李珺珂，劉大松，賴瑞業(yè)，余韻，周鵬

(江南大學(xué) 食品學(xué)院 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫，214122)

低溫微濾技術(shù)制備富含β-酪蛋白和乳清蛋白的新型功能性乳蛋白配料

李珺珂，劉大松，賴瑞業(yè)，余韻，周鵬*

(江南大學(xué) 食品學(xué)院 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫，214122)

以市售的巴氏殺菌脫脂乳為原料，探究膜孔徑、溫度、洗濾液和洗濾次數(shù)等條件對β-酪蛋白和乳清蛋白分離效果和膜通量的影響，最終制備了富含β-酪蛋白與乳清蛋白的新型功能性乳蛋白配料。研究采用聚丙烯酰胺凝膠電泳和高效液相色譜對蛋白做定性和定量分析。研究表明，在4 ℃條件下，使用30 nm孔徑的陶瓷膜，以水作為洗濾液，可使得β-酪蛋白的分離效果最佳；在最優(yōu)條件下，脫脂乳經(jīng)微濾濃縮3倍后，再在相同條件下補(bǔ)水洗濾4次，將膜過濾各階段所得的透過液混合，可得到β-酪蛋白和乳清蛋白的產(chǎn)率分別為51.7%和99.7%，復(fù)合蛋白中β-酪蛋白和乳清蛋白所占比例分別為51.1%和40.0%，而αs-酪蛋白的含量得以大大降低，該功能性復(fù)合蛋白可作為一種新型的功能性蛋白配料用于配方乳粉等嬰幼兒食品的研制。

脫脂乳；微濾；β-酪蛋白；乳清蛋白；嬰幼兒配方乳粉

牛乳蛋白具有良好的營養(yǎng)和功能特性，因而被廣泛地運(yùn)用到嬰幼兒配方乳粉的生產(chǎn)中。然而，人乳蛋白與牛乳蛋白在蛋白分子組成方面差異較大。人乳蛋白中乳清蛋白含量較高，約占總蛋白質(zhì)的60%，酪蛋白則占40%；而牛乳蛋白中含80%的酪蛋白，乳清蛋白僅占20%[1]。研究表明，酪蛋白在牛乳中以膠束狀態(tài)存在，等電點約為4.6[2]，在嬰幼兒胃液中易形成致密的絮凝結(jié)構(gòu)，不易于蛋白的消化吸收。目前，調(diào)節(jié)嬰幼兒配方乳粉中乳清蛋白和酪蛋白的比例來模擬人乳蛋白的組成是國內(nèi)外的研究熱點，常用的方法是將脫脂乳粉與乳清蛋白粉復(fù)配，以提高牛乳蛋白中乳清蛋白的含量。然而，牛乳中的酪蛋白為αs1、αs2、β和κ，其比例約為4∶1∶3∶1；人乳中的酪蛋白為β和αs1，且以前者為主[3]。因此，同時提高牛乳蛋白中乳清蛋白和β-酪蛋白的含量，可以使其在蛋白分子組成水平上更接近人乳蛋白，從而為配方乳粉等嬰幼兒食品的生產(chǎn)提供更加優(yōu)質(zhì)的乳蛋白配料。

