、350 bp的特異性條帶,大小均與理論值相符。且鼠源VH和VL基因測(cè)序后,通過(guò)與Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)比較,確定無(wú)論是在基因序列還是氨基酸序列上均具有唯一性。說(shuō)明成功擴(kuò)增克隆抗體3E1D7的VH和VL基因及人IgG1的Cγ1和Cκ基因。通過(guò)重疊延伸PCR拼接,分別將鼠VH與人IgG1的Cγ1、VL與人IgG1的Cκ連接起來(lái)形成完整的嵌合抗體H鏈和L鏈。測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建了嵌合抗體H鏈基因和L鏈基因,H鏈基因大小為1 410 bp,輕鏈大小為723 bp。通過(guò)AgeⅠ和SalⅠ酶切H、L鏈和慢病毒表達(dá)載體pRRL-CMV,獲得慢病毒表達(dá)質(zhì)粒p RRL-CMV-ch3E-H和p RRL-CMV-ch3E-L,酶切及PCR鑒定結(jié)果如圖1c所示。酶切后條帶大小與預(yù)期條帶相符,表明慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。圖1中，M表示DNA marker。

圖1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 感染細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察

感染后24 h,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),嵌合抗體組及陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞均有綠色熒光蛋白。未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白對(duì)照293T細(xì)胞則無(wú)熒光表達(dá)，如圖2所示，圖2中，熒光顯微鏡的放大倍數(shù)100倍。初步證明慢病毒表達(dá)體系快速產(chǎn)生了嵌合抗體蛋白。

圖2 嵌合抗體慢病毒感染293T細(xì)胞

2.3 轉(zhuǎn)錄水平鑒定嵌合抗體重、輕鏈基因的表達(dá)

1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,嵌合抗體組293T細(xì)胞中有大小約1 400 bp的嵌合抗體重鏈基因片段和大小約700 bp的嵌合抗體輕鏈基因片段,如圖3所示。測(cè)序結(jié)果表明,目的條帶為編碼嵌合抗體重鏈、輕鏈的基因序列。

圖3 RT-PCR鑒定c-Met嵌合抗體重、輕鏈的表達(dá)

2.4 SDS-PAGE分析

通過(guò)Protein A純化得到的c-Met嵌合抗體經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果顯示蛋白純化效果較好,無(wú)明顯雜帶?？梢?jiàn)分子質(zhì)量分別約為25 kDa和50 kDa的蛋白條帶,與理論值一致,表明純化得到的蛋白是完整的嵌合抗體,如圖4所示。圖4中,M表示蛋白marker;lane1表示細(xì)胞培養(yǎng)原液;lane2表示濾過(guò)液;lane3表示純化后的嵌合抗體ch3E1D7。

圖4 嵌合抗體ch3E1D7的還原性SDS-PAGE檢測(cè)

2.5 嵌合抗體生物學(xué)活性檢測(cè)

用商品化人c-Met胞外區(qū)重組蛋白包被酶標(biāo)板,用HRP標(biāo)記的羊抗人IgG為二抗,進(jìn)行ELISA檢測(cè)。加入純化后的嵌合抗體呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng),且隨著質(zhì)量濃度的增加,信號(hào)逐漸增強(qiáng)。而加入鼠源親本抗體則呈陰性反應(yīng)。表明嵌合抗體可與人c-Met抗原特異性結(jié)合,同時(shí)具有人抗體的恒定區(qū),如圖5所示。

圖5 ELISA檢測(cè)嵌合抗體與人HGFR的結(jié)合活性

3 討 論

c-Met是由c-Met原癌基因編碼的蛋白產(chǎn)物,為HGF的細(xì)胞膜受體。HGF與c-Met結(jié)合使其構(gòu)象發(fā)生改變,自身磷酸化激酶區(qū)域內(nèi)的Tyrl235和Tyrl234,繼而導(dǎo)致位于C末端的Tyrl349和Tyrl356磷酸化,啟動(dòng)接頭蛋白停泊位點(diǎn),導(dǎo)致多種底物蛋白的酪氨酸磷酸化,包括生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白(growth factor receptor-bound protein 2,Grb2)及其相關(guān)蛋白(Grb2-associated binder,Gab1)、粘著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路和磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)信號(hào)通路[10-11]。在腫瘤細(xì)胞中,c-Met持續(xù)性高表達(dá),使得該信號(hào)通路處于持續(xù)活化狀態(tài),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

