王建英+劉昭華+曹頂國+王金文+崔緒奎+張果平

摘要：生長分化因子9（growth differentiation factor 9， GDF9）對哺乳動物生殖活動的調控至關重要。作為轉化生長因子β（transforming growth factor beta， TGFβ）超家族成員之一，GDF9主要在卵巢的卵母細胞中表達。除通過經典的GDF9/Smads信號轉導通路實施生物學應答外，GDF9還能以不依賴Smads的方式實現(xiàn)其生理作用。GDF9在卵泡發(fā)育、卵母細胞發(fā)育、排卵、黃體形成、精子發(fā)生、受精和胚胎發(fā)育等生物學過程中都發(fā)揮重要作用。本文對GDF9基因表達、蛋白結構、參與的信號通路及其在哺乳動物生殖過程中可能的生物學功能進行總結及探討。

關鍵詞：生長分化因子9；哺乳動物；生殖

中圖分類號：S814.1 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2017）07-0167-06

Abstract Growth differentiation factor 9 （GDF9） is essential for the regulation of mammalian reproduction. As a member of transforming growth factor beta （TGFβ） family， GDF9 is mainly expressed in ovarian oocytes. In addition to the classical GDF9/Smads signal transduction pathway to implement biological response， GDF9 can also achieve its physiological role by independent of Smads. GDF9 plays important roles in follicle and oocyte development， ovulation， corpus luteum formation， spermatogenesis， fertilization， embryo development and so on. In this paper， the gene expression， protein structure， signaling pathway of GDF9 and its possible biological functions in the process of mammalian reproduction were summarized and discussed.

Keywords Growth differentiation factor 9； Mammal； Reproduction

作為轉化生長因子β （transforming growth factor beta， TGFβ）超家族成員之一，生長分化因子9（growth differentiation factor 9， GDF9）與哺乳動物生殖活動密切相關，廣泛參與卵泡發(fā)育[1]、卵母細胞發(fā)育、排卵、黃體形成、精子發(fā)生、受精和胚胎發(fā)育等生物學過程。因此，對GDF9的研究工作有利于揭示哺乳動物繁殖機理、促進生殖健康和利用分子標記輔助選擇快速提高動物的繁殖性能和生產效益。為了更好地理解GDF9與哺乳動物生殖之間的關系，促進生殖健康和提高動物繁殖力，本文就GDF9在哺乳動物生殖過程中的作用及對生殖過程的調控等方面的研究進行回顧和總結，以便于GDF9在動物生殖方面的開發(fā)和利用。

1 GDF9基因表達、蛋白結構及其參與的信號通路

GDF9基因在進化上比較保守，不同物種間的GDF9存在較高的同源性。物種間差異可能影響GDF9在人類和各種動物體內表達的時間與定位。研究發(fā)現(xiàn)，綿羊、牛、負鼠、倉鼠的GDF9表達從原始卵泡階段開始，而小鼠、大鼠和人的GDF9表達則從初級卵泡階段開始[2]。GDF9主要在卵巢的卵母細胞中表達[3]，此外，在哺乳動物睪丸[4-6]、垂體、子宮、骨髓[7]中亦有GDF9表達。與大多數(shù)TGFβ超家族生長因子不同，GDF9的羧基末端（C-末端）以6個半胱氨酸（Cys）取代了TGFβ超家族保守的7個或9個Cys，而且C-末端參與成熟蛋白二硫鍵形成的Cys也被絲氨酸（Ser）替換，這表明GDF9單體可能通過非共價健連接形成二聚體[8]。

GDF9通過與單次跨膜的絲/蘇氨酸激酶活性受體Ⅰ（activin receptor-like kinase 5， ALK5）、受體Ⅱ（BMP type Ⅱ receptor， BMPRⅡ）高親和性結合，啟動經典的Smad2/3信號通路[9]，調控細胞內特定基因的轉錄及蛋白的合成，從而影響細胞的功能活動。除通過GDF9/Smads信號轉導通路實施生物學應答外，GDF9還能以不依賴Smads的方式調節(jié)細胞功能[10]。