膜分離技術(shù)是根據(jù)分離物尺寸的不同而選擇相應(yīng)孔徑的膜材料來實現(xiàn)物料分離的，具有非熱、高效、綠色等特點[4]。牛乳中的酪蛋白主要是以膠束形式存在，膠束粒徑在100 nm左右，而乳清蛋白和極少量的酪蛋白則游離于膠束之外的乳清中[2]。在膠束中，αs-酪蛋白和部分β-酪蛋白通過其所帶的磷酸基團(tuán)與膠體磷酸鈣相互作用形成了膠束骨架，而部分β-酪蛋白則通過疏水作用鑲嵌在膠束骨架之間。在低溫條件下，蛋白疏水作用會減弱，部分β-酪蛋白則會逐漸從膠束解離到乳清中，并以分子單體或低分子量聚集體的形式存在[5]。因此，通過設(shè)定合適的微濾條件，可選擇性的使部分β-酪蛋白從膠束中解離，并保留膠束骨架結(jié)構(gòu)，從而使解離的β-酪蛋白和乳清蛋白一起通過微濾膜進(jìn)入到透過液中，而膠束骨架則被保留在截留液中。目前，乳清蛋白通常是從奶酪加工的副產(chǎn)物(乳清)中分離得到的，而采用膜技術(shù)直接從牛乳中分離乳清蛋白和酪蛋白可更好地維持蛋白原有的營養(yǎng)和功能特性。因此，本實驗研究膜孔徑、溫度、洗濾液和洗濾次數(shù)對β-酪蛋白分離效果和膜通量的影響，并利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)對蛋白質(zhì)分離效果進(jìn)行定性和定量的分析，以建立制備含乳清蛋白與β-酪蛋白的復(fù)合蛋白的生產(chǎn)工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

光明優(yōu)倍巴氏殺菌脫脂乳，上海光明集團(tuán)；三氟乙酸，美國Sigma公司；乙腈，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；丙烯酰胺(Acr)、甲叉丙烯酰胺(Bis)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(APS)，尿素(Urea)，1,3-二[三(羥甲基)甲氨基]丙烷、二硫蘇糖醇，美國Amresco公司；疊氮化鈉、甲醇、乙酸、HCl、甘氨酸、甘油、正丁醇、溴酚藍(lán)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250、β-巰基乙醇，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白，美國Sigma公司；β-乳球蛋白、α-乳白蛋白，美國Davisco公司；膜清洗劑LC-66，三達(dá)膜科技(廈門)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MF-1陶瓷膜微濾系統(tǒng)，無錫赫普輕工設(shè)備技術(shù)有限公司；LX-0250低溫制冷循環(huán)器，無錫冠亞恒溫制冷技術(shù)有限公司；微濾陶瓷膜元件CRM301940，上?？片樋萍加邢薰荆怀瑸V中試設(shè)備，三達(dá)膜科技(廈門)有限公司；分析天平，美國Mettler Toledo公司；IKA T25高速分散機(jī)，德國IKA集團(tuán)；Waters e2695 Separations Module高效液相色譜分析儀，美國Waters公司；Protean Ⅱ xi Cell電泳儀、GelDox XR凝膠成像儀，美國Bio-rad 公司；LRH-250CA低溫培養(yǎng)箱，上海一恒醫(yī)療器械有限公司；705超低溫冰箱，賽默飛世爾科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 微濾膜孔徑的確定

取巴氏殺菌脫脂乳15 L，加入0.02%的疊氮化鈉以防止微生物生長。通過低溫循環(huán)器將其溫度冷卻至4 ℃左右，并在此溫度下平衡穩(wěn)定1 h后進(jìn)行微濾操作，操作過程中仍控制4 ℃的溫度和0.1 MPa的壓力。采用30、50、100 nm三種不同孔徑的陶瓷膜(表1)分別進(jìn)行微濾，直至濃縮倍數(shù)為3，收集透過液進(jìn)行后續(xù)分析。

表1 微濾膜相關(guān)技術(shù)信息

1.3.2 微濾分離溫度的確定

取巴氏殺菌脫脂乳15 L，加入0.02%的疊氮化鈉。使用膜孔徑為30 nm的陶瓷膜進(jìn)行分離，分別采用4、25和50 ℃三個不同溫度進(jìn)行膜分離實驗，4 ℃采用低溫制冷循環(huán)器進(jìn)行控制，25 ℃和50 ℃下采用水浴循環(huán)的方式進(jìn)行控制，微濾過程保持壓力為0.1 MPa。脫脂乳料液濃縮3倍時停止微濾，收集透過液進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.3 洗濾液和洗濾次數(shù)的確定

取巴氏殺菌脫脂乳50 L，加入0.02%的疊氮化鈉。采用10 kDa截留分子質(zhì)量的聚醚砜超濾膜在4 ℃條件下超濾，收集超濾透過液40 L作為后續(xù)微濾所需的洗濾液。

