宋印清，王 敏，王彤彤，周 劍，楊夢(mèng)瑞

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081)

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反門(mén)控去耦技術(shù)在定量1H NMR測(cè)定苯乙醇胺A純度中的應(yīng)用

宋印清，王 敏*，王彤彤*，周 劍，楊夢(mèng)瑞

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081)

采用定量核磁中反門(mén)控去耦的方法對(duì)苯乙醇胺A的純度進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)對(duì)氘代溶劑和內(nèi)標(biāo)物、定量峰的選擇，以及弛豫延遲時(shí)間(D1)，采樣次數(shù)和采樣溫度等定量核磁條件的優(yōu)化，最終確定測(cè)試條件為：激發(fā)脈沖角度30，時(shí)間域數(shù)據(jù)點(diǎn)32 K，測(cè)定溫度293 K，脈沖的弛豫延遲為33.64 s，采樣次數(shù)64，線寬0.3 Hz。在此實(shí)驗(yàn)條件下，穩(wěn)定性可達(dá)24 h，耐用性良好。以樣品和內(nèi)標(biāo)的峰面積比對(duì)其摩爾比繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，兩者的摩爾比在0.333～3.333范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 9。該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便，適用于該類型化合物含量的測(cè)定。

苯乙醇胺A；定量核磁；反門(mén)控去耦；純度

苯乙醇胺A又名克倫巴胺，是一種β-受體激動(dòng)劑，具有β-受體激動(dòng)劑的典型結(jié)構(gòu)。它是一種人工合成的化學(xué)物質(zhì)，是福莫特羅的同分異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1)與萊克多巴胺類似[1]。苯乙醇胺A是2010年新發(fā)現(xiàn)的一種瘦肉精，具有營(yíng)養(yǎng)再分配的作用，添加到飼料中可加速脂肪的分解和轉(zhuǎn)化，提高動(dòng)物的瘦肉率、減少飼料使用，降低成本[2]；但人食用上述物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生心律失常、心慌、心悸、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)等中毒癥狀[3]，可誘發(fā)和加重心腦血管病人的病情，因此我國(guó)頒布了1519號(hào)公告，禁止將苯乙醇胺A等11種物質(zhì)添加于飼料和動(dòng)物飲用水中。國(guó)內(nèi)外針對(duì)苯乙醇胺A的測(cè)定主要以高效液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法為主。

圖1 苯乙醇胺A的結(jié)構(gòu)式 Fig.1 Structural formula of phenylethanolamine A

圖2 氫譜中反轉(zhuǎn)門(mén)控去耦的脈沖序列Fig.2 Pulse sequence for inverse gated decoupling in 1H NMR

定量核磁共振(Quantitative nuclear magnetic resonance,qNMR)不需要待測(cè)物對(duì)照品，僅以已知含量的藥物或化學(xué)物質(zhì)為參比即可對(duì)待測(cè)物含量進(jìn)行測(cè)定[4]。該方法具有前處理步驟簡(jiǎn)單、快捷等優(yōu)點(diǎn)，已被各國(guó)藥典所收錄[5-6]。近年來(lái)，qNMR技術(shù)已被廣泛用于定量分析，主要包括藥物的含量測(cè)定[7-8]、異構(gòu)體[9]和食品領(lǐng)域[10]。qNMR包括1H，13C，19F，31P，14N，15N-NMR等，其中1H由于豐度和靈敏度高，適用范圍廣，因此被國(guó)內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)廣泛報(bào)道[11-13]。核磁共振中常規(guī)的去耦方式[14]包括寬帶去耦、門(mén)控去耦和反門(mén)控去耦。寬帶去耦無(wú)耦合，有奧弗豪塞爾核效應(yīng)(NOE)；門(mén)控去耦既有耦合現(xiàn)象也有NOE現(xiàn)象，對(duì)于氫譜和碳譜定量和解析均有明顯的影響；反門(mén)控去耦技術(shù)是指去耦器在弛豫延遲期關(guān)閉而在采樣期打開(kāi)，脈沖序列如圖2所示，該技術(shù)既無(wú)耦合現(xiàn)象也無(wú)NOE現(xiàn)象，最適于氫譜和碳譜的定量。本文在定量氫譜中運(yùn)用反門(mén)控去耦技術(shù)測(cè)定了違禁獸藥苯乙醇胺A的純度，并用于苯乙醇胺A純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制作。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE Ⅲ型400 MHz核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；UMX2型電子天平(分度值0.1 μg，瑞士梅特勒公司)；苯乙醇胺A(Laboratorien Berlin Adlerhof GmbH，德國(guó))；氘代甲醇(純度99.8%，美國(guó)Sigma公司)；尼泊金乙酯(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，GBW(E)100064)， 5 mm核磁管(WG-1000-7， 美國(guó)Wilmad公司)。苯甲酸 (中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，GBW(E)100064)，鄰苯二甲酸氫鉀 (中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，GBW(E)100064)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品配制方法 分別精確稱量約1.0～10.0 mg樣品和3.0 mg內(nèi)標(biāo)物各3份置于同一棕色玻璃瓶，用1.0 mL氘代甲醇振蕩完全溶解后，轉(zhuǎn)移至直徑為5 mm的核磁試管中，待測(cè)。

