宋殿榮，張崴，趙麗穎，郭潔，李會娟，杜文欣

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津300150；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津300070）

基于人胎盤屏障體外模型評價雙黃連的胚胎毒性

宋殿榮1，張崴1，趙麗穎2，郭潔1，李會娟2，杜文欣1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津300150；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津300070）

目的 聯(lián)合應(yīng)用人胎盤屏障體外模型和胚胎干細(xì)胞（ES）實驗?zāi)Ｐ停u價雙黃連的胚胎毒性。方法利用胎盤組織薄片培養(yǎng)技術(shù)與尤斯（Ussing）擴(kuò)散池實驗相結(jié)合建立人胎盤屏障體外模型。于胎盤屏障母體側(cè)給予雙黃連0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4和12.8 g·L-1，于藥后60 min分別取母體側(cè)和胎兒側(cè)培養(yǎng)液作為含藥上清，與ES（D3系）和BALB/c小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（3T3）共培養(yǎng)10 d，MTT法檢測細(xì)胞存活率，分別計算兩側(cè)含藥上清抑制ES和3T3細(xì)胞存活的IC50。利用懸滴-懸浮-貼壁方法，體外培養(yǎng)ES向心肌細(xì)胞分化，實時定量PCR檢測心肌細(xì)胞特異基因肌球蛋白重鏈基因β（β-MHC）的表達(dá)，表示ES向心肌細(xì)胞的分化率，分別計算抑制ES細(xì)胞分化的IC50。根據(jù)胚胎毒性評價標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測雙黃連的胚胎毒性。結(jié)果 胎盤屏障母體側(cè)雙黃連抑制3T3細(xì)胞存活及ES細(xì)胞存活和分化的IC50分別為1.97，0.84和0.48 g·L-1；根據(jù)胚胎毒性評價標(biāo)準(zhǔn)判定，雙黃連在母體側(cè)具有弱胚胎毒性。胎盤屏障胎兒側(cè)雙黃連抑制3T3細(xì)胞存活及ES細(xì)胞存活和分化的IC50分別為3.19，2.57和0.95 g·L-1；根據(jù)胚胎毒性評價標(biāo)準(zhǔn)判定，雙黃連透過胎盤屏障后，在胎兒側(cè)無胚胎毒性。結(jié)論母體側(cè)給予所測試濃度范圍內(nèi)的雙黃連透過胎盤屏障后，無明顯胚胎毒性。以透過胎盤屏障的含藥上清作為受試物檢測藥物的胚胎毒性，對于評價妊娠期用藥的安全性更具有科學(xué)性，對臨床合理用藥具有參考價值。

雙黃連；胚胎毒性；胎盤屏障；胚胎干細(xì)胞

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.022

雙黃連凍干粉為金銀花、黃芩和連翹3味中藥經(jīng)現(xiàn)代工藝制成的中藥粉針劑，具有清熱解毒和抗菌抗病毒的雙重作用，廣泛用于治療各種感染性疾病，特別是屢見于妊娠期使用并取得良好療效的臨床報道［1］。2009年宋殿榮等［2］研究報道，雙黃連凍干粉透過大鼠胎盤屏障造成胎兒宮內(nèi)暴露的主要藥物成分為黃芩苷（baicalin），同時應(yīng)用胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ES）模型進(jìn)行評價，提出了黃芩苷具有弱胚胎毒性［3］。但由于存在種屬差異，動物實驗結(jié)果 不能直接外推到人體，2013年宋殿榮等［4］建立了人胎盤屏障體外模型，該模型具有在體胎盤的內(nèi)分泌和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能，能避免種屬差異，模擬人體環(huán)境，明確透過人胎盤屏障的中藥成分。故本研究聯(lián)合應(yīng)用人胎盤屏障體外模型和ES實驗（ES test，EST），進(jìn)一步評價雙黃連的胚胎毒性，為臨床合理用藥提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和動物

