張南海，涂宗財,2，何娜，王輝*，黃濤，李翠

1(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌，330047)2(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌，330022)

尿素包合法富集鰱魚魚油中多不飽和脂肪酸工藝優(yōu)化

張南海1，涂宗財1,2，何娜1，王輝1*，黃濤1，李翠1

1(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌，330047)2(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌，330022)

以鰱魚魚油(乙酯型)為原料，采用尿素包合法富集鰱魚魚油中多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，通過單因素和正交試驗確定富集PUFAs的最佳工藝條件為∶醇脲體積質(zhì)量比6∶1(mL∶g)，酯脲質(zhì)量比0.3∶1，包合溫度10 ℃，包合時間3 h。在最佳條件下進行驗證試驗，二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(decosahexaenoic acid，DHA)總含量由最初的23.09%提高到73.67%，PUFAs回收率為22.93%。

鰱魚魚油；尿素包合法；多不飽和脂肪酸；二十碳五烯酸；二十二碳六烯酸

二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(decosahexaenoic acid，DHA)屬最重要的ω-3型多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)[1]，而魚油中富含ω-3型多不飽和脂肪酸[2]。EPA和DHA具有抗血栓、降血脂、降低總膽固醇(total cholesterol，TCHO)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、促磷脂膜形成等多種重要的生理功能，對預(yù)防心血管疾病、高血壓、糖尿病、炎癥、癌癥和促進胎兒發(fā)育等具有較好的功效[2-4]。由于人體自身的生理條件不能產(chǎn)生足夠的EPA和DHA，故需要從外界攝取足夠的魚制品來滿足人體健康的需求[5]。然而，天然魚油中EPA和DHA的含量也不足以滿足人體的需求[6]。因此，對魚油中PUFAs乙酯化，并通過不同的方法進行富集成為國內(nèi)外研究熱點[7-9]。目前，國內(nèi)外在魚油富集方面主要是對深海魚油中PUFAs進行富集[10-11]，鮮見對淡水魚油中PUFAs進行富集的研究。

我國是淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖大國[12]，鰱魚是大宗淡水魚中不飽和脂肪酸含量最高的魚類，羅永康對7種淡水魚肌肉和內(nèi)臟中脂肪酸組成進行測定，得出鰱魚中PUFAs含量高達54%以上，高于其他淡水魚[13]。

目前，魚油中PUFAs的富集工藝方法主要有：低溫結(jié)晶法、尿素包合法、分子蒸餾法、超臨界CO2法、銀離子絡(luò)合法、色譜法和酶法等[14-17]。其中，尿素包合法所需的設(shè)備簡單，操作容易，生產(chǎn)成本低，尿素和乙醇均可回收再利用，并且低溫下反應(yīng)在一定程度上具有保護魚油不被氧化的作用，該技術(shù)已比較成熟[18-20]。因此，在前期研究的基礎(chǔ)上[21]，以高魚油乙酯得率的鰱魚魚油(乙酯型)為原料，采用尿素包合法富集鰱魚魚油中PUFAs，研究醇脲體積質(zhì)量比、酯脲質(zhì)量比、包合溫度和包合時間對EPA、DHA含量和PUFAs回收率的影響，確定富集工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚魚油(乙酯型)， 實驗室自制[19]。

無水乙醇、尿素：分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；正己烷：色譜純、無水Na2SO4：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；37種脂肪酸乙酯標準品：分析純，美國NuCkek-Prep公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ML104/02電子天平，梅特勒-托利儀器(上海)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州愛華儀器制造有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，河南省予華儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；DW-4型低溫試驗箱，紹興福祥精密儀器有限公司；Agilent 7890B型氣相色譜儀，美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 尿素包合法富集魚油中PUFAs

稱取一定量的尿素與體積分數(shù)為95%的乙醇置于250 mL燒瓶中，65 ℃恒溫水浴下回流攪拌至尿素全部溶解。向其中加入一定量的魚油乙酯(記作m0)，繼續(xù)攪拌回流30 min后，置于低溫實驗箱中，在適宜溫度下包合一定時間后，減壓抽濾分離出液相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去液相中乙醇，用熱的飽和NaCl溶液洗滌數(shù)次至無尿素和乙醇存在，再加入一定量無水Na2SO4去除多余水分，離心后即得到富集后的魚油(記作m1)[22]。富集后的魚油采用氣相色譜法分析其脂肪酸組成和含量。

(1)

1.3.2 氣相色譜分析

色譜柱：CP-Sil 88熔融石英毛細管柱(CP 7489 100 m×0.25 mm×0.2 μm)；檢測器：氫火焰離子檢測器；升溫程序：起始125 ℃以13 ℃/min升至160 ℃，保持26 min，再以4 ℃/min升至195 ℃，保持10 min，再以1 ℃/min升至215 ℃，保持16 min；載氣(H2)流速24 mL/min，壓力2.59×105Pa；進樣口溫度：250 ℃，進樣量1 μL；分流比：10∶1。