取巴氏殺菌脫脂乳15 L，加入0.02%的疊氮化鈉。采用膜孔徑為30 nm的陶瓷膜在4 ℃和0.1 MPa的壓力條件下進(jìn)行分離，整個過程分為1次微濾和4次洗濾，第1次微濾是原始脫脂乳的濃縮分離，即將15 L脫脂乳濃縮3倍，收集10 L的透過液；洗濾操作是分別使用2種不同的洗濾液，即補(bǔ)加水或超濾透過液至料液原體積15 L，收集分離各階段所得的透過液。

1.3.4 平均膜通量的測定

膜通量即在單位時間內(nèi)通過單位膜面積上的透過液的質(zhì)量，其計算公式可表示為：

(1)

式中：J，平均膜通量，kg/(m2·h)；M，透過液質(zhì)量，kg；A，膜面積，m2；t，時間，h。

1.3.5 透過液成分的SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE對透過液的蛋白組成做定性分析。取脫脂乳和透過液分別與超純水以體積比1∶7的比例稀釋，然后再與樣品緩沖液(含有5%β-巰基乙醇)1∶1混合，煮沸3 min后立即于碎冰上冷卻。采用濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為13%，上樣量為10 μL，濃縮膠和分離膠的電流為10 mA/Gel和20 mA/Gel。

1.3.6 透過液成分的HPLC分析

采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)對透過液的蛋白組成做定量分析。實驗使用的分離柱為4.6 mm×250 mm的C18反相柱。樣品與緩沖液1(0.1 mol/L Bis-Tris-Propane，pH 7，8 mol/L Urea，20 mmol DTT，1.3% 檸檬酸鈉)等體積混合，然后在10 000 g的條件下離心5 min，取上清液與3倍體積的緩沖液2[V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=100∶900∶1；6 mol/L Urea]混合，過0.45 μm有機(jī)膜。梯度洗脫所用的流動相A和B中乙腈-水-三氟乙酸的體積比分別為100∶900∶1和900∶100∶0.7，流動相流速為0.8 mL/min，檢測波長為220 nm[6]。洗脫曲線上的各個峰根據(jù)αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白標(biāo)品進(jìn)行定性歸屬；各個峰面積的相對定量采用Empower軟件進(jìn)行積分換算得到。

2 結(jié)果與分析

2.1 陶瓷膜孔徑對β-酪蛋白分離效果的影響

在4 ℃條件下，采用不同孔徑的膜對脫脂乳進(jìn)行分離，其中透過液中含有的蛋白組成可以用SDS-PAGE表征，如圖1所示。圖1中結(jié)果顯示，使用30 nm的微濾膜進(jìn)行低溫微濾時，透過液中主要含有β-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白；使用50 nm和100 nm時，透過液中還含有αs-酪蛋白。從圖2可以發(fā)現(xiàn)，30 nm膜的透過液呈現(xiàn)出澄清狀態(tài)，說明沒有膠束穿過微濾膜；50 nm和100 nm膜的透過液呈現(xiàn)出渾濁狀態(tài)，且后者更加渾濁，說明部分膠束穿過了微濾膜[7]。對于3種膜孔徑，β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和游離的β-酪蛋白都可以穿過膜進(jìn)入透過液，但50 nm和100 nm的膜對于酪蛋白膠束的阻擋效果較差，因而其透過液中含有較多的αs-酪蛋白。

圖1 不同孔徑陶瓷膜在4 ℃條件下微濾分離脫脂乳所得透過液的電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of skim milk protein separation by ceramic membranes with different sizes at 4 ℃

圖2 不同孔徑陶瓷膜在4 ℃條件下微濾分離脫脂乳所得的透過液 Fig.2 Appearance of permeates obtained by ceramic membranes with different sizes at 4 ℃