新鮮胎盤來源于天津市南開醫(yī)院產(chǎn)科。ES（D3系）細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。BALB/c小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（3T3）為天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院研究所惠贈。BALB/c小鼠〔SPF級，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK-（軍）2007-004〕購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

1.2 藥物、主要試劑和儀器

黃芩苷購自中國藥品生物制品檢定所，批號110715-200815。Knock out-DMEM培養(yǎng)基、Knock out-serum replacement（KSR）、1%非必需氨基酸、β-巰基乙醇、谷氨酰胺和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；小鼠白血病抑制因子1000 kU·L-1購自美國Chemicon公司；熒光素、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖、乙二醇、二甲亞砜、明膠、MTT和絲裂霉素購自美國Sigma公司。倒置顯微鏡（Nikon TE2000-u，日本Nicon公司），酶聯(lián)免疫檢測儀（Σ960，中國臺北），Chromo4四通道實時定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），尤斯擴(kuò)散池（Ussing chamber EM-CSYS-2，美國PI公司），樣本夾片P2314和Leica VT1000振動切片機(jī)（德國徠卡公司）。

1.3 人胎盤屏障體外模型的建立

參照文獻(xiàn)［4］方法建立人胎盤屏障體外模型，選擇孕14～24周無妊娠合并癥和妊娠并發(fā)癥非計劃妊娠婦女經(jīng)水囊引產(chǎn)的胎盤，年齡25～30歲。排除HIV、HBV、HCV、蒼白密螺旋體（梅毒密螺旋體）和巨細(xì)胞病毒感染等。由天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得患者知情同意。選擇胎盤終末絨毛部位，即胎盤母體面底板區(qū)的中間帶的叢密絨毛處，取約3 cm×3 cm×1 cm大小的組織塊，玻璃化冷凍方法固定，切割成為厚度500 μm的組織薄片，復(fù)蘇，按照母體面-胎兒面的方向固定于擴(kuò)散池的夾片上，放置于尤斯擴(kuò)散池，胎兒側(cè)和母體側(cè)分別加入37℃，pH 7.4的K氏緩沖液（g·L-1：NaCl 6.923，KCl 0.354，NaHCO32.1，Na2HPO40.136，MgSO4·7H2O 0.288，CaCl2·6H2O 0.56，葡萄糖1.8，L-丙氨酸0.178）2 mL，建立人胎盤屏障體外模型系統(tǒng)裝置。該模型系統(tǒng)由尤斯擴(kuò)散池、溫度加熱塊、恒溫水浴箱及95%O2和5%CO2混合氣體循環(huán)系統(tǒng)4部分組成，分別構(gòu)成人胎盤屏障體外模型的擴(kuò)散系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)和氣流控制系統(tǒng)。

1.4 人胎盤屏障體外模型功能鑒定

胎盤屏障體外模型預(yù)平衡30 min后，即刻在擴(kuò)散池的母體側(cè)和胎兒側(cè)同時加入已預(yù)溫到37℃，pH 7.4的K氏緩沖液2 mL，于給定的時間間隔（1，2，3，4，5，12，24和48 h）在母體側(cè)取樣100 μL，同時立刻補(bǔ)充同溫度等體積的K氏緩沖液。各樣本1000×g離心10 min，取上清液，4℃保存。ELISA檢測胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞人絨毛膜促性腺激素β（β-human chorionic gonadotropin，β-HCG）的分泌水平。

1.5 雙黃連含藥上清樣品的制備

精密稱取雙黃連凍干粉256 mg于10 mL容量瓶中，用K氏緩沖液標(biāo)定，得到25.6 g·L-1雙黃連溶液，用K氏緩沖液逐級稀釋，分別得到不同濃度的供試品，-4℃冰箱保存。在胎盤屏障體外模型母體側(cè)加入已預(yù)溫到37℃，濃度分別為0，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4和12.8 g·L-1的雙黃連溶液7 mL，胎兒側(cè)同時加入同溫度等體積K氏緩沖液。于加藥后60 min，將兩側(cè)樣品全部取出，1000×g離心10 min，取上清液分別為兩側(cè)雙黃連含藥上清樣品，置于-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)

