曹桂紅,王興寧

(1.貴州食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550012；2.貴州出入境檢驗檢疫局 綜合技術(shù)中心，貴州 貴陽 550081)

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氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測煙草中15種苯氧羧酸類除草劑殘留

曹桂紅1,王興寧2*

(1.貴州食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550012；2.貴州出入境檢驗檢疫局 綜合技術(shù)中心，貴州 貴陽 550081)

建立了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對煙草中15種苯氧羧酸類除草劑農(nóng)藥殘留量的分析方法。樣品采用乙腈提取、Carbon TPT固相萃取柱凈化、三甲基硅烷化重氮甲烷衍生化，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對15種苯氧羧酸類除草劑進行測定,通過保留時間、選擇離子及相對豐度定性，外標法定量。結(jié)果表明,15種苯氧羧酸類除草劑在20～1 000 μg/L濃度范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.992,檢出限為0.9～3.3 μg/kg，定量下限為3.2～10.8 μg/kg。在20,100,200 μg/kg 3個加標水平下的平均回收率為71.5%～105.6%，相對標準偏差(RSD)為4.5%～14.9%。該方法簡便、快速、靈敏，適用于煙草中15種苯氧羧酸類除草劑的同時檢測。

煙草；苯氧羧酸類除草劑；氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)；固相萃取(SPE)；甲酯化

煙草是我國重要的經(jīng)濟作物,近年來，除草劑的施用極大地降低了勞動強度，有效提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率，對煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)起到了積極作用[1]。苯氧羧酸類除草劑及其鹽和酯對闊葉雜草有很好的防治效果，且易溶于水，但其在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中會遷移，引起土壤、地下水、大氣等污染[2]。苯氧羧酸類除草劑本身有中等毒性，其代謝產(chǎn)物(特別是一些鹵化物)對人類和生物體會造成危害，可引起人類軟組織惡性腫瘤，對動物體也表現(xiàn)出胎盤毒性[3-4]。

煙草中的農(nóng)藥殘留量問題成為各國煙草貿(mào)易中倍加關(guān)注的內(nèi)容，國際煙草科學(xué)研究合作中心(CORESTA) 農(nóng)用化學(xué)品咨詢委員會(ACAC)于2013年提出了煙草中120種農(nóng)藥的指導(dǎo)性殘留限量(Guidance Residue Levels，GRLs)，其中規(guī)定了3種苯氧羧酸類除草劑的殘留限量，分別是麥草畏0.2 mg/kg、2,4-滴0.2 mg/kg、2,4,5-涕0.05 mg/kg[5]。

目前，國內(nèi)外對苯氧羧酸類除草劑殘留量的檢測大多采用氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法及離子色譜法等,且主要集中于谷物、水果、蔬菜、茶葉、土壤及動物組織等樣品[6-10]。而采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)測定煙草中多種苯氧羧酸類農(nóng)藥殘留量尚未見報道。煙草中富含有機酸、煙堿、還原性糖、總糖、礦物質(zhì)等化學(xué)物質(zhì)，成分極為復(fù)雜[11]。GC-MS/MS具有氣相色譜及單級質(zhì)譜的檢測優(yōu)勢，且抗干擾能力更強[12-14],適用于煙草等復(fù)雜基質(zhì)樣品中殘留農(nóng)藥的快速篩查與確證。本文對煙草中15種苯氧羧酸類除草劑多殘留分析的樣品提取、固相萃取凈化以及GC-MS/MS的分離測定等條件進行了研究，建立了煙草中15種苯氧羧酸類除草劑殘留的測定方法，方法簡便、快速、凈化效果較好，各項技術(shù)指標均符合殘留檢測的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜儀(GC-MS/MS、7000C,美國安捷倫公司),X-22R高速冷凍離心機(美國Allegra公司),R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(美國Buchi公司),旋渦振蕩器(美國Taiboys公司)，分析天平(美國Mettler公司)，TurboVap Ⅱ氮吹儀(瑞典Biotage公司)。乙腈、丙酮、正己烷(色譜純),甲苯(分析純),氯化鈉、無水硫酸鈉(農(nóng)殘級)，三甲基硅烷化重氮甲烷衍生化試劑(0.6 mol/L)，均購于美國Sigma公司；Carbon TPT固相萃取柱(2 000 mg/12 mL，天津艾杰爾公司)。