1.2.2 核磁實(shí)驗(yàn)參數(shù)與圖譜處理方法1H NMR測(cè)定參數(shù)：進(jìn)行3D勻場(chǎng)和自動(dòng)調(diào)諧，激發(fā)脈沖角度30，采集時(shí)間4.0 s，時(shí)間域數(shù)據(jù)點(diǎn)64 K，掃描寬度20 ppm， 弛豫延遲 (D1≥5T1)，自動(dòng)調(diào)節(jié)增益， 中心頻率(位于定量峰和內(nèi)標(biāo)峰的中心位置)， 窗函數(shù)0.3 Hz。

圖譜的處理方法：通過(guò)Topspin 2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，利用ACD Lab軟件進(jìn)行處理，均依次采用自動(dòng)和手動(dòng)相位調(diào)整，自動(dòng)和手動(dòng)基線校準(zhǔn)及根據(jù)氘代甲醇的氫譜數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)位移校正。在基線與峰的重合擴(kuò)大± 0.1 Hz范圍內(nèi)進(jìn)行積分。

1.2.3 計(jì)算方法 取苯乙醇胺A和尼泊金乙酯，按樣品制備方法平行配制3份樣品，樣品振蕩溶解后，在優(yōu)化條件下記錄圖譜，每個(gè)樣品平行測(cè)量5次，并取平均值。

式中：PNMR為采用核磁共振法測(cè)得的被測(cè)物純度；Ix和Istd分別為樣品和內(nèi)標(biāo)物指定峰的積分面積；nx和nstd分別為樣品和內(nèi)標(biāo)物指定峰的核群核個(gè)數(shù)；Mx和Mstd分別為樣品和內(nèi)標(biāo)物的分子量；mx和mstd分別為樣品和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量；Pstd為內(nèi)標(biāo)物的純度。

2 結(jié)果與討論

2.1 氘代溶劑與內(nèi)標(biāo)物的選擇

氘代溶劑應(yīng)使樣品和內(nèi)標(biāo)有良好的溶解度?？紤]到苯乙醇胺A的極性大，因此選擇氘代甲醇作為溶劑。內(nèi)標(biāo)物選擇的依據(jù)為：易溶于氘代試劑，化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，屬于國(guó)家級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，且不與待測(cè)化合物反應(yīng)。由于兩種內(nèi)標(biāo)苯甲酸和鄰苯二甲酸氫鉀均呈酸性，易與苯乙醇胺A發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成季銨鹽，因此不適合作為本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)標(biāo)。國(guó)家級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)尼泊金乙酯不與苯乙醇胺A發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，易溶于氘代甲醇中，且定量峰分布均勻，與苯乙醇胺A均含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，因此采用尼泊金乙酯作為內(nèi)標(biāo)。

圖3 苯乙醇胺A和尼泊金乙酯混合物的氫譜圖Fig.3 qNMR spectra of phenylethanolamine A and ethyl paraben mixture

