張璐琪，張鴻偉，梁成珠，張曉梅，鮑 蕾，王培鋒

(1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東 青島 266002；2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；3.雀巢食品安全研究院，北京 100102)

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乳制品中獸藥多種類殘留的液相色譜-質(zhì)譜分析研究進(jìn)展

張璐琪1,2*，張鴻偉1，梁成珠1，張曉梅1，鮑 蕾3，王培鋒1

(1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東 青島 266002；2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；3.雀巢食品安全研究院，北京 100102)

近年來，乳制品安全問題備受關(guān)注，獸藥殘留作為化學(xué)危害的一個(gè)重要部分使得針對(duì)其檢測(cè)技術(shù)的研究一直是乳制品安全分析的熱點(diǎn)領(lǐng)域，液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)因在靈敏度和選擇性方面的優(yōu)勢(shì)已成為目前獸藥殘留分析的主流技術(shù)?；谝合嗌V-質(zhì)譜技術(shù)的獸藥殘留分析趨勢(shì)已逐漸在向多種類、多組分發(fā)展，但由于獸藥各種類之間在理化性質(zhì)、殘留狀態(tài)、限量要求等方面差異較大，導(dǎo)致在樣品前處理和儀器分析環(huán)節(jié)存在一定的技術(shù)困難。為進(jìn)一步了解該技術(shù)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，該文從樣品前處理、色譜-質(zhì)譜檢測(cè)和基質(zhì)效應(yīng)等方面對(duì)近幾年采用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定乳制品中獸藥多種類殘留的國內(nèi)外文獻(xiàn)進(jìn)行了綜述。

乳制品；獸藥多種類殘留；液相色譜-質(zhì)譜；研究進(jìn)展

獸藥被廣泛用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療以及促進(jìn)動(dòng)物生長等，其種類繁多，常用的獸藥主要包括抗生素類、抗球蟲藥類、抗病毒類、激素類等。近年來，乳制品由于較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能越來越受到人們青睞，其中兒童和老人是主要的消費(fèi)群體，對(duì)于嬰幼兒來說乳制品更是必不可少。但乳制品安全事件頻發(fā)，如“三聚氰胺”事件、阜陽假奶粉事件、液態(tài)奶“黃曲霉毒素M1”事件等，這些事件引起人們對(duì)乳制品中化學(xué)性危害問題的普遍關(guān)注。獸藥殘留作為化學(xué)性危害的一個(gè)重要方面，一直是消費(fèi)者和相關(guān)管理者關(guān)注的重點(diǎn)。乳制品中的獸藥殘留主要是由于產(chǎn)乳動(dòng)物使用了獸藥后，獸藥或其代謝物進(jìn)入生乳中并由此對(duì)消費(fèi)者帶來健康隱患。乳制品中獸藥殘留分析方法有液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[1-2]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[3-4]、高效液相色譜法(HPLC)[5-7]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[8]等，由于LC-MS法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、分析速度快等優(yōu)勢(shì)而在獸藥殘留分析中得到廣泛應(yīng)用。目前國內(nèi)外對(duì)于單類獸藥殘留的檢測(cè)技術(shù)已日漸成熟，但對(duì)于多類獸藥殘留的研究較少，且研究不夠充分。這是由于同時(shí)測(cè)定多類獸藥殘留存在較多難點(diǎn)，如獸藥種類多、性質(zhì)相差較大，導(dǎo)致前處理方法因不能兼顧每種藥物而使回收率、定量下限等無法滿足測(cè)定要求。此外，基質(zhì)效應(yīng)也給方法的建立帶來困難[9]。本文針對(duì)乳制品基質(zhì)，從樣品前處理、色譜-質(zhì)譜檢測(cè)、基質(zhì)效應(yīng)等方面探討了采用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行獸藥多種類、多殘留測(cè)定的研究進(jìn)展。

1 樣品前處理

乳制品如牛奶、奶粉等基質(zhì)成分比較復(fù)雜，含有較多蛋白質(zhì)、磷脂等親脂性雜質(zhì)、碳水化合物和少量礦物質(zhì)等，蛋白質(zhì)會(huì)形成泡沫、渾濁或出現(xiàn)共沉淀現(xiàn)象造成分析物難以分離，且蛋白質(zhì)和脂質(zhì)會(huì)污染儀器，影響測(cè)定條件，從而極大地干擾目標(biāo)化合物的分析，這給樣品的前處理工作帶來了困難。因此如何有效去除這些干擾，提高分析的有效性成為前處理過程的重點(diǎn)。