使用氣相色譜儀對富集后的魚油進行檢測，采用峰面積歸一法測定魚油中脂肪酸的含量。

1.3.3 尿素包合法富集魚油中PUFAs工藝優(yōu)化

1.3.3.1 富集單因素試驗

以醇脲體積質(zhì)量比、酯脲質(zhì)量比、包合時間和包合溫度為單因素，以EPA、DHA含量、EPA+DHA含量和PUFAs回收率為指標，通過單因素試驗選出富集魚油中PUFAs的最佳工藝范圍。參考他人研究富集魚油EPA和DHA實驗[23-25]，設(shè)定本試驗各因素范圍如下：醇脲體積質(zhì)量比(體積分數(shù)為95%的乙醇與尿素的體積質(zhì)量比)為4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1(mL∶g)；酯脲質(zhì)量比(乙酯型魚油與尿素的質(zhì)量比)為0.3∶1、0.4∶1、0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1；包合溫度為-10、-5、0、5、10、15、20、25 ℃；包合時間為1.0、3.0、6.0、12.0、18.0、24.0、30.0 h。

表1 L9 (34)正交實驗因素水平表

1.3.3.2 富集魚油中PUFAs工藝正交試驗設(shè)計

根據(jù)上述單因素實驗，選取醇脲體積質(zhì)量比、酯脲質(zhì)量比、包合溫度、包合時間這4 個因素，每個因素取3 個水平，制定L9(34)正交實驗表進行正交試驗分析，以EPA+DHA含量和PUFAs回收率為指標，確定最佳工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與討論

2.1.1 醇脲體積質(zhì)量比對富集PUFAs實驗的影響

圖1 醇脲體積質(zhì)量比對富集PUFAs的影響Fig.1 Effect of the volume-to-mass ratio of ethanol-to-urea on the enrichment of PUFAs

由圖1可知，隨著醇脲體積質(zhì)量比的增加，尿素在乙醇中溶解越充分，增大了尿素與脂肪酸的接觸機會，從而提高了脂肪酸的反應(yīng)程度和選擇性，即尿素包合飽和脂肪酸(saturated fatty acids，SFAs)和單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFAs)的程度增大，從而EPA+DHA含量上升，然而EPA含量先增加后降低，DHA含量先增加后降低，可能是由于與DHA相比，EPA較容易形成尿素包合物，醇脲體積質(zhì)量比越大，給EPA提供的多余的空間形成尿素絡(luò)合物，而導(dǎo)致含量降低[26]；此外，隨著醇脲比的增加，魚油也越容易溶解在體積分數(shù)為95%的乙醇中，PUFAs回收率顯著升高后趨于穩(wěn)定，在醇脲體積質(zhì)量比為7∶1時達到最大值。因此，綜合考慮，確定最佳醇脲體積質(zhì)量比為7∶1。

2.1.2 酯脲質(zhì)量比對富集PUFAs實驗的影響

尿素在低溫條件下與SFAs和MUFAs形成較穩(wěn)定的晶體包合物析出，然而PUFAs因為雙鍵數(shù)量較多，碳鏈彎曲，這種空間構(gòu)型不易被尿素包合。由圖2可知，在包合過程中，當酯脲質(zhì)量比過小時，尿素不僅與SFAs和MUFAs形成包合物，也與部分PUFAs形成包合物，使得EPA和DHA含量下降，PUFAs回收率也相應(yīng)下降；當酯脲質(zhì)量比為0.4∶1時，尿素的用量剛好用于包合SFAs和MUFAs，此時EPA+DHA含量最大；若繼續(xù)增大酯脲質(zhì)量比，尿素用量不足以包合SFAs和MUFAs，導(dǎo)致非尿素相中SFAs和MUFAs含量增加，從而EPA和DHA含量下降，由于尿素不足以使反應(yīng)完全，PUFAs回收率反而增大。因此，確定最佳酯脲質(zhì)量比為0.4∶1。

圖2 酯脲質(zhì)量比對富集PUFAs的影響Fig.2 Effect of mass ration of fish oil-to urea on the enrichment of PUFAs

2.1.3 包合溫度對富集PUFAs實驗的影響

尿素包合反應(yīng)是放熱反應(yīng)，低溫條件可以促進包合物的生成(圖3)。

圖3 包合溫度對富集PUFAs的影響Fig.3 Effect of inclusion temperature on the enrichment of PUFAs