從已有的研究結果來看，GDF9廣泛參與哺乳動物生殖過程，主要包括卵泡發(fā)育、卵母細胞發(fā)育、排卵、黃體形成、精子發(fā)生、受精和胚胎發(fā)育等。

2 GDF9對卵泡發(fā)育的作用

下丘腦-垂體-性腺軸間的內分泌調節(jié)在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。此外，GDF9在卵泡的生長分化、顆粒細胞的增殖和分化、卵丘擴張、卵泡膜細胞分化、卵巢甾體激素、蛋白酶和細胞因子的合成等過程中亦不可或缺，從而維持穩(wěn)定的發(fā)育卵泡內微環(huán)境。由于卵泡生成的初級卵泡階段受阻，敲除GDF9的小鼠是雌性不育的[11]。體內給予GDF9重組蛋白能促進大鼠的原始卵泡和初級卵泡轉變?yōu)榇渭壜雅輀12]。

2.1 GDF9調節(jié)卵泡的生長和分化

卵泡發(fā)育過程可分為促性腺激素不依賴和促性腺激素依賴兩個階段。前者包括原始卵泡和初級卵泡階段，在此階段，GDF9通過自分泌或旁分泌的方式來維持卵泡的正常生長和卵母細胞的發(fā)育，生殖激素在該階段不起作用。GDF9可能通過抑制caspase-3的促凋亡作用促進原始卵泡和初級卵泡發(fā)育到次級卵泡[13，14]。后一階段主要由下丘腦-垂體-性腺軸調節(jié)卵泡的發(fā)育，GDF9可與促性腺激素一起影響優(yōu)勢卵泡的選擇以及閉鎖卵泡的形成，促進黃體的形成[12，15，16]。GDF9對卵泡發(fā)育的影響主要表現(xiàn)在對顆粒細胞、卵泡膜細胞及卵丘的作用上。

目前關于GDF9是否影響原始卵泡向初級卵泡發(fā)育存在爭議[12，17，18]。體內給與GDF9重組蛋白能促進大鼠從原始卵泡和初級卵泡發(fā)育到次級卵泡[12]。在山羊卵巢皮質體外培養(yǎng)過程中，外源添加GDF9也能促使山羊原始卵泡發(fā)育到次級卵泡[17]。而Nilsson等則持相反意見，認為GDF9只能促進初級卵泡的發(fā)育，而對原始卵泡無影響[18]。這可能是物種差異、研究人員和方法不同所致。

2.2 GDF9影響顆粒細胞的增殖和凋亡，改變其分化狀態(tài)

GDF9敲除小鼠的初級卵泡的顆粒細胞不能增殖和凋亡[19]。GDF9對未分化顆粒細胞的作用在于降低促卵泡素（follicle-stimulating hormone， FSH）的生物學效應、促進顆粒細胞的增殖和抑制顆粒細胞過早黃素化。GDF9對FSH誘導的孕酮、雌激素和促黃體生成素（luteinizing hormone， LH）受體生成起抑制作用。FSH通過合成環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate， cAMP）促進類固醇生成和LH受體含量增加來介導顆粒細胞分化，GDF9可顯著降低FSH誘導的cAMP生成量[20]。同時，GDF9降低顆粒細胞8-Br-cAMP誘導的孕激素合成，降低類固醇激素調節(jié)蛋白（StAR）的表達，抑制P450側鏈裂解酶、P450芳香化酶的活性和卵泡膜細胞孕酮、17-α羥孕酮及脫氫表雄酮的合成，抑制顆粒細胞分化[21]。在大鼠[22]和人[1]顆粒細胞中，GDF9可刺激抑制素的產生，誘導Smad2的活化，在FSH分泌的反饋調節(jié)中起重要作用。