取孕期12.5～14.5 d的BALB/c小鼠，頸椎脫臼處死，浸泡，洗刷，消毒，剖腹取出胚胎，去除頭、肝和四肢，培養(yǎng)液沖洗，充分剪碎。加入0.25%胰酶-0.04%EDTA 10 mL，分階段消化，吸取上層懸液并離心收集細(xì)胞，接種于T75培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察滋養(yǎng)層細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底，加入絲裂霉素10 mg·L-1混勻，培養(yǎng)4 h，消化，接種于明膠化的培養(yǎng)皿中備用。

從液氮中取出ES復(fù)蘇，接種于已鋪好滋養(yǎng)層細(xì)胞的6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每天更換細(xì)胞培養(yǎng)液（HDMEM、15%胎牛血清、谷氨酰胺2 mmol·L-1、1%非必需氨基酸、2-巰基乙醇0.1 mmol·L-1、青霉素50 kU·L-1、鏈霉素50 mg·L-1和小鼠白血病抑制因子1000 kU·L-1）。ES細(xì)胞增殖3 d，形成大小均一的克隆，克隆緊密，立體感強(qiáng)，折光性好，細(xì)胞克隆于培養(yǎng)皿鋪滿60%～70%時傳代。

1.7 MTT法檢測胚胎干細(xì)胞和3T3細(xì)胞的存活

將ES或3T3細(xì)胞200 μL（含500個細(xì)胞）接種于96孔板上，將胎盤屏障胎兒側(cè)和母體側(cè)雙黃連含藥上清樣品（加入10%FBS、谷氨酰胺2 mmol·L-1、青霉素50 kU·L-1和鏈霉素50 mg·L-1）加入96孔板，與ES或3T3細(xì)胞共培養(yǎng)。同時設(shè)細(xì)胞對照組。第3和第5天更換培養(yǎng)液。第10天相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，形態(tài)正常則應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=細(xì)胞對照組A570nm均值/藥物組A570nm均值×100%。分別以雙黃連初始濃度（母體側(cè)）為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制濃度-細(xì)胞存活率曲線，應(yīng)用GraphPadPrism5軟件計算抑制ES或3T3細(xì)胞存活50%的雙黃連濃度。

1.8 胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的體外分化培養(yǎng)［5］

①懸滴培養(yǎng)：調(diào)整ES細(xì)胞密度至3.75×107L-1，分別將單細(xì)胞懸液置于6 cm培養(yǎng)皿中，從中取單細(xì)胞懸液以每滴20 μL、每培養(yǎng)皿80滴置于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，加蓋。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿蓋子至正常位置，蓋在培養(yǎng)皿上，使之懸滴生長，培養(yǎng)皿內(nèi)加入PBS 5 mL。置37℃，5%CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d。②懸浮培養(yǎng)：第4天于倒置顯微鏡下觀察，每個懸滴內(nèi)均含有1個擬胚體。吸棄PBS，分別加入胎盤屏障胎兒側(cè)和母體側(cè)雙黃連含藥上清樣品（加入15%FBS、谷氨酰胺2 mmol·L-1、1%NEAA、2-巰基乙醇0.1 mmol·L-1、青霉素50 kU·L-1和鏈霉素50 mg·L-1）。將擬胚體沖入培養(yǎng)皿底，并移至6 cm培養(yǎng)皿懸浮培養(yǎng)2 d。③貼壁培養(yǎng)：第6天時肉眼觀察，每個培養(yǎng)皿中均可見數(shù)十個擬胚體。分別接種至事先用明膠包被的24孔板內(nèi)，每孔中加入2 mL上述胎兒側(cè)和母體側(cè)雙黃連含藥上清。37℃，5%CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，實時定量PCR法檢測心肌細(xì)胞特異基因肌球蛋白重鏈基因β（myosin heavy chain gene-β，β-MHC）mRNA表達(dá)。