1.1 提 取

獸藥多種類殘留測(cè)定要盡可能多地提取待測(cè)物質(zhì)，常用的提取劑有甲醇、乙腈等。乙腈是一種中等極性的提取溶劑，與大部分獸藥的極性較相近，多數(shù)獸藥物質(zhì)均能用乙腈提取，且乙腈具有較好的蛋白質(zhì)沉淀作用。甲醇和乙腈的提取效果相似，但乙腈無需通過乳化作用就能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的沉降，且對(duì)碳水化合物和脂質(zhì)有較低的溶解性[10]。因此，乙腈是最常用的提取溶劑。范志影等[11]測(cè)定了生鮮乳中四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類藥物，采用4 ℃預(yù)冷的乙腈提取，可以有效去除蛋白質(zhì)，而且在低溫條件下，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，不易與目標(biāo)化合物結(jié)合而形成共沉淀，從而提高了目標(biāo)化合物的提取效率，所得回收率為81%～119%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.23%～14.8%。

為提高提取效果，實(shí)驗(yàn)中通常會(huì)根據(jù)分析物的性質(zhì)在乙腈中加入輔助提取劑(如甲酸、氫氧化銨等)形成酸化乙腈或堿化乙腈。王浩等[12]測(cè)定了牛奶中的四環(huán)素類和磺胺類等藥物，比較了乙腈、Mcllvaine緩沖液-乙腈、Mcllvaine緩沖液-酸性乙腈和Mcllvaine緩沖液-堿性乙腈(1%氨水)的提取效果，發(fā)現(xiàn)用Mcllvaine緩沖液-堿性乙腈提取時(shí)各類化合物的平均回收率為60%～105%，可以滿足檢測(cè)要求，經(jīng)過條件優(yōu)化后，方法回收率為70.1%～109.9%，RSD為2.89%～9.99%。張毅等[13]測(cè)定了牛奶中β-受體激動(dòng)劑、鎮(zhèn)靜劑和激素等藥物，采用酸化乙腈和堿化乙腈分兩次提取的方法，使偏堿性和偏酸性藥物的回收率均有所提高，總體回收率為42%～135%，其原因可能是乙腈中添加酸或堿能有效抑制藥物的離子化，從而增加分析物在有機(jī)相中的分配比例，此方法的總體回收率為60.3%～119.3%，RSD為3.0%～18.9%。這種多溶劑分步提取的方法雖然增加了前處理步驟，但可以有效回收不同性質(zhì)的物質(zhì)，比較適合性質(zhì)范圍較大的多組分殘留檢測(cè)。為了提取更多種物質(zhì)，除了分步提取方法外，還可以采用組合溶劑提取的方法。張潔等[14]對(duì)乳制品中青霉素類、四環(huán)素類等抗生素物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，首先向樣品溶液中加入等體積的乙腈并旋渦振蕩，形成均勻的乳濁液，使得乙腈和樣品可完全接觸以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)抗生素的充分提取，隨后加入3倍體積的酸化乙腈(0.2%甲酸)結(jié)合高速離心以有效除去樣品中的蛋白質(zhì)，大多數(shù)抗生素的提取率可達(dá)到85%以上，方法回收率為68.4%～96.7%，RSD為 2.1%～12.5%。Dasenaki等[15]測(cè)定了奶粉中喹諾酮類、抗炎藥類等115種藥物，通過依次加入2 mL 0.1%甲酸水(0.1% EDTA)、2 mL乙腈和2 mL甲醇提取，每加1種溶劑均需渦旋混勻，測(cè)得回收率為50%～80%，RSD為2.2%～18%。此方法通過采用緩沖溶液和有機(jī)溶劑進(jìn)行組合提取，能減少與非極性基質(zhì)成分的共提取而有利于提取強(qiáng)極性目標(biāo)物(如喹諾酮類物質(zhì))。此外，在緩沖液中加入的EDTA能有效提取四環(huán)素類物質(zhì)，從而提高了四環(huán)素類物質(zhì)的回收率。在組合溶劑提取時(shí)，多種溶劑間的比例也會(huì)影響提取效果，上述研究比較了緩沖液和有機(jī)溶劑的比例分別為1∶1和1∶2時(shí)的提取效果，結(jié)果顯示緩沖液比例高時(shí)疏水性物質(zhì)(如苯并咪唑類)的回收率較低，且高水量在氮吹時(shí)會(huì)消耗更多時(shí)間，因而選擇1∶2比例，即0.1%甲酸水(0.1%EDTA)、乙腈和甲醇3種溶劑的體積比為1∶1∶1。因此，在使用組合溶劑提取時(shí)，要根據(jù)目標(biāo)物的種類和性質(zhì)不斷優(yōu)化并確定溶劑的種類、各溶劑間的比例和體積等提取條件。此外，使用酸化乙腈和堿化乙腈時(shí)要注意酸或堿的比例含量，過高和過低均會(huì)影響提取效果。Deng等[16]測(cè)定了牛奶中激素類、喹諾酮類、β-受體激動(dòng)劑類等105種獸藥，比較了0.1%、0.5%、1%和2%的甲酸乙腈和乙酸乙腈的提取效果，結(jié)果顯示0.1%甲酸乙腈的提取效果最好，其回收率為52.4%～91.9%，RSD小于20%。因此在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嘗試不同種類、不同濃度比例的有機(jī)酸，以建立最佳的提取條件。