由圖3可知，當包合溫度過低時，尿素形成包合物晶體速度過快，反應(yīng)不充分，導(dǎo)致EPA+DHA含量下降，PUFAs回收率降低；隨著包合溫度的增加，EPA+DHA含量和PUFAs回收率逐漸增大，包合溫度為15 ℃時，EPA+DHA含量達到最大；繼續(xù)升高反應(yīng)溫度，尿素與脂肪酸形成的晶體大而粗糙，脂肪酸和尿素結(jié)合不牢固，導(dǎo)致SFAs和MUFAs從脲包物中脫離出來，使得EPA+DHA含量降低。因此，選擇15 ℃作為最適包合溫度。

2.1.4 包合時間對富集PUFAs實驗的影響

由圖4可知，隨著包合時間的延長，EPA含量先增大后趨于穩(wěn)定，DHA含量略有所下降，EPA+DHA含量先上升后略有下降，在包合時間為3h時達到最大值，為73.08%；此外，PUFAs回收率先降低后趨于穩(wěn)定，可能是由于反應(yīng)時間的增加，反應(yīng)越充分，尿素與SFAs和MUFAs包合程度越大，非尿素相中PUFAs含量也就越大；時間過長，反而會造成資源和成本的浪費。因此，確定最佳包合時間為3.0 h。

圖4 包合時間對富集PUFAs的影響Fig.4 Effect of inclusion time on the enrichment of PUFAs

2.2 正交試驗分析優(yōu)化富集PUFAs工藝

對表2進行分析，影響PUFAs富集效果的因素主次關(guān)系為：酯脲質(zhì)量比﹥包合溫度﹥醇脲體積質(zhì)量比﹥包合時間。由表3可知，4 個因素均對富集PUFAs的影響有極顯著差異(P<0.01)。綜合表2和表3的分析結(jié)果，得出富集PUFAs的最佳工藝組合為A1B1C2D1，即醇脲體積質(zhì)量比為6∶1，酯脲質(zhì)量比為0.3∶1，包合溫度為10 ℃，包合時間為3 h。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.3 最佳工藝驗證

根據(jù)上述結(jié)果分析，得到最佳工藝A1B1C2D1組合。按照優(yōu)化的魚油富集工藝條件，經(jīng)行3次驗證實驗，結(jié)果如圖5和表4所示。魚油中的EPA含量為43.46%，DHA含量為29.51%，EPA+DHA含量為73.67%，魚油回收率為22.93%，高于正交試驗結(jié)果中的最優(yōu)值，與富集前相比，富集后魚油脂肪酸中SFAs和MUFAs含量明顯減少，EPA和DHA含量明顯提升。

表4 富集前后魚油脂肪酸含量對比

圖5 富集前后魚油脂肪酸氣相色譜圖Fig.5 The fatty acid GC of fish oil ethyl ester before and after enrichment

3 結(jié)論

本實驗對尿素包合法富集魚油中PUFAs工藝條件進行優(yōu)化，通過單因素和正交試驗研究醇脲體積質(zhì)量比、酯脲質(zhì)量比、包合溫度和包合時間4個因素對EPA、DHA含量和PUFAs回收率的影響，得到最佳工藝組合為A1B1C2D1，即醇脲體積質(zhì)量比為6∶1(mL∶g)，酯脲質(zhì)量比為0.3∶1，包合溫度為10 ℃，包合時間為3 h，EPA+DHA含量為73.67%，提升了3.19倍，PUFAs回收率為22.93%，可用于制備高PUFAs含量產(chǎn)品，提高魚油的附加值。該方法操作方便、生產(chǎn)成本低，試劑可回收再利用，有利于工廠化大規(guī)模生產(chǎn)。

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Enrichment of polyunsaturated fatty acids extraction in fish oil from Silver Carp by urea inclusion method

ZHANG Nan-hai1,TU Zong-cai1,2,HE Na1,WANG Hui1*,HUANG Tao1,LI Cui1

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)2(College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

Using fish oil from Silver Carp (ethyl ester) as raw materials, polyunsaturated fatty acids (PUFAs) extraction was enriched by urea inclusion method. The optimal process conditions were determined through single factor and orthogonal experiments. The optimum conditions were as follows: the volume-to-mass ratio of ethanol-to-urea was 6∶1(mL∶g), the mass ratio of fish oil-to urea was 0.3∶1, the inclusion temperature was 10 ℃ and the inclusion time was 3 h. Under the optimal condition, the total content of eicosapentaenoic acid (EPA) and decosahexaenoic acid (DHA) reached 73.67% from 23.09% and the PUFAs recovery was 22.93%.

fish oil from Silver Carp; urea inclusion method; polyunsaturated fatty acids; eicosapentaenoic acid; decosahexaenoic acid

碩士(王輝博士為通訊作者,E-mail：wanghui00072@aliyun.com)。

國家高新技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)項目(2011AA100803)；江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助(JXARS-03)；江西省重大生態(tài)安全問題監(jiān)控協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目(JSX-EW-00)

2016-10-27，改回日期：2016-11-22

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706025