不同孔徑陶瓷膜在4 ℃條件下微濾分離脫脂乳所得透過液中αs-酪蛋白占原脫脂乳中αs-酪蛋白的比例如圖3所示。30 nm膜的透過液中，αs-酪蛋白所占比例約為0.8%，這對應(yīng)于牛乳中游離的αs-酪蛋白[8]；50 nm和100 nm膜的透過液中，αs-酪蛋白所占比例分別為1.4%和2.0%，說明部分酪蛋白膠束進(jìn)入到了透過液中，這進(jìn)一步表明50 nm和100 nm孔徑的陶瓷膜在分離過程中對酪蛋白膠束的阻擋能力不如30 nm陶瓷膜。因此，為了選擇性地使β-酪蛋白和乳清蛋白富集到透過液中，確定陶瓷膜孔徑為30 nm。

圖3 不同孔徑陶瓷膜在4 ℃條件下微濾分離脫脂乳所得透過液中αs-酪蛋白占原脫脂乳中αs-酪蛋白的比例Fig.3 The ratio of αs-casein isolated under different membrane pore sizes to total αs-casein in skim milk at 4℃

在4 ℃條件下，采用不同孔徑的膜對脫脂乳進(jìn)行分離，其平均膜通量的變化如圖4所示。

圖4 不同孔徑下膜通量的變化Fig.4 The change of membrane flux under different membrane pore sizes

從圖4中可以看出，4 ℃下，使用30、50、100 nm陶瓷膜進(jìn)行分離時的平均膜通量分別為19.1、22.5、24.4 kg/(m2·h)。故隨著膜孔徑的增加，平均膜通量逐漸增大；但孔徑較小則對膠束的阻擋能力強(qiáng)。隨著濃縮倍數(shù)的增加，截留液中固形物含量增加，因此會造成膜表面阻力增加，從而降低膜通量，所以膜過濾采用的濃縮倍數(shù)通常為2～4[9-10]。同時在每一次微濾過程中，隨著時間的延長，膜通量明顯降低，這是由于隨著濃縮時間的增加，截留液的濃度逐漸變大，膜表面的濃差極化現(xiàn)象越嚴(yán)重，因而膜通量逐漸降低。

2.2 溫度對β-酪蛋白分離效果的影響

在傳統(tǒng)的膜分離過程中，分離工藝的溫度通常會控制在45～50 ℃，因為在此溫度下膜通量較高，分離速率快，同時又可以抑制微生物的生長[11-12]。但是，若要分離出含β-酪蛋白和乳清蛋白的混合蛋白，則需要控制低溫條件使得部分β-酪蛋白從膠束中解離到乳清中。30 nm孔徑陶瓷膜在不同溫度條件下微濾分離脫脂乳所得透過液的電泳結(jié)果如圖5所示。從圖5中可以看出，在4 ℃條件下，有較多的β-酪蛋白出現(xiàn)在透過液中，這是由于部分β-酪蛋白是通過疏水作用結(jié)合在酪蛋白膠束中，當(dāng)溫度降低時，疏水作用變?nèi)酰@部分β-酪蛋白會逐漸游離到乳清中[13]。在25 ℃和50 ℃的條件下，沒有觀察到β-酪蛋白所對應(yīng)的條帶，這與HOLLAND[14]和LE BERRE[15]報道一致，即采用膜技術(shù)從脫脂乳中分離β-酪蛋白需要控制溫度在20 ℃以下，且在10 ℃以下效果最理想。

圖5 30 nm孔徑陶瓷膜在不同溫度條件下微濾分離脫脂乳所得透過液的電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of skim milk protein separation by 30 nm ceramic membranes at different temperature

如圖6所示，通過HPLC定量分析可以得到不同溫度條件下微濾分離脫脂乳所得透過液中β-酪蛋白占原脫脂乳中β-酪蛋白的比例。在4 ℃條件下，β-酪蛋白所占比例約為9.4%；在25 ℃和50 ℃條件下，β-酪蛋白所占比例分別為2.6%和2.1%。這進(jìn)一步說明控制低溫條件能使β-酪蛋白從膠束中解離而進(jìn)入到透過液中，而酪蛋白膠束由于其直徑較大則被阻擋在截留液中。