標準品：3,5-二氯苯甲酸、麥草畏、MCPP、MCPA、2,4-滴丙酸、2,4-滴、5-氯苯酚、2,4,5-涕丙酸、草滅平、2,4,5-涕、2,4-滴丁酸、苯達松、毒秀定、地樂酚及三氟羧草醚(純度大于98%，德國DR公司)。實驗用水均為Milli-Q超純水。樣品：實驗室日常委托檢測樣品。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備液:準確稱取15種苯氧羧酸類除草劑標準品各10 mg(精確至0.1 mg)分別置于50 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度后，得到質(zhì)量濃度為200 mg/L的農(nóng)藥標準儲備液，儲存于4 ℃冰箱中。

混合標準儲備液:準確移取100 μL上述200 mg/L標準儲備液于10 mL容量瓶中，用丙酮定容，得到質(zhì)量濃度為2 mg/L的混合標準儲備液，儲存于4 ℃冰箱中。

混合標準工作溶液:取2 mg/L混合標準儲備液，配制成質(zhì)量濃度分別為20,100,200,500,1 000 μg/L的混合標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取 準確稱取2.00 g(精確至0.01 g)煙草樣品于50 mL具塞離心管中，加入5 mL水潤濕，加2 g氯化鈉和15 mL乙腈溶液振蕩混勻，靜置30 min，以5 000 r/min離心5 min收集上清液。再加15 mL乙腈重復(fù)提取1次，合并兩次提取液于100 mL濃縮瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃水浴蒸發(fā)濃縮至約1 mL，待凈化。

1.3.2 凈 化 在Carbon TPT固相萃取柱中加入1 cm高的無水硫酸鈉，加樣前用5 mL乙腈-甲苯溶液(體積比為3∶1)預(yù)淋洗該柱，棄去淋洗液，當(dāng)液面到達無水硫酸鈉頂部時，迅速將樣品提取濃縮液轉(zhuǎn)入該柱，下接15 mL玻璃試管，分別用1 mL乙腈-甲苯溶液(3∶1)洗滌濃縮瓶3次，將全部洗滌液轉(zhuǎn)入Carbon TPT固相萃取柱中，待液面到達無水硫酸鈉頂部時，用15 mL乙腈-甲苯溶液(3∶1)洗脫，收集所有流出液，待衍生。

1.3.3 衍生化 將收集的洗脫液在40 ℃水浴中氮吹濃縮至近干,用5 mL正己烷淋洗試管壁，氮吹近干，再用5 mL正己烷淋洗1次，用平緩氮氣吹至約1 mL，加入100 μL三甲基硅烷化重氮甲烷衍生劑，蓋塞混勻后，于40 ℃下水浴10 min，再用平緩氮氣流吹至近干，用丙酮溶解并定容至1 mL，過0.2 μm有機濾膜后供GC-MS/MS分析。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：DB-5 MS毛細管柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：250 ℃，不分流進樣；載氣:He(純度>99.999%),流速為1 mL/min；進樣量為1 μL；升溫程序：起始溫度70 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升至290 ℃，保持10 min。

電子轟擊離子源(EI)；電子能量:70 eV；離子源溫度: 230 ℃；接口溫度:280 ℃；溶劑延遲時間:5 min；檢測器電壓：1.0 kV；碰撞氣：氦氣，流速1.5 mL/min；數(shù)據(jù)掃描方式:正離子；測定方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測方式(MRM)。每種化合物通過GC-MS/MS檢測的保留時間、離子對等相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 15種苯氧羧酸類除草劑的色譜保留時間及質(zhì)譜條件Table 1 Retention times and EI-MS/MS conditions for 15 phenoxyacid herbicides

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

比較了常用于除草劑前處理的乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷、正己烷和乙酸乙酯等溶劑的提取效果。結(jié)果表明,丙酮和甲醇的極性較強,對大多數(shù)除草劑能夠充分提取,但也提取出煙草中大量的油脂和色素,從而給下一步凈化帶來困難。乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷提取的色素和油脂較少,但不能完全提取煙草組織中的殘留除草劑,提取效率低。而乙腈能有效提取大多數(shù)除草劑,且對油脂和色素提取較少,易于凈化,所以本實驗最終選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化方法的研究