除了上述常用方法，一些特殊的提取技術(shù)也不斷被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于多組分殘留分析。王煉等[17]提出了一種基質(zhì)固相分散(Matrix solid-phase dispersion，MSPD)技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、試劑消耗少、提取效率高，將該技術(shù)用于牛奶和奶粉中β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類等抗生素類藥物的測(cè)定，使用C18、CN填料和EDTA二鈉共同組成提取材料，結(jié)果表明，此方法對(duì)極性差異大的7類抗生素均有較高的提取效率，能較好去除樣品基質(zhì)，在25 μg/kg的加標(biāo)水平下奶粉和牛奶的加標(biāo)回收率分別為72.5%～97.2%和70.1%～96.8%，RSD分別為4.2%～8.8%和3.7%～9.9%。為提高目標(biāo)物回收率，在提取過程中可增加一些輔助提取方式(如水浴超聲)，有研究發(fā)現(xiàn)將提取液超聲水浴30～40 ℃對(duì)EDTA和金屬離子的鰲合置換過程有一定促進(jìn)作用[18]。此外，若需向待測(cè)樣品中加入內(nèi)標(biāo)時(shí)，加入內(nèi)標(biāo)后需在暗處靜置10 min左右[19-21]，使內(nèi)標(biāo)和基質(zhì)充分接觸，以提高提取效果。

1.2 凈 化

前處理過程中凈化的目的主要是除去乳制品中較多的蛋白質(zhì)和脂肪等干擾成分，同時(shí)要注意保留待測(cè)物質(zhì)。常用的凈化技術(shù)為萃取技術(shù)，傳統(tǒng)的液液萃取技術(shù)操作繁雜費(fèi)時(shí)，需消耗大量有毒試劑，不適于多種類藥物的快速處理，目前多采用固相萃取技術(shù)(Solid phase extraction，SPE)和液相微萃取技術(shù)(Liquid phase microextraction，LPME)[22]等。

固相萃取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作方便、消耗試劑少，既可凈化又可富集。通常采用HLB固相萃取柱[23-24]和MCX固相萃取柱[25]，其中HLB萃取柱能同時(shí)保留一個(gè)較寬范圍內(nèi)的親水化合物和親脂化合物[26]，試驗(yàn)中可根據(jù)待測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)而選擇合適的萃取柱。Wang等[27]測(cè)定了牛奶中硝基咪唑類和苯并咪唑類等藥物，通過空白樣品加標(biāo)提取比較了Oasis MCX、Oasis HLB和SCX 3種固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果顯示Oasis MCX柱由于其反相和陽離子交換保留能力強(qiáng)，保留了堿性和中等極性化合物，回收率普遍高于其他兩個(gè)柱子，方法回收率為51.7%～101.8%，RSD為3.8%～15.4%。Zhu等[28]和Stolker等[29]均采用一種TurboFlow在線自動(dòng)固相萃取技術(shù)，使液體樣品或提取液直接通過萃取柱而進(jìn)入分析系統(tǒng)，優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速、高效，其中，Zhu等[28]測(cè)定了牛奶中磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類等88種物質(zhì)，回收率為63.1%～117.4%，RSD為3.3%～17.6%。相比于傳統(tǒng)離線固相萃取技術(shù)，在線固相萃取的靈敏度高、重現(xiàn)性好，適于純化乳制品等復(fù)雜樣品，且在線固相萃取與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用可以提高分析的通量，適合多組分殘留分析。

基于液液萃取的液相微萃取技術(shù)，其最大的優(yōu)勢(shì)是對(duì)微量待測(cè)物質(zhì)的富集作用。林珊珊等[30]提出了微波輔助中空纖維液相微萃取(HF-LPME)的方法，該法是一種利用中空纖維的微孔限制大分子進(jìn)入萃取相，從而減少基質(zhì)干擾的微萃取技術(shù)，將微波輔助萃取(Microwave extraction，MAE)技術(shù)與HF-LPME技術(shù)相結(jié)合，利用微波對(duì)微觀粒子瞬時(shí)極化所帶來的大量熱能和快速傳質(zhì)，達(dá)到縮短HF-LPME平衡時(shí)間、提高萃取效率的目的。實(shí)驗(yàn)測(cè)定了牛奶中喹諾酮類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類共27種藥物，回收率為49%～115%，RSD為0.89%～21.1%。該方法由于限制大分子進(jìn)入萃取相而有較好的凈化效果，但是對(duì)于乳制品基質(zhì)來說，該法操作較復(fù)雜，需特殊的儀器設(shè)備，對(duì)于上百種多組分殘留分析的參考意義不大。