No.PhenylethanolamineAEthylparabenT1(s)δ(ppm)T1(s)δ(ppm)18.152.9107.863.05827.441.9156.803.11737.281.3284.302.08046.901.7571.353.62854.481.45163.781.61072.770.65381.850.23391.690.568101.150.712

determination longitudinal relaxation delay time(T1):(T1 delay=0.01,0.05,0.1,0.25,0.5,1,2,4,8,15μs)were measured by inversion recovery method,and the T1values of different peaks were obtained by data fitting(縱向弛豫時(shí)間T1測(cè)定方法：采用反轉(zhuǎn)恢復(fù)法測(cè)定T1，利用軟件Topspin 2.1進(jìn)行采樣(T1delay=0.01， 0.05，0.1， 0.25， 0.5， 1， 2， 4， 8， 15 μs)， 經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)擬合得到不同峰的T1值)

2.2 氫譜定量峰的選擇

定量峰必須滿足在積分范圍中無(wú)干擾，且信號(hào)的化學(xué)位移和縱向弛豫時(shí)間(T1)盡可能接近內(nèi)標(biāo)物的信號(hào)峰，以減少誤差。在兩者混合物氫譜中發(fā)現(xiàn)(如圖3)，苯乙醇胺A的高場(chǎng)區(qū)可能受到微量雜質(zhì)的影響，而苯環(huán)區(qū)基線平穩(wěn)，受到雜質(zhì)影響的幾率較小。同時(shí)苯乙醇胺A的化學(xué)位移在δH8.15處共振譜線的縱向弛豫時(shí)間為2.910 s，而內(nèi)標(biāo)物尼泊金乙酯在δH7.86處縱向弛豫時(shí)間為3.058 s，兩者之間十分接近，且兩峰之間的化學(xué)位移相差大于0.4 Hz，滿足qNMR對(duì)內(nèi)標(biāo)和檢測(cè)物標(biāo)定譜線選擇的條件 (表1)。確定兩定量峰后，將定量氫譜的中心頻率設(shè)在δH8.00 處，以降低偏共振效應(yīng)(Off-resonance effect)的影響。

2.3 核磁條件的優(yōu)化

2.3.1 脈沖弛豫延遲時(shí)間(D1)的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15]，D1/T1比值增加，會(huì)提高實(shí)驗(yàn)的精確度。為了保證定量峰的自旋核能夠達(dá)到99%以上弛豫，必須使D1/T1≥5，因此需進(jìn)一步優(yōu)化兩者比值，以滿足定量核磁的要求。在優(yōu)化的定量峰條件下，縱向弛豫時(shí)間T1=3.058 s，分別考察不同D1/T1(5、8、11、14、17)條件下樣品與內(nèi)標(biāo)物的定量峰面積比，其結(jié)果分別為1.723、1.725、1.727、1.727、1.727。D1/T1= 11時(shí)，樣品與內(nèi)標(biāo)物的定量峰面積比值無(wú)明顯變化，能夠滿足定量要求，因此選擇D1= 33.64 s。

2.3.2 采樣次數(shù)的選擇 取1.0 mg苯乙醇胺A和3.0 mg尼泊金乙酯內(nèi)標(biāo)，D1= 33.64 s，在不同采樣次數(shù)(8、16、32、64、128次)條件下，分別測(cè)定定量峰8.15 ppm與基線9.0 ppm間的信號(hào)強(qiáng)度，利用Topspin 2.1軟件計(jì)算S/N。結(jié)果表明，譜圖的信噪比S/N與采樣次數(shù)的平方根成正比，擴(kuò)大采樣次數(shù)有利于提高采樣的信噪比。由于核磁共振定量要求S/N≥250，因此確定采樣次數(shù)為64次。