與未分化顆粒細胞不同，GDF9通過前列腺素E2配基受體信號通路使排卵前被FSH/LH激活的顆粒細胞的分化狀態(tài)發(fā)生改變，促進顆粒細胞中前列腺素和孕酮的合成[23]。

GDF9還可通過促進細胞代謝基因和編碼糖酵解酶[24]基因表達促進卵母細胞發(fā)育，調節(jié)顆粒細胞代謝與卵泡發(fā)育保持一致[25]。

2.3 GDF9參與卵泡膜細胞的募集和分化

GDF9可影響卵泡膜細胞[21]和膜間質細胞[26，27]類固醇的生物合成，參與卵泡膜細胞募集和分化。GDF9基因敲除小鼠的卵泡膜細胞分化受阻，卵泡膜細胞分化的標志缺乏，如17α-羥化酶（CYP17）、LH受體和C-kit受體[19]。而外源給予GDF9之后，免疫印跡結果表明卵巢勻漿中CYP17的含量增加[12]。

2.4 GDF9可誘導卵丘擴張和分化

排卵前，富含透明質酸的胞外間質在卵丘細胞迅速積累，并引起細胞群擴展。這一過程對于排卵及受精過程極其重要[28]。在出現(xiàn)LH峰時，GDF9導致卵丘和卵母細胞發(fā)生下列變化：透明質酸合成酶2 （hyaluronan synthase 2， HAS2）和環(huán)氧合酶2（COX2）的表達增加，透明質酸、前列腺素E2（PGE2）和PGE2受體亞型EP2的合成能力增強，StAR的表達量提高，從而促進卵丘擴張、孕酮合成[23]以及卵丘細胞合成膽固醇[29]。

在卵丘卵母細胞復合物（cumulus oocyte complexes， COCs）中，GDF9通過促進HAS2表達和抑制尿激酶（urokinase plasminogen activator， uPA）的表達來啟動卵丘擴展[31]。重組的GDF9能上調中國倉鼠顆粒細胞HAS2、COX2和StAR mRNA的表達，下調uPA及LH受體 mRNA的合成，促進富含透明質酸的細胞外基質的形成以維持卵母細胞生長最適宜的內環(huán)境[30]。小鼠卵母細胞的HAS2和前列腺素合酶2（Prostaglandin synthase 2， PTGS2） mRNA 水平在注射GDF9 dsRNA 8小時后也明顯下降[31]。而Varnosfaderani等則認為在促進綿羊卵丘細胞擴張上，GDF9不起主要作用[32]。

GDF9基因還可以與FSH、BMP15等其他激素或生長因子對動物卵泡發(fā)育起協(xié)同效應。

3 GDF9對卵母細胞發(fā)育的作用

3.1 GDF9可能參與卵母細胞減數(shù)分裂的啟動和調控

研究發(fā)現(xiàn)，綿羊卵巢中GDF9的基因轉錄從母羊妊娠后56天開始，在94天達最高水平，之后逐步降低。而母羊卵巢上的卵原細胞在妊娠56～75天時開始形成初級卵母細胞[33]。在綿羊卵母細胞的發(fā)育過程中，GDF9的最高表達量出現(xiàn)在GV期，其后MⅡ期卵母細胞、2細胞期、4細胞期、8細胞期、16細胞期和桑椹胚中GDF9的表達量依次下降，囊胚中甚至檢測不到其表達[4]。GDF9的表達時間和方式暗示其可能參與綿羊卵母細胞減數(shù)分裂的啟動和調控[34]。馬絨毛膜促性腺激素（eCG）和絨毛膜促性腺激素（hCG）處理GDF9單敲除（+/-）和BMP15雙敲除（-/-）雙重突變（double mutant， DM）小鼠發(fā)現(xiàn)，卵母細胞恢復減數(shù)分裂的時間延遲[16]。