其它樣品凈化的方法有超濾法、稀釋法、低溫法和水沉淀法等。超濾法利用分子截留膜將大分子物質(zhì)留在膜內(nèi)而達(dá)到凈化目的，一般采用3 ku的截留膜。Ortelli等[31]測(cè)定了牛奶中β-興奮劑類、β-內(nèi)酰胺類和激素類等150種藥物，比較了3、10、30 ku 3種分子截留膜的效果，結(jié)果顯示10 ku和30 ku的分子截留膜雖能快速完成超濾，但提取物不如3 ku純凈，并在氮吹步驟后產(chǎn)生沉淀，因此采用3 ku分子截留膜。稀釋法是將樣品提取液進(jìn)行一定比例的稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)化了前處理過程，避免了復(fù)雜前處理過程中目標(biāo)物的損失[9]，但稀釋法未除去雜質(zhì)，基質(zhì)干擾較大，影響靈敏度[30]。提取液和稀釋液的比例大小是取得良好凈化效果的關(guān)鍵，Aguilera-Luiz等[32]測(cè)定了牛奶中磺胺類和喹諾酮類等藥物，當(dāng)直接測(cè)定乙腈樣品提取液時(shí)得到的峰形不好，故將提取液稀釋，比較了乙腈-水以多種比例混合后的分離效果，結(jié)果顯示乙腈-水的比例為1∶1時(shí)能得到好的峰形，回收率為70%～100%，且由于減少了負(fù)載在色譜柱上基質(zhì)的量，從而減弱了基質(zhì)效應(yīng)。低溫法是采用低溫高速離心的方法除去脂肪[33]，原理是根據(jù)脂質(zhì)和分析物間熔點(diǎn)的顯著差異，在-20 ℃下，超過90%的脂質(zhì)能夠以凍結(jié)形式從提取液中分離并移除，而低濃度分析物仍溶解于有機(jī)提取液中，無明顯損失。相比于傳統(tǒng)的用正己烷除脂的方法，低溫對(duì)弱極性和非極性物質(zhì)的除脂效果更好。此方法中溫度和時(shí)間是影響除脂效果的因素，Xie等[34]測(cè)定了乳制品中硝基咪唑類和激素類等藥物，比較了不同溫度(-20、-40、-80 ℃)和不同冰凍時(shí)間(10、20、30、40、50、60 min)條件下的凈化效果，結(jié)果顯示-40 ℃冰凍40 min和-80 ℃冰凍20 min的效果均較好，為減少前處理時(shí)間，因此選擇-80 ℃冰凍20 min，方法回收率為67.3%～106.9%，重復(fù)性RSD≤12.7%，重現(xiàn)性RSD≤13.9%。水沉淀法也是除脂的凈化方法，原理是提取液中加入水后，脂質(zhì)的溶解性顯著降低，由于脂質(zhì)比混合液重，因此離心后易從提取液中分離，水沉淀法能避免疏水性分析物如阿維菌素類的損失。Zhan等[10]測(cè)定了嬰兒配方奶粉中喹諾酮類和磺胺類等220種藥物，采用低溫(-40 ℃，30 min)和水沉淀結(jié)合的方法，第一步低溫除脂，第二步用水沉淀法除去殘留的脂質(zhì)，并比較了2.5 mL乙腈提取液中加入不同體積(0.25、0.5、1.0、2.5 mL)水的凈化效果，結(jié)果顯示加入0.5 mL水的凈化效果和回收率最好，方法回收率為57%～147%，RSD為1%～28%。以上4種凈化方法均簡(jiǎn)便易操作，且凈化效果良好，可根據(jù)具體情況應(yīng)用于多組分殘留分析。