2.3.3 采樣溫度的選擇 取約1.0 mg苯乙醇胺A和3.0 mg尼泊金乙酯內(nèi)標(biāo)，在上述優(yōu)化條件下，對(duì)采樣溫度(T=15、20、25、30、35 ℃)進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明采樣溫度對(duì)內(nèi)標(biāo)物和樣品的積分面積影響很小，可以忽略不計(jì)。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍 分別精密稱取樣品約1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 mg，內(nèi)標(biāo)物尼泊金乙酯3.0 mg，置于同一離心管中，按照“1.2”的方法平行配制5份樣品溶液，按照“2.3”優(yōu)化后的條件測(cè)量氫譜。以樣品/內(nèi)標(biāo)摩爾比為橫坐標(biāo)(x)，樣品/內(nèi)標(biāo)定量峰面積比為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性擬合。結(jié)果表明，樣品與內(nèi)標(biāo)的摩爾比在0.333 3～3.333 3范圍內(nèi)，氫信號(hào)與樣品量成正比，方法的線性關(guān)系良好，回歸方程為y=1.013 7x-0.001 6，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 9。

2.4.2 精密度 精密稱取4.0 mg苯乙醇胺A和3.0 mg尼泊金乙酯，按照“2.3”優(yōu)化后的條件測(cè)量日內(nèi)和日間的氫譜和碳譜。結(jié)果顯示，定量氫譜中苯乙醇胺A與尼泊金乙酯峰面積(NA/NA)的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.15%，日間RSD為0.18%。相對(duì)于其他去耦方式，反門(mén)控去耦[16]可以造成13C對(duì)1H的耦合作用，因此該方法的精密度更適合于定量氫譜。

2.4.3 方法比較 利用“2.4.2”制備在核磁管中的樣品，與常見(jiàn)定量氫譜進(jìn)行方法比對(duì)，結(jié)果顯示：常見(jiàn)定量氫譜采用寬帶去耦方式，其日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.35%，高于反門(mén)控去耦的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(0.15%)，原因可能是受到衛(wèi)星峰的影響。

2.5 方法的應(yīng)用

取購(gòu)于國(guó)外公司的兩份苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)品，分別進(jìn)行精確稱量，并加內(nèi)標(biāo)物尼泊金乙酯于試管中，完全溶解后注入核磁管中，在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行測(cè)定，分別測(cè)得兩種樣品中苯乙醇胺A的含量為99.3%(RSD=0.18%)和99.5%(RSD=0.11%)，表明該方法結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

3 結(jié) 論

通過(guò)反門(mén)控去耦消除衛(wèi)星峰，有利于譜線積分區(qū)域的設(shè)定，在譜線相對(duì)比較接近時(shí)可抑制衛(wèi)星峰信號(hào)對(duì)標(biāo)定峰定量積分的影響。因此，定量核磁方法中的反門(mén)控去耦技術(shù)有望成為定量方法，相信隨著該技術(shù)在分析領(lǐng)域應(yīng)用的不斷深入，能為不同領(lǐng)域成分和含量分析開(kāi)拓新的思路和方法。

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Application of Inverse Gated Decoupling Technique in Quantitative1H NMR Determination of Purity of Phenylethanolamine A

SONG Yin-qing,WANG Min*,WANG Tong-tong*,ZHOU Jian,YANG Meng-rui

(Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-products,Chinese Academy of Agriculture,Beijing 100081,China)

A high accuracy method of qNMR with inverse gated decoupling technique was established to determine the content of phenylethanolamine A.Considering the choice of deuterated solvents,internal standards and quantitative peaks,and the optimization of relaxation delay,aquisition number and temperature,the final measurement conditions of qNMR spectra were as follows:flip angle:30,date point:32 K,detection temperature:293 K,a relaxation delay:33.64 s,acquisition times:64 times,line broadening:0.3 Hz.The experimental results showed that the stability of this condition could be maintained for 24 h.A good linear relationship was obtained between peak area ratio and molar ratio in the range of 0.333-3.333,and the correlation coefficient (r2) was 0.999 9.The established method is specific,accurate and simple,and could be used for the content determination of this kind of compounds.

phenylethanolamine A；qNMR；inverse gated decoupling;purity

2016-12-22；

2017-03-11

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程；農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制與質(zhì)量控制規(guī)范研究(2015)(GJFP201501503)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.07.018

O482.532；TQ460.72

A

1004-4957(2017)07-0933-04

*通訊作者：王 敏，研究員，研究方向：標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，Tel：010-82106546，E-mail:wangmincaas@126.com 王彤彤，博士，助理研究員，研究方向：有機(jī)合成，Tel：010-82106545，E-mail：wangttong123@126.com