1.9 實時定量PCR法檢測β-MHC mRNA的表達(dá)

Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA，檢測總RNA濃度，鑒定其純度及完整性。以2 μg RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。β-MHC引物：GCCCCTCCTCACATCTTCTCC（F）和CAGGGTTGGCTTGGATGATTT（R）；內(nèi)參照GAPDH引物：CCTTCCGTGTTCCTACCC（F）和CAACCTGGTCCTCAGTGTAG（R）。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為SYBR Green Real time PCR Master Mix 12.5 μL，樣品溶液2.5 μL，引物各1.0 μL，加雙蒸水至總體積25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性60 s；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)，熔解曲線72～95℃，每0.4℃讀數(shù)1次，持續(xù)1 s。用基因相對定量法（2-ΔΔCt）計算各組β-MHC mRNA相對于對照組的表達(dá)倍數(shù)。β-MHC表達(dá)水平表示ES細(xì)胞分化率。ES細(xì)胞分化率（%）=藥物組2-ΔΔCt/細(xì)胞對照組2-ΔΔCt× 100%。以初始雙黃連濃度（母體側(cè)）為橫坐標(biāo)，ES分化率為縱坐標(biāo)繪制濃度-反應(yīng)曲線。應(yīng)用GraphPadPrism5軟件計算抑制ES 50%分化的雙黃連濃度。

10胚胎毒性結(jié)果 評價［6］

公式Ⅰ：5.916 lg（3T3存活I(lǐng)C50）+3.500 lg（ES存活I(lǐng)C50）-5.307〔（3T3存活I(lǐng)C50-ES分化IC50）/ 3T3存活I(lǐng)C50〕-15.72；公式Ⅱ：3.651 lg（3T3存活I(lǐng)C50）+2.394 lg（ES存活I(lǐng)C50）-2.033〔（3T3存活I(lǐng)C50-ES分化IC50）/3T3存活I(lǐng)C50〕-6.85；公式Ⅲ：-0.125 lg（3T3存活I(lǐng)C50）+1.917 lg（ES存活I(lǐng)C50）+ 1.500〔（3T3存活I(lǐng)C50-ES分化IC50）/3T3存活I(lǐng)C50〕-2.67。胚胎毒性判定標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ＞Ⅱ且Ⅰ＞Ⅲ，受試物胚胎毒性為一級，即無胚胎毒性；Ⅱ＞Ⅰ且Ⅱ＞Ⅲ，受試物胚胎毒性為二級，即弱胚胎毒性；Ⅲ＞Ⅰ且Ⅲ＞Ⅱ，受試物胚胎毒性為三級，即強(qiáng)胚胎毒性。

2 結(jié)果

2.1 人胎盤屏障體外模型功能鑒定

測定人胎盤屏障體外模型建立后母體側(cè)胎盤組織薄片48 h內(nèi)的分泌功能。結(jié)果 顯示，胎盤終末絨毛組織薄片在擴(kuò)散池培養(yǎng)條件下，48 h內(nèi)均存在β-HCG的分泌，呈先上升后下降的趨勢，分泌的峰值在培養(yǎng)5 h（圖1），表明該模型在48 h內(nèi)能很好地維持胎盤的在體功能。

Fig.1 Human chorionic gonadotropin-β（β -HCG）expression level in placenta tissue slice within 48 h in human placental barrierin vitrodetected by ELlSA.After the placenta barrier model was pre-equilibrated 30 min，K buffer 2 mL was added to the maternal and fetal sides of the diffusion chamber at once，and the level of β-HCG in the maternal side buffer was detected by ELISA at a given time interval.x±s，n=3.