獸藥多種類殘留檢測(cè)的前處理過程應(yīng)盡可能簡(jiǎn)便快速，以減少目標(biāo)物的損失，因此一些樣品提取和凈化并存的前處理技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe)是一種常用的樣品提取和凈化的前處理技術(shù)，用乙腈通過鹽析提取，分散固相萃取凈化，其優(yōu)點(diǎn)是消耗試劑少、方便快速[35]。目前很多研究將QuEChERS方法進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整以提高不同藥物的保留。宓捷波等[36]測(cè)定了奶粉中四環(huán)素類和喹諾酮類等藥物，考慮到四環(huán)素類藥物會(huì)與金屬離子絡(luò)合，在QuEChERS的原有模式上增加了0.1 mol/L EDTA-Na2溶液，并將原用于鹽析試劑的無水硫酸鎂更換為無水硫酸鈉，方法回收率可達(dá)71.05%～102.8%，RSD為3.69%～11.57%。Jian等[37]測(cè)定了牛奶中青霉素類和喹諾酮類等59種藥物，對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，凈化對(duì)方法的靈敏度、色譜峰形等未起到改善效果，而加入EDTA可提高喹諾酮類的提取效果，因此改良的QuEChERS方法使用1%乙酸乙腈和EDTA二鈉提取，省卻了凈化步驟。由此可看出，隨著目標(biāo)物種類的增加，原始的QuEChERS方法難以滿足檢測(cè)需求，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)考慮不同目標(biāo)物的性質(zhì)，在原有QuEChERS基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。Kaufmann等[38]提出了一種SOSLE(Salting out supported liquid extraction)新型提取凈化技術(shù)，采用乙腈提取、硫酸銨為鹽析試劑進(jìn)行液液萃取，提高了提取和凈化效果。實(shí)驗(yàn)測(cè)定了牛奶中β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、硝基咪唑類等114種獸藥，比較了SOSLE與SPE、QuEChERS傳統(tǒng)方法的提取效果，結(jié)果顯示QuEChERS、SPE和SOSLE的回收率分別為73%、83%和 91%，且SOSLE對(duì)于極性化合物(如青霉素類、喹諾酮類和四環(huán)素類)的回收率明顯提高，這種新型提取凈化并存的方法為多組分殘留的前處理過程提供了一個(gè)新方向。

2 色譜-質(zhì)譜檢測(cè)

2.1 色譜分離

最常用的色譜為超高效液相色譜(UPLC)[39]，相對(duì)于高效液相色譜(HPLC)[40-41]來說，其優(yōu)點(diǎn)為分析速度快、分離能力強(qiáng)、靈敏度高、流動(dòng)相消耗少等，但儀器老化速度快，需要更多的維護(hù)和保養(yǎng)。獸藥多殘留分析中往往有些物質(zhì)的母離子甚至子離子的質(zhì)量數(shù)均相同，因此需要色譜柱將其有效分離，才能進(jìn)一步定性和定量。色譜柱一般用C18或C8作填料，在多組分殘留分析中，目標(biāo)物極性范圍跨度較大，故通常選擇分離覆蓋極性較寬的C18色譜柱，常用的有BEH C18色譜柱[42-43]和HSS T3色譜柱[44-45]。隨著超高效液相色譜的使用，其對(duì)應(yīng)的色譜柱耐高壓且內(nèi)徑和填料粒徑更小，更有利于物質(zhì)分離。李琴等[44]測(cè)定了生鮮乳中磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類等45種藥物，比較了Waters BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)和HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)的分離效果，結(jié)果顯示，對(duì)于磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺對(duì)甲氧嘧啶3種磺胺類同分異構(gòu)體，HSS T3色譜柱的分離效果更好，方法的回收率為62.1%～118%，RSD為1.5%～9.4%。Kaufmann等[38]提出了極性化合物(如阿莫西林和一些硝基咪唑類)需要保留能力強(qiáng)的分析柱，與其他測(cè)試的柱子(如不同核殼型的C18柱)相比，采用HSS T3柱能使較早洗脫的化合物獲得更好的峰形。目前填充顆粒多采用先進(jìn)的核殼技術(shù)，與傳統(tǒng)完全多孔硅膠柱相比，能明顯改善分離度和靈敏度。

2.2 質(zhì)譜測(cè)定

2.2.1 離子化方式 質(zhì)譜離子源的電離方式有電子電離(Electron ionization，EI)、電噴霧電離(Electrospray ionization，ESI)、大氣壓化學(xué)電離(Atmospheric pressure chemical ionization，APCI)等，其中ESI的應(yīng)用范圍較廣，絕大多數(shù)的獸藥物質(zhì)均可采用ESI進(jìn)行離子化。Xie等[34]分別采用APCI和ESI在正離子和負(fù)離子模式下測(cè)定40種藥物，發(fā)現(xiàn)ESI對(duì)分析物的離子化效果更好。Aguilera-Luiz等[32]比較了APCI和ESI在正離子模式下的離子化效果，結(jié)果顯示ESI探針的靈敏度好，耐用性強(qiáng)，且操作和檢修方便。