3.2 GDF9 影響卵母細胞的生長發(fā)育和成熟

卵泡發(fā)育和卵母細胞的生長成熟是同步的。GDF9可通過調節(jié)卵泡發(fā)育、卵丘擴張中關鍵酶的活性和顆粒細胞形態(tài)、數(shù)量、排列的變化[30]、維持卵母細胞和體細胞間的通訊（縫隙連接和粘著連接）[35]來影響卵母細胞的生長發(fā)育和成熟。GDF9還可激活成熟促進因子MPF和MAPK來調控豬卵母細胞的成熟[36]。GDF9敲除可上調小鼠卵泡中顆粒細胞kit配體和抑制素-α的表達，間接影響卵母細胞的生長和成熟[19]。而外源添加GDF9能夠提高牛[37]和豬[38]的卵母細胞成熟率。

FSH誘導GDF9+/-和BMP15-/-DM小鼠體外成熟卵母細胞的卵丘擴張指數(shù)顯著低于BMP15+/-組、BMP15-/-組或GDF9+/-組。GDF9+/-和BMP15-/-DM小鼠卵丘細胞HAS2表達水平顯著低于BMP15+/-組或GDF9+/-組，與BMP15-/-組差別不大，而GDF9+/-和BMP15+/-組的卵丘細胞HAS2表達水平沒有差異[16]。

GDF9敲除不會影響小鼠卵母細胞的細胞核成熟，但是會影響卵母細胞的細胞質成熟[16]。GDF9敲除小鼠的卵母細胞的跨透明帶突起物（transzonal projection， TZP）倒向卵母細胞，數(shù)量減少，結構雜亂無章。體細胞和透明帶的聯(lián)系不很緊密，透明帶與卵黃膜的粘附明顯減少，顆粒細胞間的相互作用增強。超微結構顯示GDF9敲除會導致皮質顆粒和高爾基復合體的片層減少，說明卵原細胞形成成熟卵母細胞的過程受到抑制[35]。

4 排卵和黃體形成

GDF9在排卵和黃體形成過程中亦發(fā)揮極其重要的作用。

4.1 GDF9可增加排卵率

鑰孔血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin， KLH）-GDF9多肽弗氏佐劑免疫會導致排卵的綿羊數(shù)量減少，黃體形成受到抑制，未排卵的綿羊伴隨正常卵泡發(fā)育的抑制和乏情[39]。綿羊的排卵率或產羔數(shù)與GDF9基因多態(tài)性有關[40]。研究發(fā)現(xiàn)，綿羊GDF9基因上有3個位點（Fec GH、Fec TT、Fec GV）的突變雜合子排卵率比野生型要高，而這些突變純合子是不育的，可能是改變了GDF9成熟蛋白的形成[41]、GDF9形成二聚體的能力[42]以及GDF9與ALK5[43，44]、BMPRⅡ[45]的結合。

4.2 GDF9促進黃體生成

GDF9通過影響優(yōu)勢卵泡的選擇以及閉鎖卵泡的形成促進黃體生成。在黃體組織中發(fā)現(xiàn)BMP受體基因以及GDF9基因和蛋白的表達，也暗示GDF9在黃體形成過程中發(fā)揮作用[46]。此外，GDF9可增加抑制素B的表達，抑制素B與活化素（activin）A進行競爭，導致activin A對StAR表達和孕酮生成的抑制作用減弱[47]，亦能對黃體形成產生影響。

5 GDF9在雄性生殖中的作用

已有研究結果表明，GDF9可能在精子發(fā)生中發(fā)揮作用。成年羊駝生精上皮圓形精子和粗線期精子細胞的胞質中有GDF9表達，GDF9通過作用于生殖細胞或體細胞（如睪丸間質細胞、支持細胞）調控睪丸中精子的發(fā)生過程[5]。荷斯坦公牛鮮精和凍精中GDF9基因兩個位點的突變與頂體完整率和精子密度顯著相關[48]。

睪丸支持細胞（sertoli cell， SC）間緊密連接的動態(tài)變化對于血睪屏障（blood testis barrier， BTB）的完整性及精子發(fā)生過程至關重要[49]。GDF9可通過影響緊密連接和抑制素的生成影響精子生成，還可通過抑制緊密連接蛋白claudin-11、occludin和zonula occludens-1的膜定位破壞SC緊密連接的完整性[50]。