2.2 雙黃連對3T3細(xì)胞存活的影響

胎盤屏障母體側(cè)和胎兒側(cè)雙黃連對3T3細(xì)胞存活的影響見表1。培養(yǎng)10 d后，隨母體側(cè)雙黃連初始濃度的加大，細(xì)胞存活率明顯下降（P＜0.05）；在雙黃連濃度為3.2和6.4 g·L-1時，母體側(cè)含藥上清的細(xì)胞毒性較胎兒側(cè)含藥上清更加明顯（P＜0.05）。根據(jù)雙黃連初始濃度-3T3細(xì)胞存活率反應(yīng)曲線，母體側(cè)雙黃連抑制3T3細(xì)胞存活的IC50為1.97 g·L-1（初始濃度）；透過胎盤屏障后，胎兒側(cè)雙黃連IC50為3.18 g·L-1（初始濃度）。

2.3 雙黃連對胚胎干細(xì)胞存活的影響

胎盤屏障母體側(cè)和胎兒側(cè)雙黃連對ES細(xì)胞存活的影響見表2。培養(yǎng)10 d后，隨母體側(cè)雙黃連初始濃度的加大，細(xì)胞存活率明顯下降（P＜0.05）；雙黃連濃度6.4 g·L-1時，母體側(cè)含藥上清的細(xì)胞毒性較胎兒側(cè)含藥上清更加明顯（P＜0.05）。根據(jù)雙黃連初始濃度-ES存活率反應(yīng)曲線，母體側(cè)雙黃連抑制ES細(xì)胞存活的IC50為0.84 g·L-1（初始濃度）；透過胎盤屏障后，胎兒側(cè)雙黃連IC50為2.57 g·L-1（初始濃度）。

2.4 雙黃連對胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的影響

實時定量PCR檢測心肌β-MHC表達(dá)結(jié)果 （圖2）表明，隨母體側(cè)雙黃連初始濃度的加大，ES向心肌細(xì)胞分化程度下降。根據(jù)雙黃連初始濃度-ES分化率效應(yīng)曲線計算，母體側(cè)雙黃連抑制ES細(xì)胞分化的IC50為0.48 g·L-1（初始濃度）；透過胎盤屏障后，胎兒側(cè)雙黃連IC50為0.95 g·L-1（初始濃度）。

2.5 基于胎盤屏障體外模型預(yù)測雙黃連胚胎毒性

胎盤屏障母體側(cè)雙黃連抑制3T3細(xì)胞存活及ES細(xì)胞存活和分化的IC50分別為1.97，0.84和0.48 g·L-1。根據(jù)胚胎毒性評價公式，計算得到Ⅰ= 10.005，Ⅱ=10.649，Ⅲ=4.482；顯然Ⅱ＞Ⅰ，Ⅱ＞Ⅲ，提示母體側(cè)雙黃連具有弱胚胎毒性。胎盤屏障胎兒側(cè)雙黃連抑制3T3細(xì)胞存活及ES細(xì)胞存活和分化的IC50分別為3.19，2.57和0.95 g·L-1。根據(jù)胚胎毒性評價公式，計算得到Ⅰ=13.219，Ⅱ=12.679，Ⅲ= 5.359；顯然Ⅰ＞Ⅱ，Ⅰ＞Ⅲ，提示雙黃連透過胎盤屏障后無胚胎毒性。

Tab.1 Effect ofShuanghuanglianon survival of 3T3 cells

Tab.2 Effect ofShuanghuanglianon survival of embryonic stem cells（ESCs）

Fig.2 lnhibitory effect ofShuanghuanglianon differentiation of ESCs to cardiomyocytes.See Tab.1 for the preparation of fetal and maternal side supernatant withshuanghuanglian.The differentiation of ESCs to cardiomyocytes was detected through hanging drop-suspension attachment method. Real-time quantitative PCR assay was used to detect the expression of heart muscle myosin heavy chain（β-MHC）mRNA in ESCs．The relative quantitative expression of β-MHC mRNA was by 2-△△Ct.Differentiation rate of ESCs（%）=2-ΔΔCtof experimental group/2-ΔΔCtof cell control group×100%.x±s，n=6.