2.2.2 檢測(cè)器 質(zhì)譜檢測(cè)器常用串聯(lián)四極桿(MS/MS)質(zhì)譜和三重四極桿(QQQ)質(zhì)譜，隨著檢測(cè)藥物的多種類化而發(fā)展了高分辨質(zhì)譜如四極桿-飛行時(shí)間(Q-TOF)質(zhì)譜和軌道離子阱(Orbitrap)質(zhì)譜，高分辨質(zhì)譜(High resolution mass spectrometry，HRMS)能夠采集高質(zhì)量準(zhǔn)確度、高質(zhì)量分辨率的全掃描數(shù)據(jù)，單位時(shí)間掃描的化合物無數(shù)量限制，而且具有較高的選擇性和靈敏度，通過精確質(zhì)量數(shù)和同位素峰形進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索比對(duì)，可以方便、快速地對(duì)目標(biāo)化合物和未知化合物進(jìn)行快速篩查與鑒定[15]。高分辨質(zhì)譜在定性方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，能精確測(cè)定母離子質(zhì)荷比，當(dāng)兩種目標(biāo)物的質(zhì)荷比非常相近時(shí)，三重四極桿質(zhì)譜難以準(zhǔn)確定性，但三重四極桿質(zhì)譜的選擇性高，易分辨目標(biāo)物，而高分辨質(zhì)譜容易受雜質(zhì)影響，對(duì)樣品凈化的要求相對(duì)較高。Romero-Gonzalez等[46]測(cè)定了牛奶中喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類等30種藥物，比較了Orbitrap、QQQ和Q-TOF 3種質(zhì)譜的定性和定量效果，根據(jù)不確定范圍和臨界值，高分辨質(zhì)譜比低分辨質(zhì)譜得到更好的結(jié)果，且Orbitrap的篩查結(jié)果比QQQ和Q-TOF好，采用Orbitrap能得到更低的臨界值和更窄的不確定范圍。因此，在多組分殘留分析中，更多地選擇高分辨質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。由于高分辨質(zhì)譜在高通量目標(biāo)物甚至未知物的篩查測(cè)定方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，近年來被越來越多地應(yīng)用于獸藥的多種類殘留分析。表1列出了近年來采用高分辨質(zhì)譜測(cè)定乳制品中獸藥多種類殘留的一些方法，其中文獻(xiàn)[49]采用Q-Exactive Orbitrap質(zhì)譜研究了魚、蜂蜜、牛奶3種典型代表基質(zhì)的動(dòng)物源食品中磺胺類和喹諾酮類共31種藥物的殘留情況，在最佳質(zhì)譜條件下，各化合物的精確質(zhì)量數(shù)相對(duì)偏差小于5×10-6，線性關(guān)系大于0.99，平均回收率為60.39%～110.90%，RSD為1.56%～9.83%，方法分離度和靈敏度較高，能滿足動(dòng)物源食品中抗生素類的快速篩查分析需要。文獻(xiàn)[50]采用Triple TOF質(zhì)譜，以嬰幼兒配方乳粉為基質(zhì)，選取6種不同種類、不同極性、不同法規(guī)要求的代表性獸藥物質(zhì)，采用人工添加的方式模擬未知化學(xué)危害物污染，此方法將高分辨質(zhì)譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法結(jié)合，有助于推動(dòng)非定向分析技術(shù)的發(fā)展。

表1 乳制品中獸藥多種類殘留檢測(cè)的高分辨質(zhì)譜方法Table 1 Selected HRMS methods in multi-residue detection of veterinary drugs in dairy products

(續(xù)表1)