圖6 30 nm孔徑陶瓷膜在不同溫度條件下微濾分離脫脂乳所得透過液中β-酪蛋白占原脫脂乳中β-酪蛋白的比例Fig.6 The ratio of β-casein isolated under different temperatures to total β-casein in skim milk at 4℃

圖7為使用30 nm陶瓷膜分離時，不同溫度下的平均膜通量的變化。從圖7中可以明顯觀察到4 ℃條件下，平均膜通量最低，僅為19.1 kg/(m2·h)；而50℃條件下微濾的平均膜通量則高達(dá)71.9 kg/(m2·h)。這種膜通量的差異主要是料液的黏度造成的，溫度的降低會造成牛奶黏度增大，在膜分離過程中容易產(chǎn)生濃差極化，造成膜孔徑的堵塞，從而影響平均膜通量[16]。

圖7 不同溫度下膜通量的變化Fig.7 The change of membrane flux under different temperatures

2.3 洗濾液和洗濾次數(shù)對β-酪蛋白分離效果的影響

在膜分離過程中，隨著濃縮倍數(shù)的增加，位于膜表面的濃差極化效應(yīng)將逐漸增強(qiáng)，最終降低膜通量和膜分離效率，因此單次膜分離的濃縮倍數(shù)通常為2～4。因此，僅通過1次低溫微濾所得的β-酪蛋白和乳清蛋白的產(chǎn)率較低，為了盡可能多的分離出β-酪蛋白和乳清蛋白，需要反復(fù)多次的加入洗濾液至原體積進(jìn)行洗濾[17]。工業(yè)中常用的洗濾液有水，本實驗還采用超濾透過液做對比。超濾透過液是將脫脂牛乳或微濾透過液采用超濾膜進(jìn)行濃縮后得到的透過液，含乳糖、水和無機(jī)鹽類等。用超濾透過液進(jìn)行微濾洗濾的好處是酪蛋白膠束保持在原始的乳清環(huán)境中，降低膜分離過程對膠束結(jié)構(gòu)的破壞[18]。

30 nm陶瓷膜在4 ℃條件下微濾和洗濾分離脫脂乳脫所得透過液的電泳結(jié)果如圖8所示。從圖中可以看出，隨著洗濾次數(shù)的增加，透過液中乳清蛋白的量在逐漸減少，而β-酪蛋白在各個階段所對應(yīng)的蛋白條帶都較為明顯，說明在洗濾過程中β-酪蛋白逐漸從膠束中解離到了乳清中。

(W1)脫脂乳的微濾；(W2)第一次補(bǔ)水洗濾；(W3)第二次補(bǔ)水洗濾；(W4)第三次補(bǔ)水洗濾；(W5)第四次補(bǔ)水洗濾；(U1)脫脂乳的微濾；(U2)第一次用超濾透過液洗濾；(U3)第二次用超濾透過液洗濾；(U4)第三次用超濾透過液洗濾；(U5)第四次用超濾透過液洗濾圖8 30 nm陶瓷膜在4 ℃條件下微濾和洗濾分離脫脂乳脫所得各階段透過液的電泳圖Fig.8 SDS-PAGE of skim milk protein separation by 30 nm ceramic membranes with different solutions during diafiltration at 4 ℃

如圖9和圖10所示，通過HPLC定量分析可得出脫脂乳在微濾和洗濾過程中乳清蛋白和β-酪蛋白的累積脫除率。隨著洗濾次數(shù)的增加，乳清蛋白的脫除率逐漸增加，且在洗濾4次后，乳清蛋白的脫除率達(dá)到99.7%；用水和超濾透過液分別作洗濾液，所得乳清蛋白脫除率無顯著差異。此外，一次微濾能分離出脫脂乳中9.4%左右的β-酪蛋白，隨著洗濾次數(shù)的增加，β-酪蛋白的脫除率逐漸增加。當(dāng)用水洗濾時，經(jīng)4次洗濾后總共可以分離出脫脂乳中51.7%的β-酪蛋白；而使用超濾截留液進(jìn)行洗濾時，每次洗濾分離出的β-酪蛋白都比用水洗濾時低，經(jīng)過4次洗濾后β-酪蛋白的累積脫除率為37.8%，比用水洗濾時少13.9%。這可能是因為當(dāng)用水做洗濾液時，不斷地補(bǔ)水洗濾改變了膠束原有的乳清環(huán)境，會使維持膠束骨架的膠體磷酸鈣發(fā)生部分解離，從而在一定程度上破壞了膠束結(jié)構(gòu)，使參與形成膠束骨架的部分β-酪蛋白和通過疏水作用鑲嵌在膠束骨架中的β-酪蛋白一起從膠束中解離出來，進(jìn)而富集到了透過液中[19]。