3 討論

本課題組前期研究結(jié)果 顯示，雙黃連透過大鼠胎盤屏障造成胎兒宮內(nèi)暴露的藥物成分為黃芩苷，應(yīng)用EST方法評價黃芩苷的胚胎毒性為弱胚胎毒性［3］。然而，由于中藥具有組成成分的多樣性和可變性以及成分間相互作用的難以預(yù)測性等特點(diǎn)，僅考察中藥單一組分的胚胎毒性尚不能全面客觀地評價中藥的安全性［7］。因此，黃芩苷的胚胎毒性并不能完全代表雙黃連的胚胎毒性。根據(jù)血清藥理學(xué)理論，應(yīng)用中藥后只有被吸收入血或在體內(nèi)代謝最終存在于血液中含量較高的成分，才是發(fā)揮藥效或毒性作用的成分。本研究充分考慮到藥物在體內(nèi)的代謝更為接近人體，以胎盤屏障體外模型母體側(cè)和胎兒側(cè)含藥上清作為雙黃連胚胎毒性研究的受試物，結(jié)果 亦顯示雙黃連在母體側(cè)具有弱胚胎毒性，與以往研究結(jié)果 一致。

妊娠期胎盤作為母體與胎兒之間的重要器官，具有保護(hù)胎兒的屏障作用，藥物只有透過胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)，才可能對胎兒的生長發(fā)育造成影響。因此，檢測透過胎盤屏障的藥物成分的胚胎毒性更具臨床價值。本研究成功復(fù)制了人胎盤屏障體外模型，該模型在48 h內(nèi)能保持胎盤活性，很好地模擬在體環(huán)境。因此，本研究以透過胎盤屏障模型的胎兒側(cè)含藥上清作為雙黃連胚胎毒性評價的受試物。EST結(jié)果 顯示，透過胎盤屏障后，雙黃連無胚胎毒性，這與文獻(xiàn)［8-9］報道結(jié)果 一致，即妊娠期應(yīng)用雙黃連治療上呼吸道感染和泌尿系統(tǒng)感染，未發(fā)現(xiàn)對孕婦心、肝、腎及造血系統(tǒng)的影響，經(jīng)隨訪亦未發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)及新生兒畸形。本研究結(jié)果 顯示，胎盤屏障母體側(cè)雙黃連抑制3T3細(xì)胞存活及ES細(xì)胞存活和分化的IC50分別為1.97，0.84和0.48 g·L-1；透過胎盤屏障胎兒側(cè)雙黃連抑制3T3細(xì)胞存活及ES細(xì)胞存活和分化的IC50分別為3.19，2.57和0.95 g·L-1，說明雙黃連透過胎盤屏障造成胎兒宮內(nèi)暴露的濃度至少要增加至2倍，才能抑制ES細(xì)胞50%存活及向心肌細(xì)胞50%分化。提示胎盤屏障可減少雙黃連透過胎盤、減弱其宮內(nèi)暴露對胎兒的影響。在所觀察濃度范圍內(nèi)，母體側(cè)給予雙黃連，透過胎盤屏障后，對胚胎無明顯胚胎毒性。