固相萃取(SPE)凈化技術(shù)是農(nóng)殘檢測中較常見的前處理方式，對于不同溶液中的污染物可分別利用反相、離子交換、螯合樹脂等多種手段進行，具有溶劑用量少、便捷、安全、高效等特點。本文比較了Carbon TPT、石墨化碳(GC-NH2)、弗羅里硅土(FL-PR)、C184種固相萃取柱對添加了混合標準溶液的空白樣品的凈化效果，以15 mL乙腈-甲苯(3∶1)為洗脫液，經(jīng)衍生化和濃縮定容后檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Carbon TPT柱與GC-NH2柱的效果優(yōu)于FL-PR柱和C18柱，這是由于FL-PR柱和C18柱對色素雜質(zhì)的吸附能力較弱，基質(zhì)干擾較大，而Carbon TPT柱對色素雜質(zhì)的吸附性最強，凈化效果最好，因此實驗最終選擇Carbon TPT柱為凈化萃取柱。

2.3 衍生化條件的選擇

分別比較了不同的溫度(20、30、40、50、60 ℃)與時間(10、30、60、120 min)條件對衍生化效果的影響。結(jié)果表明，溫度低于40 ℃時，隨著溫度的升高，其所需的衍生化時間逐漸縮短，如20 ℃時所需要的衍生時間為60 min，30 ℃時所需要的衍生時間為30 min，實驗結(jié)果與文獻一致[13]；而當(dāng)溫度≥40 ℃時只需10 min即可達到理想的衍生效果，繼續(xù)升高溫度，易導(dǎo)致溶劑揮發(fā)過快，影響試驗效果。因此實驗最終選擇衍生溫度為40 ℃，衍生時間為10 min。

圖1 15種苯氧羧酸類除草劑(100 μg/L)的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 15 phenoxyacid herbicides(100 μg/L)1.3,5-dichlorobenzoic acid,2.dicamba,3.MCPP,4.MCPA,5.dichlorprop,6.2,4-D,7.pentachlorphenol,8.2,4,5-TP, 9.chloramben,10.2,4,5-T,11.2,4-DB,12.dinoseb, 13.bentazone,14.picloram,15.acifluorfen

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將質(zhì)量濃度為5 mg/L的混合標準溶液在m/z45～500進行一級質(zhì)譜全掃描(Full scan)，通過儀器自帶解卷積軟件和NIST譜庫檢索對色譜圖進行定性分析，確定目標化合物的保留時間、質(zhì)量數(shù)及匹配度等信息。選擇特征明顯、質(zhì)量數(shù)高、重現(xiàn)性好、無干擾的離子作為母離子。其次，進行二級質(zhì)譜產(chǎn)物離子掃描，比較不同的碰撞能量獲取的產(chǎn)物離子色譜圖信息，選取重復(fù)性好、強度大、靈敏度高的碎片作為定量、定性的子離子,以豐度最高的1對子離子進行定量分析，豐度次高的1對子離子進行定性分析。最終確定各農(nóng)藥的母離子、子離子、碰撞能量、掃描時間等參數(shù)(表1)。在選定的質(zhì)譜條件下，得到了較為理想的分離效果，混合基質(zhì)標準工作溶液的MRM圖見圖1。從圖1可以看出，除了8號與9號峰未完全分離外，其余的色譜峰峰形尖銳，對稱性好，各色譜峰間完全分離。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的考察

GC-MS/MS分析方法普遍存在基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)誘導(dǎo)效應(yīng)即目標物在純?nèi)軇┖突|(zhì)中響應(yīng)存在較大差異，通常相同濃度的農(nóng)藥在基質(zhì)中表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)或基質(zhì)抑制[15-16]。

消除基質(zhì)效應(yīng)的方法有基質(zhì)凈化法、加入分析保護劑法、內(nèi)標法、基質(zhì)匹配標準溶液法等。由于分析保護劑的選擇有限且價錢昂貴，而內(nèi)標法與基質(zhì)匹配標準溶液法的前處理操作繁瑣且增加了后續(xù)數(shù)據(jù)的處理難度。本文選擇基質(zhì)凈化法去除干擾物質(zhì)，可有效降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

