胡 然,陸 峰,卞筱泓,許激揚(yáng)*

(1.中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 211198；2.第二軍醫(yī)大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200433)

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MIP-SERS技術(shù)快速檢測(cè)中藥中非法添加的茶堿

胡 然1,陸 峰2,卞筱泓1,許激揚(yáng)1*

(1.中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 211198；2.第二軍醫(yī)大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200433)

建立了分子印跡技術(shù)(MIP)與表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)聯(lián)用對(duì)中藥中非法添加的茶堿成分快速檢測(cè)的方法?；诔恋砭酆戏椒ê铣蒑IP微球，對(duì)復(fù)雜中藥基質(zhì)中的茶堿進(jìn)行簡(jiǎn)單分離，采用SERS對(duì)MIP中吸附的茶堿進(jìn)行定性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)利用SEM，F(xiàn)T-IR對(duì)MIP結(jié)構(gòu)表征，考察了MIP的熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)和選擇性吸附能力，以及摻雜成分的檢出限。結(jié)果表明，MIP比NIP對(duì)茶堿具有更好的特異性吸附和選擇性，該方法對(duì)茶堿的檢出限低至0.1 μg/L。方法用于5種止咳平喘類(lèi)中藥的檢測(cè)，其中1種中藥檢出非法添加了茶堿成分。該法靈敏度高，特異性強(qiáng)，無(wú)需前處理，簡(jiǎn)單快速，實(shí)現(xiàn)了摻偽中藥中茶堿的快速檢測(cè)，有望進(jìn)一步應(yīng)用于其他復(fù)雜基質(zhì)體系。

分子印跡技術(shù)；表面增強(qiáng)拉曼光譜；中藥摻偽；茶堿

近年來(lái)，中藥及保健品中非法添加化學(xué)成分的現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮，愈演愈烈，2017年1月，國(guó)家食藥總局查處了近200批次的中藥飲片，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在染色、增重、摻假現(xiàn)象。這些非法添加的化學(xué)品由于本身的毒性或因隨意大量添加均會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生巨大的危害，甚至造成死亡。

目前分析領(lǐng)域中常見(jiàn)的檢測(cè)手段包括傳統(tǒng)的高效液相色譜法(HPLC)[1]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[2]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[3]、薄層色譜-表面增強(qiáng)拉曼光譜法(TLC-SERS)[4]、表面等離子共振(SPR)[5]等，但這些方法具有耗時(shí)，成本高，前處理繁瑣，對(duì)儀器和操作人員要求高，需大量有機(jī)溶劑等缺點(diǎn)，不能滿(mǎn)足當(dāng)前分析檢測(cè)領(lǐng)域快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單的要求。

分子印跡技術(shù)(Molecular impriting technology，MIT)通過(guò)“抗原-抗體”原理制備仿生材料，以目標(biāo)分析物作為模板，能夠在復(fù)雜基質(zhì)中特異性識(shí)別和分離出目標(biāo)分子，從而達(dá)到有效分離和富集的作用。表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface-enhanced Raman scattering，SERS)是一種活性拉曼分子在金屬表面信號(hào)被強(qiáng)烈放大的分子譜學(xué)技術(shù)，其靈敏度高，甚至可實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道“MIP-SERS”聯(lián)用技術(shù)在食品藥品中的檢測(cè)應(yīng)用，包括檢測(cè)蘇丹紅Ⅰ[6]、三聚氰胺[7]、普萘洛爾[8]、氯霉素[9]等，但國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究報(bào)道較少。本文采用“MIP-SERS”對(duì)中藥中非法添加茶堿進(jìn)行了檢測(cè)研究，以期達(dá)到快速、簡(jiǎn)單、特異性好和靈敏度高的目的。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

XW-80A型旋渦混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；TG16-WS高速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)有限公司)；BWS415-785H便攜式拉曼光譜儀(B&W Tek,USA)；ALPHA傅立葉變換紅外光譜儀(德國(guó)Bruker公司)；掃描電鏡(ZeissEVOMA-10)。

甲基丙烯酸(MAA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、偶氮異二丁腈(AIBN)均購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司，使用前均去除阻聚劑；茶堿、咖啡因、多索茶堿均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；甲醇、乙腈、冰乙酸等購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，除乙腈為色譜純外，其他均為分析純；中藥樣品由山東省食品藥品檢驗(yàn)所提供。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 茶堿MIP的合成

茶堿MIP的合成方法主要參考文獻(xiàn)[10]，取茶堿47 mg，加入40 mL乙腈，超聲溶解，依次加入87.5 μL MAA，770 μL EGDMA以及14 mg AIBN，氮吹10 min，密封，60 ℃水浴聚合6 h,將聚合物離心，甲醇洗去多余乙腈，再用甲醇-冰乙酸(8∶2，體積比)振蕩洗脫，直至紫外檢測(cè)不到茶堿模板分子，最后用甲醇洗去殘余冰乙酸，用水洗去甲醇，真空干燥后即得MIP。非印跡聚合物除了不加茶堿外，其余操作步驟同上。

