劉喜樂，賈燦潮，姬生國(guó)（廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510006）

近紅外漫反射光譜法快速測(cè)定首烏丸中二苯乙烯苷的含量Δ

劉喜樂＊，賈燦潮，姬生國(guó)#（廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510006）

目的：建立快速測(cè)定首烏丸中二苯乙烯苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定首烏丸中二苯乙烯苷的含量（作為實(shí)測(cè)值）：色譜柱為ODS-C18，流動(dòng)相為乙腈-水（25∶75，V/V），流速為0.8m L/m in，檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL。采用偏最小二乘法-近紅外漫反射光譜法建立預(yù)測(cè)首烏丸中二苯乙烯苷含量的定量校正模型：根據(jù)實(shí)測(cè)值，采集校正集樣品76份、驗(yàn)證集樣品18份，以標(biāo)準(zhǔn)歸一化法、一階導(dǎo)數(shù)法聯(lián)合濾波法預(yù)處理光譜，最佳波段為9 000～4 150 cm－1，主成分因子數(shù)為12。結(jié)果：首烏丸中二苯乙烯苷的含量測(cè)定方法學(xué)考察符合要求。二苯乙烯苷含量預(yù)測(cè)的定量校正模型內(nèi)部交叉驗(yàn)證決定系數(shù)為0.991 90，校正均方根偏差為0.020 1，預(yù)測(cè)均方根偏差為0.023 6，交叉驗(yàn)證均方根偏差為0.076 29，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便，可用于首烏丸中二苯乙烯苷含量的快速測(cè)定。

近紅外漫反射光譜法；首烏丸；二苯乙烯苷；含量；偏最小二乘法

首烏丸由制何首烏、熟地黃、桑椹等中藥組成，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)的功效，可用于治療肝腎兩虛、頭暈?zāi)炕?、耳鳴、腰酸肢麻、須發(fā)早白、高血脂等癥[1]。該制劑現(xiàn)收載于2015年版《中國(guó)藥典》（一部），采用高效液相色譜法（HPLC）作為測(cè)定首烏丸中二苯乙烯苷含量的標(biāo)準(zhǔn)方法，但該方法操作較為煩瑣，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且易破壞樣品[2]。近紅外漫反射光譜法（Near infrared diffuse reflectance spectroscopy，NIDRS）作為一門綠色分析技術(shù)，通過掃描樣品的近紅外光譜，可以得到樣品中有機(jī)分子含氫基團(tuán)的特征信息[3]，在藥物的定性、定量分析方面具有廣泛的應(yīng)用前景[4-7]。鑒于此，本課題組采用NIDRS法建立了快速測(cè)定首烏丸中二苯乙烯苷含量的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1120型全自動(dòng)HPLC儀，配備SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-20A紫外檢測(cè)器、LC solution工作站（日本Shimadzu公司）；Nicolet6700型傅里葉變換近紅外光譜儀，配有漫反射積分球、樣品旋轉(zhuǎn)器和石英樣品杯、OMNIC光譜采集軟件和TQ 8.0分析軟件（美國(guó)Thermo公司）；BIY211b型萬(wàn)分之一電子分析天平和AY120型十萬(wàn)分之一電子分析天平（日本Shimadzu公司）；M illi-Q AdvantageA10型超純水儀（美國(guó)M illipore公司）。

1.2 藥品與試劑

首烏丸（廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院自制，編號(hào)：1～94，規(guī)格：10 g/丸）；二苯乙烯苷對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-14021907，純度：≥98%）；乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 NIDRS采集

取樣品適量，粉碎，過40目篩，取約4 g，混勻后置于石英杯中，輕輕振搖使其分布均勻，采用積分球漫反射系統(tǒng)，以空氣為參比，扣除背景采集NIDRS。采集條件：分辨率為8 cm－1，掃描范圍為12 000～4 000 cm－1，掃描累積次數(shù)為64次，溫度為（25±0.5）℃，相對(duì)濕度為28%～35%。94批樣品的近紅外漫反射原始光譜疊加圖見圖1。

圖1 94批樣品的近紅外漫反射原始光譜疊加圖Fig 1 Near in frared diffuse reflectance spectrum superposed graph of94 batchesof sam ples

2.2 二苯乙烯苷含量的測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：ODS-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（25∶75，V/ V）；流速：0.8m L/m in；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)按二苯乙烯苷峰計(jì)≥2 000；各成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram s

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取二苯乙烯苷對(duì)照品4.03mg，置于10m L棕色量瓶中，加70%甲醇溶液溶解，制成每1m L含二苯乙烯苷0.403mg的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備取樣品粉末約0.4 g，精密稱定，置于25m L棕色量瓶中，加70%甲醇溶液25m L，稱定質(zhì)量，加熱回流30min，放至室溫，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方法學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果表明，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)中二苯乙烯苷峰面積的RSD＜2.0%，表明儀器精密度、溶液穩(wěn)定性、方法重復(fù)性均較好。