本文通過對比3個水平標準溶液與基質(zhì)匹配標準溶液的響應(yīng)強度，來考察基質(zhì)效應(yīng)。以在100,200,500 μg/kg 3個水平下基質(zhì)匹配標準溶液中的峰面積響應(yīng)之和與相對應(yīng)3個水平下純?nèi)軇┡渲频臉藴嗜芤褐心繕宋锏姆迕娣e響應(yīng)的比例差異來考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，15種除草劑基質(zhì)效應(yīng)的比值在0.7～1.1之間，說明通過本文的凈化處理，可消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。因此，本實驗可以采用純?nèi)軇┲苯优渲?5種除草劑的工作曲線進行定量。

2.6 線性范圍與相關(guān)系數(shù)

將混合標準儲備溶液分別配制為20、100、200、500、1 000 μg/L系列濃度的標準工作液，以15種除草劑標準溶液的濃度為橫坐標(x,μg/L)、峰面積為縱坐標(y)，繪制線性關(guān)系曲線。結(jié)果表明，15種除草劑的濃度在20～1 000 μg/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.992(見表2)。

表2 15種苯氧羧酸類除草劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、回收率、相對標準偏差(n=6)及定量下限Table 2 Linear equations,correlation coefficients(r2),linear ranges,recoveries,RSDs(n=6) and quantitative limits of 15 phenoxyacid herbicides

2.7 回收率、精密度及定量下限

選取空白樣品，稱取3個平行樣，分別準確添加15種除草劑混合標準溶液,按前述的操作步驟進行3個濃度水平(20,100,200 μg/kg)的加標回收實驗，每個水平平行測定6次,計算回收率及相對標準偏差(RSD)。結(jié)果表明，15種除草劑的平均回收率為71.5%～105.6%,RSD為4.5%～14.9%。分別根據(jù)3倍信噪比(S/N=3)及S/N=10計算15種除草劑的檢出限(LOD)與定量下限(LOQ)，得到15種除草劑的LOD為0.9～3.3 μg/kg，LOQ為3.2～10.8 μg/kg(見表2)。結(jié)果滿足國際煙草科學(xué)研究合作中心(CORESTA)農(nóng)用化學(xué)品咨詢委員會(ACAC)指導(dǎo)殘留限量(GRLs)和技術(shù)方法指導(dǎo)對回收率、精密度、檢測靈敏度的要求。

2.8 實際樣品的檢測

為驗證方法的可行性，對企業(yè)委托檢驗的20個煙草樣品，按照建立的方法進行樣品前處理并測定15種苯氧羧酸類除草劑的殘留量。結(jié)果有2個樣品分別檢出麥草畏0.13 mg/kg、2,4-滴0.05 mg/kg，其他13種苯氧羧酸類除草劑均未檢出。

3 結(jié) 論

本文建立了乙腈提取，TPT固相萃取柱凈化,氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測和確證煙草樣品中15種苯氧羧酸類除草劑殘留量的分析方法。對提取溶劑、凈化方式、衍生化條件、質(zhì)譜參數(shù)等條件進行了優(yōu)化，并考察了基質(zhì)效應(yīng)的影響，保證了檢測結(jié)果的準確性。方法針對CORESTA 2013版農(nóng)藥殘留指導(dǎo)名單的苯氧羧酸類除草劑進行了考察，結(jié)果表明，該方法能有效避免煙草中復(fù)雜基質(zhì)的干擾，選擇性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好，能滿足當(dāng)前對煙草中苯氧羧酸類除草劑殘留分析的相關(guān)要求。

[1] Zhao H Y，Zhu J Y，Liu S N.WeedSci.(趙浩宇，朱建義，劉勝男.雜草科學(xué))，2013,31(3):1-7.

[2] Souzasilva E A,Pawliszyn J.J.Agric.FoodChem.,2015,63(18):4464-4477.

[3] Niu Z Y,Luo X,Tang Z X,Ye X W,Sun Y F,Zhang H W,Wang F M.Chin.J.Anal.Chem.(牛增元，羅忻，湯志旭，葉曦雯，孫銀峰，張鴻偉，王鳳美.分析化學(xué))，2009,37(4):505-510.