1.3 納米銀膠的合成

根據(jù)文獻(xiàn)“Lee”法膠[11]的合成方法，將36 mg AgNO3溶于10 mL水，置于三頸燒瓶中，加入190 mL水加熱至微沸，同時(shí)將100 mg檸檬酸鈉溶于10 mL水，取4 mL快速加入三頸燒瓶中，加熱回流40～50 min即可。

1.4 吸附能力考察

配制不同濃度的茶堿標(biāo)準(zhǔn)水溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，分別取2 mL茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液與5 mg茶堿MIP和茶堿NIP在25 ℃室溫下振蕩12 h，離心，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，測(cè)其紫外吸光度。取一定濃度的茶堿水溶液，加入5 mg茶堿MIP，在10～180 min后分別測(cè)量吸附后的紫外吸光度。

1.5 MIP的拉曼表征

將結(jié)構(gòu)相似的10 mg/L的咖啡因、茶堿、多索茶堿溶液分別與5 mg MIP微球混合，振蕩12 h后，與等體積的銀膠1∶1混合后采集拉曼信號(hào)。 配制不同濃度的茶堿水溶液，分別與5 mg MIP材料混合振蕩2 h后，與等體積的銀膠1∶1混合后采集拉曼信號(hào)。

1.6 中藥樣品的檢測(cè)

取5份中藥真實(shí)樣品適量，研細(xì)，加入水中超聲5 min,離心取上清液與5 mg MIP材料振蕩10 min,離心，水洗3次，與銀膠1∶1混合后采集其拉曼信號(hào)。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米銀膠的表征

本文選擇最常用的Lee法膠作為銀溶膠，通過(guò)紫外圖譜可以觀(guān)察到納米銀在420 nm左右有1個(gè)較強(qiáng)的單峰(圖1A)，反映出納米銀顆粒呈較好的均一性球形，其直徑約為40～60 nm[12]，進(jìn)一步通過(guò)掃描電鏡(圖1B)佐證納米銀顆粒的形狀和直徑，為SERS的增強(qiáng)效果和穩(wěn)定性提供了保證。

2.2 茶堿MIP的合成與表征

2.2.1 茶堿與功能單體比例的優(yōu)化 采用紫外光譜對(duì)茶堿模板分子和甲基丙烯酸功能單體的比例(茶堿空白，1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8)進(jìn)行篩選。觀(guān)察到當(dāng)甲基丙烯酸的比例不斷增大時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)從275 nm紅移至277 nm,這主要是由于茶堿與甲基丙烯酸的羧基發(fā)生了氫鍵結(jié)合[13]，當(dāng)模板分子和功能單體的比例為1∶4時(shí)，繼續(xù)增大甲基丙烯酸的比例，最大吸收波長(zhǎng)基本不發(fā)生變化，說(shuō)明1個(gè)茶堿分子可結(jié)合4個(gè)甲基丙烯酸。

圖2 MIP(a)和NIP(b)吸附茶堿后的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of MIP(a) and NIP(b) after adsorpting theophylline

2.2.2 茶堿MIP及茶堿NIP 的掃描電鏡圖 采用掃描電鏡對(duì)茶堿MIP及NIP進(jìn)行表征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NIP的均一性?xún)?yōu)于MIP，可能是由于相對(duì)于NIP 微球，MIP微球內(nèi)部需要更多的茶堿孔穴，造成了大小、孔徑和分布不均一[14]，這種微觀(guān)的不均一性在宏觀(guān)上呈現(xiàn)出微球大小的不均一。

2.3 MIP的吸附曲線(xiàn)

茶堿與MIP和NIP分別振蕩12 h后，離心，考察了MIP和NIP對(duì)茶堿的靜態(tài)結(jié)合等溫線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MIP對(duì)茶堿的吸附能力明顯強(qiáng)于NIP，MIP對(duì)茶堿的飽和吸附量約為22 mg/g，而NIP不足10 mg/g。這主要是因?yàn)镸IP以茶堿為模板形成的三維孔穴與茶堿分子更為接近，而NIP的孔穴卻無(wú)均一性，對(duì)茶堿的選擇性更差。因此，對(duì)于相同濃度的茶堿溶液，MIP的吸附能力好于NIP。

2.4 THO@MIP的拉曼識(shí)別特性

圖3分別為0.5 mg/L茶堿溶液與MIP和NIP結(jié)合后的SERS圖譜以及茶堿本身的SERS圖譜，從圖中可以看到571，696，1 305 cm-1處的峰主要來(lái)自茶堿嘧啶和咪唑環(huán)的伸縮振動(dòng)，1 258 cm-1處屬于嘧啶環(huán)上的甲基振動(dòng)峰，在吸附茶堿后，MIP的茶堿峰增大明顯好于NIP，這主要是MIP對(duì)茶堿的特異性吸附導(dǎo)致。