VeterinarydrugExtractionandclean-upChromatographiccolumnDetectorSensitivity(μg·kg-1)Reference19種:磺胺類,青霉素類,四環(huán)素類,大環(huán)內(nèi)酯類乙腈、酸化乙腈(0.2%甲酸)ACQUITYBEHC18(Waters)(100mm×2.1mm,1.7μm)Q-TOF(Bruker)ESI(+)LOD3.00～5.00[14]200多種:驅(qū)蟲劑類,聚醚類,大環(huán)內(nèi)酯和林可酰胺類,硝基咪唑類,抗炎藥類,氯霉素類,喹諾酮類,磺胺類,四環(huán)素類等乙腈3kDa分子截留膜TMCODS-AQQ-TOF(Agilent)ESI(+)、(-)[48]150種:阿維菌素類,苯并咪唑類,β-興奮劑類,β-內(nèi)酰胺類,激素類,大環(huán)內(nèi)酯,硝基咪唑類,喹諾酮類,磺胺類,四環(huán)素類等乙腈3kDa分子截留膜AcquityUPLCBEHC18(Wa-ters)(100mm×2.1mm,1.7μm)TOF(Waters)ESI(+)LOD0.50～25.00[31]114種:苯并咪唑類,大環(huán)內(nèi)酯類,硝基咪唑類,青霉素類,頭孢類,磺胺類,喹諾酮類,四環(huán)素類SOSLE:乙腈,硫酸銨AcquityHSST3(Waters)(100mm×2.1mm,1.8μm)QEOrbitrap(Thermo)ESI(+)LOD0.20～20.00[38]105種:β-興奮劑類,苯并咪唑類,激素類,硝基咪唑類,喹諾酮類,磺胺類,四環(huán)素類,苯二氮卓類,三氯甲烷乙腈(0.1%甲酸),無水硫酸鈉,乙酸乙酯SPE(OasisHLB)ZorbaxEclipseXDBC18(Wa-ters)(100mm×3.0mm,1.8μm)Q-TOF(Agilent)ESI(+)LOD0.01～5.96LOQ0.04～18.45[16]59種:氨基糖苷類,阿維菌素類,喹諾酮類,聚醚類,β-內(nèi)酰胺類,大環(huán)內(nèi)酯類,抗炎藥類,氯霉素類,磺胺類,四環(huán)素類QuEChERS:1%乙酸乙腈,乙酸鈉,EDTA二鈉,硫酸鎂AcquityUPLCBEHC18(Wa-ters)(100mm×2.1mm,1.7μm)Q-TOF(Waters)ESI(+)LOD1.00～20.00[37]25種:磺胺類,四環(huán)素類,β-內(nèi)酰胺類,大環(huán)內(nèi)酯類等乙腈,0.1%甲酸3kDa分子截留膜YMCODS-AQ(Waters)(100mm×2mm,3μm)Q-TOF(Agilent)ESI(+)LOD0.50～20.00[20]6種:β-興奮劑類,林可酰胺類,大環(huán)內(nèi)酯類,β-內(nèi)酰胺類,磺胺類,激素類乙腈SPE(Capti-vaNDLipids)CORTECSTMC18+(Waters)(100mm×2.0mm,1.6μm)TripleTOF(ABSciex)ESI(+)[49]31種:磺胺類,喹諾酮類QuEChERS:1%乙酸乙腈,5980-0032和5980-4950凈化AcquityUPLCBEHC18(Wa-ters)(100mm×2.1mm,1.7μm)Q-Exactive(Ther-mo)ESI(+)LOD≤10.00[50]

3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指獸藥物質(zhì)和共同提取的基質(zhì)成分間的相互作用抑制或增強(qiáng)了分析物的離子化作用，造成分析物信號(hào)的降低或升高，從而影響定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，很難甚至不能消除?；|(zhì)效應(yīng)在復(fù)雜樣品基質(zhì)的LC-MS分析中普遍存在，特別是在ESI離子化方式下更易產(chǎn)生。而乳制品的基質(zhì)成分比較復(fù)雜，其中含量較多的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等成分很容易影響目標(biāo)物的測(cè)定。

基質(zhì)效應(yīng)可以通過比較試劑標(biāo)準(zhǔn)和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的響應(yīng)來評(píng)估。Aguilera-Luiz等[51]測(cè)定了嬰兒奶粉中苯并咪唑類和磺胺類等藥物，分析了包含多個(gè)濃度(10～100 μg/kg)標(biāo)準(zhǔn)的純?cè)噭┖蜆悠坊|(zhì)，比較了標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，結(jié)果顯示左旋咪唑和磺胺二甲嘧啶均表現(xiàn)出明顯的基質(zhì)效應(yīng)。Ortelli等[31]選取不同來源的6個(gè)空白牛奶樣品和6個(gè)空白水樣，經(jīng)過超濾(3 kDa)后測(cè)定，比較有無基質(zhì)的信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)果顯示不同來源的牛奶樣品表現(xiàn)出非常均勻的基質(zhì)效應(yīng)，只有非班太和紅霉素的信號(hào)響應(yīng)根據(jù)牛奶樣品不同有顯著的變化。Wang等[27]分析了10個(gè)不同來源的加標(biāo)牛奶樣品，結(jié)果無明顯差異(95%置信水平)，這表明分析物的響應(yīng)不取決于基質(zhì)的來源。上述研究均表明了同種基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)與基質(zhì)的來源并無很大相關(guān)性。