[4] Kuang H，Hou Y X，Chu X G，Xu C L.Chin.J.Anal.Chem.(匡華，侯玉霞，儲曉剛，胥傳來.分析化學(xué)),2006,34(12):1733-1736.

[5] CORESTA Guide No.1.The Concept and Implementation of Agrochemical Guidance Residue Levels.2013.

[6] Su Y L,Mo H H,An F C.Environ.Chem.(蘇允蘭，莫漢宏，安鳳春.環(huán)境化學(xué)),2001,20(6):577-581.

[7] Yu Y B，Zhang R，Li L.Chin.J.Anal.Chem.(于彥彬，張嶸，李莉.分析化學(xué))，2014，25(9):1354-1358.

[8] Zhou C J,Zhao B,Wu D,Deng M L,Huang S Y.Sci.Technol.FoodInd.(周純潔，趙博，吳丹，鄧美林，黃思瑜.食品工業(yè)科技),2016,37(10):467-468.

[9] Zhang F，Yi Y M,Zhang C X.Food&Machinery(張帆,易艷梅,張春霞.食品與機械),2016，11(7):61-65.

[10] Zhang F，F(xiàn)u S L，Shi Y M，Li Z H，Zhang Y.J.Instrum.Anal.(張帆，付善良，施雅梅，李忠海，張瑩.分析測試學(xué)報)，2013，32(1)：79-83.

[11] Si X X，Zhu R Z，Liu Z H，Ma X Y.J.Instrum.Anal.(司曉喜,朱瑞芝,劉志華,馬雪英.分析測試學(xué)報)，2016，35(5)：532-538.

[12] Li X Y，Lin J Y，Zhang L，Zhang Y T，Li K.Rock.Miner.Anal.(李曉亞，林建業(yè)，張莉，張永濤，李科.巖礦測試)，2011，30(3)：349-352.

[13] Li Y，Xu X，Yuan H F，Gao H W,Feng H G.J.AnhuiAgric.Sci.(李殷，徐霞，袁荷芳，高蕙文，馮華剛.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2014，42(27)：9527-9528.

[14] Cao Y Q，Song G，Wang M M，Wang X S，Ai L F.J.Instrum.Anal.(曹亞青，宋歌，王曼曼，王學(xué)生，艾連峰.分析測試學(xué)報)，2016，35(10)：1273-1277.

[15] Zhang B H，Wang X W，Chen S H.J.AnhuiAgric.Sci.(張炳輝,王新旺,陳順輝.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2016，44(7)：30-32.

[16] Zheng Y，Xu X L，Ji S L.Chin.J.Chromatogr.(鄭陽，許秀麗，紀順利.色譜)，2016，34(5):756-758.

Determination of 15 Kinds of Phenoxyacid Herbicides in Tobacco by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CAO Gui-hong1,WANG Xing-ning2*

(1.Guizhou Institute for Food and Drug Inspection,Guiyang 550012,China;2.Technical Center,Guizhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guiyang 550081,China)

A method was developed for the simultaneous determination of 15 phenoxyacid herbicides in tobacco.Samples were extracted with acetonitrile(MeCN),then cleaned up with TPT SPE column.The methylation of analyte was performed with trimethylsily-diazmethan,and the detection was carried out by gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS).The method showed a good linearity over the concentration range of 20-1 000 μg/L with correlation coefficients all above 0.992.The limits of detection and quantitation were 0.9-3.3 μg/kg and 3.2-10.8 μg/kg,respectively.The average recoveries of analytes at three fortified levels(20,100,200 μg/kg) were in the range of 71.5%-105.6%,with RSDs of 4.5%-14.9%.The proposed method is simple,rapid and sensitive,and is suitable for the simultaneous determination of 15 phenoxyacid herbicides in tobacco.

tobacco；phenoxyacid herbicides；gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS)；solid phase extraction(SPE)；methylation

2016-11-14；

2017-03-11

國家質(zhì)檢總局科研項目(2015IK085)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.07.013

O657.63; S482.4

A

1004-4957(2017)07-0911-05

*通訊作者：王興寧，碩士，工程師，研究方向：食品中農(nóng)藥殘留檢測，Tel:0851-822778102，E-mail:271762880@qq.com