一旦腫瘤細(xì)胞中異常活化的HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)被阻斷,腫瘤細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞增殖減緩、血管生成抑制、侵襲能力下降等一系列變化[12]。文獻(xiàn)[13]證實(shí)c-Met激酶抑制劑明顯抑制人肝癌細(xì)胞增殖,推測(cè)抑制c-Met激酶活性可能是抗肝細(xì)胞肝癌藥物研究與開(kāi)發(fā)的合理策略。文獻(xiàn)[14]證實(shí)阻斷HGF與c-Met結(jié)合的單克隆抗體onartuzumab(OA-5D5)明顯抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)增殖,裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率、微血管密集度均下降。因此篩選阻斷HGF與c-Met結(jié)合的中和抗體尤為重要。

本研究已獲得阻斷HGF與c-Met結(jié)合的中和抗體3E1D7,但是為了克服鼠源單抗治療人體疾病所引起的HAHA反應(yīng),需要對(duì)鼠源單抗進(jìn)行人源化結(jié)構(gòu)改造。多項(xiàng)研究表明,人鼠嵌合抗體在保留鼠源單抗親和力和特異性的同時(shí),大大降低了單抗的免疫原性,具有極大的成藥潛力[15-17]。目前,治療B淋巴細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的利妥昔單抗、抗風(fēng)濕藥物英利昔單抗均為人鼠嵌合抗體。本研究結(jié)果表明,人鼠嵌合抗體在保留鼠源親本抗體活性的基礎(chǔ)上,減少了鼠源成分,降低了免疫原性,為研制安全、有效性的抗c-Met抗體藥物奠定基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯 閆杏麗)

Construction of chimeric anti-c-Met antibody and its rapid expression using lentiviral vector

ZHANG Longzhen1, GUO Jia1,2, GU Hua1, FANG Jianmin1

(1.School of Life Sciences and Technology, Tongji University, Shanghai 200092, China; 2.Yantai Rongchang Pharmaceutical Co., Ltd., Yantai 264006, China)

The variable region of the heavy chain(VH) and light chain(VL) genes were amplified directly from the cDNA of 3E1D7 hybridoma cells which secreted mouse anti-human c-Mesenchymal epithelial transition factor(c-Met) antibody using the reverse transcription PCR(RT-PCR). Full length chimeric IgG was assembled by fusing the VHand VLwith the constant region of human heavy and light chains(IgG1 Cγ1 and Cκ) respectively using the splice overlap extension PCR(SOE-PCR). The constructed chimeric antibody heavy chain(H) and light chain(L) were inserted into the lentiviral transfer plasmid pRRL-CMV respectively, which were identified by the restriction enzyme digestion and sequencing. The lentiviral expression vectors were transfected into 293T cells with lentiviral packaging plasmid and the transfected cell pool was used to produce the recombinant antibody. The expressed chimeric antibody was purified by Protein A Sepharose 4B affinity chromatography, then identified by reduced SDS-PAGE and its biological affinity was determined by ELISA. Restriction enzyme digestion analysis proved that recombinant plasmid pRRL-CMV-ch3E-H and pRRL-CMV-ch3E-L were constructed correctly. Light and heavy chains of the chimeric antibody, with molecular masses of about 25 and 50 kDa, were observed on reduced 10% SDS-PAGE. ELISA results showed the purified chimeric antibody could bind to c-Met specifically. Chimeric anti-c-Met antibody was successfully prepared, which was expected to be less immunogenic due to the decrease of components from mouse origin. It laid a foundation for further study of anti-c-Met therapeutic antibody.

anti-c-Mesenchymal epithelial transition factor(anti-c-Met); hepatocyte growth factor(HGF); chimeric antibody; lentiviral vector; biological activity

2016-03-15；

2017-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81402399);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2000219121)和江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK2012162)

張龍真(1988-),女,安徽阜陽(yáng)人,同濟(jì)大學(xué)碩士生; 房健民(1962-),男,浙江寧波人,博士,同濟(jì)大學(xué)教授,博士生導(dǎo)師.

10.3969/j.issn.1003-5060.2017.06.022

Q786

A

1003-5060(2017)06-0835-05