2.2.5 樣品含量測(cè)定取94批樣品各適量，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表1。

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab 1 Results of content determ ination in sam p les（n＝3，%）

2.3 NIDRS定量校正模型的建立與驗(yàn)證

2.3.1 校正集與驗(yàn)證集樣品的選擇根據(jù)“2.2.5”項(xiàng)下二苯乙烯苷含量分布情況，從94批樣品中選取76批組成校正集，用于建立模型；其余18批樣品組成驗(yàn)證集，用于驗(yàn)證模型。選擇原則為驗(yàn)證集樣品中二苯乙烯苷含量分布范圍應(yīng)包含在校正集樣品二苯乙烯苷含量分布范圍之內(nèi)，詳見表2。

2.3.2 光譜預(yù)處理方法的選擇分別以一階導(dǎo)數(shù)法（Firstderivative）、二階導(dǎo)數(shù)法（Second derivative）、濾波法（Savitizky-Golay filter，SG）、無(wú)濾過法（No smoothing）、標(biāo)準(zhǔn)歸一化法（SNV）、多元散射校正法（MSC）等方法預(yù)處理光譜或不進(jìn)行預(yù)處理即常量光譜（Constant+Spectrum），得不同校正集內(nèi)部交叉驗(yàn)證決定系數(shù)（R2）、校正均方根偏差（RMSEC）和預(yù)測(cè)均方根偏差（RMSEP），結(jié)果見表3。

表2 校正集與驗(yàn)證集樣品中二苯乙烯苷含量分布范圍Tab 2 Content distribution of calibration set and validation set for stilbene glycoside

表3 不同光譜預(yù)處理方法對(duì)定量校正模型性能的影響Tab 3 Effects of different pretreatm ent m ethods onthe property ofm odel

運(yùn)用TQ 8.0分析軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)合偏最小二乘法建立NIDRS定量校正模型。選擇R2、RMSEC、RMSEP為評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)不同模型的準(zhǔn)確性和適用性。其中，R2越接近1，NIDRS模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值相關(guān)性越好；RMSEC與RMSEP越接近，且RMSEC略小于RMSEP，所建模型適用性越強(qiáng)，預(yù)測(cè)效果越好。結(jié)果表明，以選取SNV+Firstderivative+SG預(yù)處理光譜效果最好，對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，所建立的模型評(píng)價(jià)指標(biāo)最好，可以用于建立穩(wěn)健的模型。預(yù)處理后的紅外光譜圖見圖3。

圖3 預(yù)處理后的紅外光譜圖Fig 3 Infrared spectrum after pretreatment

2.3.3 建模波段的選擇建模波段區(qū)間要求包含樣品的大量信息，同時(shí)要避免冗余信息，降低噪聲干擾。交叉驗(yàn)證均方根偏差（RMSECV）越小，所建模型適用性越強(qiáng)，預(yù)測(cè)效果越好。采用SNV+Firstderivative+SG對(duì)不同的波段進(jìn)行手動(dòng)優(yōu)化，通過TQ 8.0分析軟件得到最佳波段范圍為9 000～4 150 cm－1，詳見表4。

表4 不同波段范圍對(duì)R2、RMSEC和RMSEP的影響Tab 4 Effects of different bands on R2，RMSEC and RMSEP

2.3.4 主成分?jǐn)?shù)的選擇在建模過程中，采用不同的主成分?jǐn)?shù)，模型的預(yù)測(cè)能力不同，若主成分?jǐn)?shù)太少，建模信息不全，預(yù)測(cè)能力太低；反之，主成分?jǐn)?shù)太多，驗(yàn)證過程會(huì)出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象。采用內(nèi)部交互驗(yàn)證考察主成分?jǐn)?shù)對(duì)RMSECV的影響，并繪制曲線，詳見圖4。結(jié)果表明，當(dāng)偏最小二乘法因子數(shù)為12時(shí)，RMSECV值最小為0.076 29，即最佳建模主成分?jǐn)?shù)為12。