圖9 30nm陶瓷膜在4 ℃條件下微濾和洗濾分離脫脂乳的過程中乳清蛋白的累積脫除率Fig.9 The ratio of whey protein isolated to total whey protein in skim milk by 30 nm ceramic membranes with different solutions during diafiltration at 4 ℃

圖10 30 nm陶瓷膜在4 ℃條件下微濾和洗濾分離脫脂乳的過程中β-酪蛋白的累積脫除率Fig.10 The ratio of β-casein isolated to total β-casein in skim milk by 30 nm ceramic membranes with different solutions during diafiltration at 4 ℃

圖11所示為微濾和洗濾分離脫脂乳所得透過液的累積混合液中β-酪蛋白占總蛋白的比例。第一次微濾透過液中β-酪蛋白所占比例為35.3%。當(dāng)用水做洗濾液時，隨后隨著洗濾次數(shù)的增加，累積混合液中β-酪蛋白的比例逐漸增加，分別為41.8%、45.9%、48.8%和51.1%；當(dāng)用超濾透過液進(jìn)行洗濾時，隨著洗濾次數(shù)的增加，累積混合液中β-酪蛋白比例也不斷增加，但是一直要小于用水洗濾時的比例，最后一次洗濾后，所得到的累積混合液中β-酪蛋白比例為43.6%。

圖11 30 nm陶瓷膜在4 ℃條件下微濾和洗濾分離脫脂乳所得透過液的累積混合液中β-酪蛋白占總蛋白的比例Fig.11 The ratio of β-casein isolated to total proteins in permeate by 30 nm ceramic membranes with different solutions during diafiltration at 4 ℃

圖12為微濾和洗濾分離脫脂乳所得透過液的累積混合液中αs-酪蛋白占總蛋白的比例。第一次微濾透過液中αs-酪蛋白所占比例為4.7%，這對應(yīng)牛乳中原本游離的αs-酪蛋白。當(dāng)用水洗濾時，隨著洗濾次數(shù)的增加，累積混合液中αs-酪蛋白所占比例逐漸增加，分別為7.2%、8.1%、8.8%和8.9%；當(dāng)用超濾透過液進(jìn)行洗濾時，累積混合液中αs-酪蛋白所占的比例約為5.1%、5.5%、5.8%和6.2%。這進(jìn)一步說明當(dāng)用水做洗濾液時，膜分離過程對膠束結(jié)構(gòu)的破壞程度更高，使得參與形成膠束骨架的αs-酪蛋白的解離程度更高。但這種解離程度有限，累計混合液中αs-酪蛋白的含量很少，且用水洗濾僅比用超濾透過液洗濾時多出2.7%的αs-酪蛋白。

圖12 30 nm陶瓷膜在4 ℃條件下微濾和洗濾分離脫脂乳所得透過液的累積混合液中αs-酪蛋白占總蛋白的比例Fig.12 The ratio of αs-casein isolated to total proteins in permeate by 30 nm ceramic membranes with different solutions during diafiltration at 4 ℃