減弱基質(zhì)效應(yīng)的方法包括加強(qiáng)樣品凈化，提高液相色譜的分離度而減少目標(biāo)物和基質(zhì)成分的共同洗脫，以及稀釋最終提取液以減少基質(zhì)成分進(jìn)入LC-MS分析等。李寧等[18]在樣品提取過程中用EDTA-Na2緩沖溶液起到稀釋基質(zhì)的作用，一定程度上減小了基質(zhì)效應(yīng)的影響。方慧文等[9]采用稀釋提取液的凈化方法，降低了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，研究發(fā)現(xiàn)隨著稀釋倍數(shù)的增加，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響逐漸減小甚至消失，但該法會(huì)降低方法的定量下限。采用起始流動(dòng)相將加標(biāo)濃度為10.0 μg/kg(四環(huán)素類加標(biāo)濃度為150 μg/kg)的樣品提取液分別稀釋2、5、8、10倍后上機(jī)測(cè)定，結(jié)果顯示隨著稀釋倍數(shù)的增加，磺胺二甲嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶的峰面積逐漸減小，而泰樂菌素的峰面積逐漸增大，表明牛奶基質(zhì)對(duì)磺胺二甲嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶的響應(yīng)存在增強(qiáng)效應(yīng)，對(duì)泰樂菌素的響應(yīng)存在抑制效應(yīng)，當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到10時(shí)，目標(biāo)物的峰面積趨于穩(wěn)定，基質(zhì)效應(yīng)基本消除，因此選擇最佳稀釋倍數(shù)為10倍?；|(zhì)效應(yīng)的影響還可以用同位素內(nèi)標(biāo)法或基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法[52-53]來補(bǔ)償，或者將二者結(jié)合使用。同位素內(nèi)標(biāo)法能減小基質(zhì)干擾和回收率損失，但難以獲得足夠的同位素內(nèi)標(biāo)來實(shí)現(xiàn)多組分分析，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液有相似的離子化環(huán)境，有利于消除基質(zhì)效應(yīng)[33]。因此，通常采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)。

4 結(jié) 論

乳制品中獸藥多種類、多組分殘留的LC-MS分析逐漸向高通量、自動(dòng)化的方向發(fā)展，但目前在樣品前處理、色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè)方面尚無完善和通用的方法，往往某些物質(zhì)不能滿足回收率和定量下限的要求。乳制品與公眾的飲食健康息息相關(guān)，人們對(duì)乳制品安全的關(guān)注和國家對(duì)乳制品的嚴(yán)格監(jiān)管促使獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)向更高的水平發(fā)展，面臨更大的挑戰(zhàn)并具有更廣闊的前景。隨著科技水平的進(jìn)步，越來越多新穎的技術(shù)手段和先進(jìn)的儀器設(shè)備正致力于解決乳制品基質(zhì)成分復(fù)雜、獸藥種類多等難點(diǎn)問題，進(jìn)而深入研究測(cè)定乳制品中更多種類、更多組分獸藥的方法，增強(qiáng)檢測(cè)技術(shù)的實(shí)用性，使其能廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的日常檢測(cè)，努力建立快速簡(jiǎn)便、環(huán)境友好的檢測(cè)方法，從而為乳制品安全和人類健康提供保障。

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Research Progress on Liquid Chromatography-Mass Spectrometric Analysis of Multiclass Veterinary Drugs Residues in Dairy Products

ZHANG Lu-qi1,2*, ZHANG Hong-wei1, LIANG Cheng-zhu1,ZHANG Xiao-mei1,BAO Lei3,WANG Pei-feng1

(1.Technical Center for Inspection and Quarantine,Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266002, China; 2.College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 3.Nestlé Food Safety Institute, Beijing 100102, China)

More and more attention has been paid to the security of dairy products in recent years.Veterinary drug residue is an important part of chemical hazards so that the research on detection technology has always been a hotpot of dairy products’ safety analysis.Liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS) has become a mainstream in veterinary drug residues analysis because of its special advantages of sensitivity and selectivity.The veterinary drug residues analysis based on LC-MS has been developed into multiclass and multiresidue stages gradually.While the differences of physicochemical properties,residual station and limited quantity exist among the multiclass veterinary drugs,both the sample pretreatment and subsequent instrument analysis have come across certain technological difficulties.To know more about the research development in this field,the literatures concerning the multiresidue determination of veterinary drugs in dairy products using LC-MS at home and abroad in resent years are summarized in this paper,from several aspects including sample pretreatment,LC-MS detection and matrix effect.

dairy products; veterinary drugs multi-residue; liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS); research progress

2017-01-03；

2017-04-05

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014IK088)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.07.020

O657.63；TQ460.72

A

1004-4957(2017)07-0941-08

*通訊作者：張璐琪，碩士研究生，研究方向：食品安全檢測(cè)，Tel:0532-80885717，E-mail:15245122133@163.com

綜 述