有關GDF9與雄性生殖方面的研究相對較少。GDF9是否參與精子的獲能和頂體反應、是否影響睪丸發(fā)育、是否影響雄激素生物合成以及其它物種精子的冷凍保存，都有待于進一步研究。

6 GDF9影響受精和胚胎發(fā)育

卵母細胞中正常的BMP15和GDF9表達水平對卵母細胞的細胞質成熟至關重要。GDF9+/-、BMP15-/-以及GDF9+/-BMP15-/-DM小鼠的MⅡ期卵母細胞受精率顯著降低，著床前胚胎（2細胞至桑椹胚）發(fā)育滯后。這可能是通過降低BMP15和GDF9表達水平來影響卵丘細胞發(fā)育，也說明卵母細胞、顆粒細胞間的反饋調節(jié)環(huán)對正常的卵母細胞發(fā)育很重要[16]。

GDF9能提高綿羊[32]、牛[37]、豬[38]和小鼠[51]等的胚胎質量和發(fā)育能力，但不同物種間存在一定差異。與對照組相比，未成熟的綿羊COCs與重組的人GDF9共培養(yǎng)會降低卵裂率，對囊胚率無明顯影響，而囊胚的滋養(yǎng)層細胞數(shù)顯著增加[32]。GDF9重組蛋白能夠提高克隆牛胚胎的卵母細胞成熟率、卵裂率和囊胚率[37]。在豬卵母細胞體外成熟（in vitro maturation， IVM）培養(yǎng)過程中，外源添加GDF9能顯著提高囊胚率[38]。在FSH和表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF）存在下，外源添加GDF9能顯著提高小鼠卵母細胞的囊胚率和囊胚的內細胞團（inner cell mass， ICM）細胞數(shù)量，15天的成活胎兒數(shù)亦有增加[51]。

GDF9可能通過影響黃體形成和前列腺素合成在子宮內膜上皮的增殖與分化、胚胎著床、維持妊娠、啟動分娩、胎盤形成和功能維持等方面發(fā)揮作用，關于GDF9是否影響卵母細胞的捕獲、卵母細胞在輸卵管的運輸、黃體退化、胎盤結構和乳腺發(fā)育等，需要進一步研究。

另外，GDF9可能具有更廣泛的生物學效應，雖然GDF9主要在卵巢的卵母細胞中表達，但它在其它性腺組織和非性腺組織中亦有表達[4]。GDF9在非性腺組織中也可能發(fā)揮重要的生理功能[7]。

7 應用展望

總之，GDF9通過影響生殖細胞和體細胞參與調節(jié)哺乳動物生殖過程的多個環(huán)節(jié)，發(fā)揮重要的自分泌和旁分泌作用。然而，GDF9在生殖系統(tǒng)中作用的研究才剛剛起步，還需要從分子生物學、細胞生物學和發(fā)育生物學等角度對其進行深入挖掘，揭示GDF9在生殖活動中的作用機制和調節(jié)方式，闡明哺乳動物的生殖機理，促進生殖生物學的發(fā)展，廣泛應用于哺乳動物生殖調控和生殖疾病的診斷與臨床治療中。

另外，由于生殖過程的調節(jié)本來就是一個很復雜的過程，有很多影響因素參與調節(jié)，下丘腦-垂體-性腺軸內分泌調節(jié)和卵母細胞源旁分泌或自分泌因子（GDF9、BMP15和BMP6等）共同發(fā)揮重要調節(jié)作用。要研究哺乳動物整個生殖活動的調節(jié)機理，需要對生殖過程進行整體和系統(tǒng)研究，這樣才有助于全面揭示哺乳動物復雜的生殖過程，為促進哺乳動物生殖健康和提高動物繁殖力提供理論依據和技術手段，推動生殖生物學研究以及動物繁殖、改良的發(fā)展和進步。

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