圖13為使用不同的洗濾液進(jìn)行多次洗濾時，膜通量的變化情況，這決定了整個過程中膜分離的速度。分離過程中，隨著β-酪蛋白、乳清蛋白、乳糖和礦物質(zhì)等的逐漸脫除，截留液中的固形物總量逐漸減少，補(bǔ)水稀釋使得料液固形物濃度進(jìn)一步下降，降低濃差極化效應(yīng)，膜通量逐漸上升[20]。使用超濾透過液進(jìn)行洗濾時，隨著洗濾次數(shù)的增加平均膜通量大幅度下降，這可能是由于添加了超濾透過液以后，膠束仍存在于原始的乳清環(huán)境中，體系固形物總量變化不明顯，長時間的濃差極化效應(yīng)導(dǎo)致膜孔徑的堵塞，從而使平均膜通量逐漸降低。

圖13 不同洗濾液下膜通量的變化Fig.13 The change of membrane flux under different solutions during diafiltration

3 結(jié)論

本研究以市售巴氏殺菌脫脂乳為原料，通過控制低溫和膜分離結(jié)合的方法制備了含β-酪蛋白和乳清蛋白的新型功能性蛋白配料。使用經(jīng)濟(jì)耐用的陶瓷膜為微濾膜材料，比較膜孔徑、分離溫度、洗濾液和洗濾次數(shù)對分離效果和膜通量的影響，旨在為工業(yè)化生產(chǎn)提供相關(guān)參考。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和高效液相色譜2種方法測定蛋白質(zhì)的組成和含量。在使用100 nm和50 nm的陶瓷膜進(jìn)行分離時，仍會有部分的酪蛋白膠束通過陶瓷膜；而使用30 nm膜進(jìn)行分離時，透過液澄清透亮，幾乎不含有酪蛋白膠束。采用30 nm陶瓷膜，在25 ℃和50 ℃分離時，透過液中主要含乳清蛋白，幾乎不含有β-酪蛋白；在4 ℃分離時，透過液中含有較多的β-酪蛋白，因此在低溫下有利于β-酪蛋白的分離。對比不同的洗濾液，可明顯的發(fā)現(xiàn)用水洗濾比用超濾透過液洗濾更有利于β-酪蛋白的分離，而且膜通量較大，有利于膜分離效果的提高。由此采用30 nm膜，控制4 ℃低溫條件，脫脂乳經(jīng)微濾濃縮3倍后，再在相同條件下補(bǔ)水洗濾4次，將膜過濾各階段所得的透過液混合，可得到β-酪蛋白和乳清蛋白的產(chǎn)率分別為51.7%和99.7%，復(fù)合蛋白中β-酪蛋白和乳清蛋白所占比例分別為51.1%和40.0%，而αs-酪蛋白的含量較低。所得復(fù)合蛋白可作為一種新型功能性蛋白配料用于嬰幼兒配方乳粉的生產(chǎn)，這樣在提高乳清蛋白含量的同時，也可以增加β-酪蛋白的含量，使得蛋白組成和比例更加接近于人乳蛋白。

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Whey protein and β-casein enriched new functional milk protein by microfiltration at low temperature

LI Jun-ke, LIU Da-song, LAI Rui-ye, YU Yun, ZHOU Peng*

(School of Food Science and Technology, State Key Laboratory of Food Science and Technology,Collaborative Innovation Center of Food Safety and Quality Control,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Commercial pasteurized skim milk was used as raw material, the pore size of membranes, temperatures, filtrate washing solutions and washing times on the effect of seperation and membrane flux were studied. SDS-PAGE and HPLC were used as qualitative and quantitative analysis to accurately characterize proteins’ separation. Results showed that at 4 ℃, using 30 nm ceramic membrane can obtain purified β-casein from skim milk, and with almost non- αs-casein. Besides, in order to maximize the separation of β-casein, deionized water was added to do the second level of filtration (or we called it as “diafiltration”) for 4 times. The yields of the β-casein and whey protein were 51.7% and 99.7% respectively; β-casein was 51.1% and whey protein was 40.0% in the compound protein. The compound protein can be used in infant formula powder.

skim milk; microfiltration; whey protein; β-casein; infant formula

碩士研究生(周鵬教授為通訊作者,E-mail: zhoupeng@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金(31471697)；教育部科學(xué)技術(shù)研究項目(113032A)

2016-09-29，改回日期：2016-11-09

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706014