圖4 主分成分?jǐn)?shù)對(duì)RMSECV的影響Fig 4 Effectsofmain com ponentson RM SECV

2.3.5 定量校正模型的建立運(yùn)用TQ 8.0分析軟件，以76批樣品為校正集，18批樣品為驗(yàn)證集，采用SNV+ Firstderivative+SG對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，在4 150～9 000 cm－1波段范圍內(nèi)，選擇12個(gè)主成分?jǐn)?shù)進(jìn)行。結(jié)果，用校正集樣品進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，R2＝0.991 90，RMSEC＝0.020 1，RMSEP＝0.023 6，RMSECV＝0.076 29，二苯乙烯苷NIDRS實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖和偏差圖見圖5。2.3.6定量校正模型的驗(yàn)證選擇18批樣品作為驗(yàn)證集進(jìn)行外部驗(yàn)證，將其NIDRS輸入定量校正模型，預(yù)測(cè)二苯乙烯苷含量，再與實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較，結(jié)果見表5。由表5可知，驗(yàn)證集樣品的NIDRS預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的絕對(duì)誤差為±0.05%，回收率為92.67%～107.88%，相對(duì)誤差為－1.88%～7.88%，說明所建模型具有良好的預(yù)測(cè)能力與適應(yīng)性。將驗(yàn)證集樣品含量實(shí)測(cè)值與NIDRS預(yù)測(cè)值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，t＝0.437 2，P＝2.110（＞0.05），按0.05的顯著性水平分析，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明該模型預(yù)測(cè)結(jié)果可靠。

圖5 首烏丸NIDRS預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的相關(guān)圖和偏差圖Fig 5 Correlation plot and deviation plot for predicted value and m easured value of NIDRS of Shouwu pills

表5 17批驗(yàn)證集樣品的NIDRS定量校正模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值比較（%）Tab 5 Comparison of predicted and measured value of quantitative calibration model for NIDRS of 17 batchesof validation set（%）

3 討論

本課題建立了可用于快速測(cè)定首烏丸中二苯乙烯苷含量的NIDRS定量分析模型，該模型參數(shù)R2為0.991 90，RMSEC為0.020 1，RMSEP為0.023 6，RMSECV為0.076 29，模型質(zhì)量較好。經(jīng)18批樣品進(jìn)行驗(yàn)證，模型預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，所建模型可用于快速測(cè)定首烏丸中二苯乙烯苷的含量，可為首烏丸生產(chǎn)加工或成品在線檢測(cè)提供理論參考。NIDRS分析技術(shù)作為快速無(wú)損的物理檢測(cè)技術(shù)，已成功應(yīng)用于多種中藥指標(biāo)成分的含量測(cè)定[8-12]，因其具有檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)健性好等優(yōu)點(diǎn)，在藥物生產(chǎn)加工以及成品在線檢測(cè)中優(yōu)勢(shì)顯著。水分含量和二苯乙烯苷含量為評(píng)價(jià)首烏丸質(zhì)量的兩大重要指標(biāo)成分，本課題組前期已完成首烏丸中水分含量的近紅外光譜定量分析模型的建立[13]，結(jié)合本研究，可較為系統(tǒng)地評(píng)價(jià)首烏丸的質(zhì)量。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便，可用于首烏丸中二苯乙烯苷含量的快速測(cè)定。

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Rapid Determ ination of Stilbene Glycoside in Shouwu Pills by Near Infrared Diffuse Reflectance Spectrophotometry

LIU Xile，JIA Canchao，JIShengguo（Schoolof Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

OBJECTIVE：To establish themethod for the rapid determ ination of stilbene glycoside in Shouwu pills.METHODS：HPLC method was used to determ ine the content of stilbene glycoside in Shouwu pills（asmeasured value）.The determination was performed on ODS-C18column w ith mobile phase consisted of acetonitrile-water（25∶75，V/V）at the flow rate of 0.8 m L/min. The detection wavelength was set at 320 nm，and the column temperature was 30℃.The sample size was 10μL.The partial least square method-near infrared diffuse reflectance spectrophotometry was used to establish quantitative calibration model for predicting the content of stilbene glycoside in Shouwu pills.According to measured value，76 calibration set samplesand 24 validation set samples were collected.Standard normalization method and first-order derivative method combined w ith Savitzky-Goly filter method were used for spectrum pretreatment.The optimal band ranged 9 000-4 150 cm－1，and main component factor was 12.RESULTS：The content determ ination method of stilbene glycoside in Shouwu pillswas in line w ith the requirements.The correlation coefficients，the root-mean-square error of calibration，the root-mean-square error of predication and the root-mean-square error of cross-validation（RMSECV）of the quantitative calibration modelwere 0.991 90，0.020 1，0.023 6 and 0.076 29.There wasno statistical significance between predicted value and measured value（P＞0.05）.CONCLUSIONS：The method is accurate，stable and simple，and can be used for rapid determination of stilbene glycoside in Shouwu pills.

Near infrared diffuse reflectance spectrophotometry；Shouwu pills；Stilbene glycoside；Content；Partial least squaremethod

R917

A

1001-0408（2017）18-2539-04

2016-12-28

2017-04-12）

（編輯：劉柳）

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2009B030801044）

＊碩士研究生。研究方向：中藥資源與質(zhì)量。E-mail：xila_1990@ 126.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：中藥資源、中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及中藥新藥研究。E-mail：shengguo_ji@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.18.26