圖3 MIP和NIP結(jié)合茶堿后的SERS圖譜Fig.3 SERS spectra of MIP and NIP after rebinding of theophylline

圖4 MIP-SERS對(duì)茶堿檢出限Fig.4 Detection limit of theophylline with MIP-SERS

2.5 THO@MIP的拉曼選擇性

為了進(jìn)一步考察MIP的選擇性，將0.5 mg/L的茶堿、咖啡因、多索茶堿溶液分別與MIP混合攪拌一段時(shí)間。結(jié)果顯示，茶堿的SERS信號(hào)好于咖啡因和多索茶堿，這也證明在結(jié)構(gòu)類(lèi)似物中，茶堿比咖啡因和多索茶堿更適合MIP中的孔穴，而相比于茶堿，咖啡因由于多1個(gè)甲基官能團(tuán)，導(dǎo)致位阻增大，因此對(duì)MIP的孔穴識(shí)別能力下降，而多索茶堿的官能團(tuán)更大，這可能是咖啡因的SERS強(qiáng)于多索茶堿的原因之一。

2.6 MIP-SERS檢出限

考察了不同濃度的茶堿溶液與MIP攪拌10 min后的拉曼信號(hào)。結(jié)果顯示，當(dāng)茶堿濃度大于1.0 mg/L 時(shí)，拉曼圖譜以茶堿信號(hào)為主,而當(dāng)濃度低于1.0 mg/L時(shí)，拉曼圖譜發(fā)生了變化(見(jiàn)圖4)，考慮此時(shí)茶堿濃度過(guò)低，拉曼峰以MIP材料的拉曼峰為主，571 cm-1和1 305 cm-1的兩個(gè)尖銳峰屬于茶堿分子不同振動(dòng)模式的峰，但1 305 cm-1處的特征峰在低濃度時(shí)干擾較大，所以選擇571 cm-1的茶堿特征峰為檢出限的識(shí)別特征峰。以571 cm-1的茶堿特征峰為標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)茶堿濃度低于1.0 μg/L時(shí)，仍然可以判斷目標(biāo)基質(zhì)中含有茶堿，低于文獻(xiàn)報(bào)道的10-7mol/L[16]。

2.7 實(shí)際樣品的考察

采用MIP-SERS對(duì)5份真實(shí)中藥樣品進(jìn)行檢測(cè)，除了3號(hào)樣品外，其他4份樣品在571 cm-1茶堿特征峰處均未出峰，而3號(hào)樣品在571 cm-1處有強(qiáng)峰，表明3號(hào)樣品非法添加了茶堿。本方法整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不超過(guò)30 min，完全滿(mǎn)足快速檢測(cè)的要求。

3 結(jié) 論

本文以茶堿為檢測(cè)對(duì)象，將“MIP-SERS”分析手段運(yùn)用于中藥中茶堿摻偽的快速檢測(cè)，該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)單，快速，滿(mǎn)足當(dāng)前分析檢測(cè)方法的發(fā)展要求。“MIP-SERS”有望進(jìn)一步應(yīng)用于其他分析領(lǐng)域。

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Rapid Detection of Theophylline Illegally Mixed in Traditional Chinese Medicine by MIP-SER

SHU Ran1，LU Feng2,BIAN Xiao-hong1,XU Ji-yang1*

(1.College of Science and Technology，China Pharmceutical University，Nanjing 211198，China;2.School of
Pharmacy,The Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)

A rapid method combining molecularly imprinted polymers with surface-enhanced Raman spectroscopy(MIPs-SERS) was established for the determination of theophyline illegally added into traditional Chinese Medicine.MIPs were synthesized by precipitation polymerization,and the theophylline was simply separated from the complex traditional Chinese medicine(TCM) substrates, then detected qualitatively by SERS.The structures of the newly synthesized MIPs were characterized by Fourier transmission infrared spectrometry(FT-IR) and scanning electron microscopy(SEM).The thermodynamics and kinetics and selective adsorption capacity of the MIPs，as well as the limit of detection for adulteration were also investigated.The results showed that MIPs had a better specificity and selectivity than NIPs，and the limit of detection was as low as 1 μg/L.Five kinds of real TCM relieving cough and asthma were tested，and one sample was detected to have theophylline components added illegally. With the advantages of high sensitivity，strong specificity，no pretreatment，simplicity and rapidness,the method could be used for the rapid detection of theophylline illegally added in TCM and further applied in other complicated matrix system.

molecularly imprinted technology；surface enhanced Raman spectroscopy；traditional Chinese medicine(TCM) adulteration;theophylline

2017-02-15；

2017-04-15

國(guó)家重大儀器開(kāi)發(fā)專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(2012YQ18013203)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.07.011

O657.3；TQ460.72

A

1004-4957(2017)07-0902-05

*通訊作者：許激揚(yáng)，博士，教授，研究方向：藥物生物合成，Tel:025-83271306，E-mail:jiyangx@126.com