以透過胎盤屏障的含藥上清作為受試物進(jìn)行EST，檢測藥物的胚胎毒性，對于評價妊娠期應(yīng)用中藥的安全性更具有科學(xué)性，對臨床合理用藥更具有參考價值。但胎盤是孕期特有的組織器官，具有物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、屏障和內(nèi)分泌代謝等功能，不同孕期胎盤功能不盡相同。在孕早期胎盤尚未形成，其功能并不完善。孕中期胎盤屏障由合體滋養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞及基膜、絨毛內(nèi)薄層結(jié)締組織、絨毛內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和基膜構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)最為完整，在整個孕期具有最強(qiáng)的屏障功能。妊娠后期母體血與胎兒血之間只隔合體滋養(yǎng)層、血管內(nèi)皮及兩者之間的基膜，故通透性很強(qiáng)。本研究選擇胎盤屏障功能最完善的孕中期胎盤組織作為研究對象，考察胎盤對藥物的通透性。然而不同藥物在不同孕期對胚胎或胎兒的影響不盡相同，因此要考察藥物在不同孕期的胚胎毒性，需選擇相應(yīng)孕期的胎盤組織建立胎盤屏障體外模型，以獲得更加科學(xué)可靠的實驗結(jié)果 。另外，體外培養(yǎng)ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的技術(shù)要求高，耗時長，費(fèi)用昂貴；EST過程中需要利用生物統(tǒng)計公式對實驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，過程繁瑣，耗時耗力，不適于高通量篩選中藥的胚胎毒性。因此，建立一種高通量的胚胎毒性篩選模型，與人胎盤屏障體外模型聯(lián)合快速篩選藥物胚胎毒性，將成為今后研究的重點(diǎn)。

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Evaluation of embryo toxicity of Shuanghuanglian based on human placental barrier model

SONG Dian-rong1,ZHANG Wei1,ZHAO Li-ying2,GUO Jie1,LI Hui-juan2,DU Wen-xin1
(1.Department of Obstetrics and Gynecology,the Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300150,China;2.Graduate School,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300070,China)

OBJECTlVETo evaluate the embryo toxicity of Shuanghuanglian(SHL)by the combination of a human placental barrier model and embryonic stem(ES)cell test model.METHODSA human placental barrier model was set up by placenta slice culture and Ussing chamber.SHL 0.2,0.4,0.8,1.6,3.2,6.4 and 12.8 g·L-1was added into the maternal side of the human placental model,respectively.All the media was collected respectively from the maternal side and fetal side 60 min later and taken as the SHL containing medium.ES cells(D3 line)and embryonic fibroblast cells(BALB/c 3T3)were cultured with the SHL containing medium respectively from the maternal side and the fetal side for 10 d.Cell viability was detected by MTT assay,and 50%survival inhibitory ratio of ES and 3T3 cells by SHL was calculated.ES cells were incubated with the SHL containing medium from the maternal side or fetal side when they differentiated to cardiac myoblasts using hanging drop-suspension-attachment method.Messenger RNA of myosin heavy chain genes(β-MHC)was detected by Q-PCR for differentiation ratio,and 50%differentiation inhibitory ratio of ES cells by SHL was calculated.A statistics formula was used for prediction of SHL embryotoxicity potential.RESULTSThe IC50of SHL in the maternal side of the human placental model for 3T3 cell survival,ES cell survival and ES differentiation was 1.97,0.84 and 0.48 g·L-1,respectively.According to the criteria for embryo toxicity evaluation,SHL had weak embryo toxicity.However,the IC50of SHL in the fetal side of the human placental model for 3T3 cell survival,ES cell survival and ES differentiation was 3.19,2.57 and 0.95 g·L-1,respectively.According to the criteria for embryo toxicity evaluation,the supernatant containing SHL that went through the placental barrier had no embryo toxicity.CONCLUSlONSHL is safe in the test concentration range during pregnancy.It is more scientific to evaluate embryo toxicity of drugs by ES cell test with the samples obtained through the placental barrier during pregnancy.

Shuanghuanglian;embryotoxicity;placental barrier;embryonic stem cells

The project supported by National Natural Science Foundation of China（81273938）

SONG Dian-rong，E-mail：songdr58@126.com

R285.1

A

1000-3002-（2017）06-0649-06

2017-02-04接受日期：2017-06-16）

（本文編輯：齊春會）

國家自然科學(xué)基金（81273938）

宋殿榮，女，主任醫(yī)師，教授，主要從事妊娠期用藥安全性研究。

宋殿榮，E-mail：songdr58@126.com