徐誠(chéng)，張春蘭，邵文濤，顧愛華

（南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京211166）

納米氧化鋅暴露對(duì)斑馬魚胚胎心臟發(fā)育的毒性效應(yīng)和機(jī)制研究

徐誠(chéng)，張春蘭，邵文濤，顧愛華

（南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京211166）

目的 觀察納米氧化鋅暴露對(duì)斑馬魚胚胎心臟發(fā)育及大鼠心肌細(xì)胞（H9c2）的毒性作用及可能機(jī)制。方法對(duì)納米氧化鋅材料進(jìn)行表征化處理。斑馬魚胚胎在受精后4 h（4 hpf）暴露納米氧化鋅顆粒0.5，2.5，5.0和10.0 mg·L-124～96 h，計(jì)算胚胎存活率，并于胚胎17 hpf時(shí)間點(diǎn)，收集并用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定中胚層脊索同源（noto），T盒16（tbx16），過短同源a（ta）和tbx6 mRNA表達(dá)；觀察斑馬魚72 hpf心率。將心肌細(xì)胞標(biāo)記紅色熒光蛋白Tg（cmlc2：nuc-dsRed）的斑馬魚交配取胚胎，染毒納米氧化鋅2.5和5.0 mg·L-1，計(jì)數(shù)72 hpf胚胎心肌細(xì)胞數(shù)目。大鼠心肌細(xì)胞（H9c2）與納米氧化鋅0，0.1，0.5，1，5.0和10.0 mg·L-1共培養(yǎng)24 h，Alamar Blue方法檢測(cè)細(xì)胞活力，透射電子顯微鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，化學(xué)發(fā)光法和Seahorse儀分別檢測(cè)細(xì)胞ATP和耗氧率水平。結(jié)果 納米氧化鋅在雙蒸水中的粒徑分布為（331±3）nm。48 hpf的斑馬魚胚胎納米氧化鋅LC50為21.81 mg·L-1。暴露納米氧化鋅2.5 mg·L-1后，17 hpf斑馬魚胚胎的心臟發(fā)育關(guān)鍵基因noto，ta和tbx6表達(dá)降低（P＜0.05）。72 hpf斑馬魚暴露納米氧化鋅5.0 mg·L-1，心率為153 min-1，與正常對(duì)照組相比降低12.6%（P＜0.01），心肌細(xì)胞數(shù)目減少15.5%（P＜0.01）。納米氧化鋅0.5 mg·L-1可引起大鼠心肌細(xì)胞（H9c2）細(xì)胞活力降低（P＜0.05）以及線粒體出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象。與細(xì)胞對(duì)照組相比，細(xì)胞ATP減少25.7%（P＜0.05），耗氧率減少27.2%（P＜0.01）。結(jié)論低劑量納米氧化鋅暴露對(duì)斑馬魚心臟發(fā)育有一定影響，主要表現(xiàn)為心率降低和心肌細(xì)胞數(shù)目減少，這些變化可能與心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)減少以及細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷有關(guān)。

氧化鋅；納米顆粒；斑馬魚；心臟發(fā)育；毒性

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.023

過去幾十年，納米材料在人們?nèi)粘Ｉ钪袩o(wú)處不在，納米毒性研究也受到越來越多科學(xué)家們的重視。金屬氧化物納米材料因其獨(dú)特的性質(zhì)在工業(yè)上廣泛使用［1］。尤其是納米氧化鋅在化妝品、染料、生物傳感、生物成像、藥物載體和抗菌劑方面應(yīng)用廣泛［2］。此外，食品工業(yè)中采用納米氧化鋅作為添加劑來補(bǔ)充鋅離子也是納米氧化鋅的暴露途徑。納米氧化鋅可通過呼吸道、皮膚和消化道途徑進(jìn)入生物體，隨循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入各組織器官，進(jìn)而到達(dá)心臟。以往研究報(bào)道，納米氧化鋅的職業(yè)參考暴露劑量為5 mg·m-3［3］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納米氧化鋅能蓄積在小鼠的心、肺、睪丸組織［4］及大鼠的心、肝、脾、胰腺和骨組織中［5］，提示心臟是納米氧化鋅的潛在靶器官。

納米氧化鋅在不同細(xì)胞類型呈現(xiàn)細(xì)胞毒性和促炎癥效應(yīng)［6］。納米氧化鋅10 mg·L-1導(dǎo)致口腔上皮細(xì)胞（TR146）氧化應(yīng)激增加［7］。急性單核細(xì)胞（THP-1）暴露于納米氧化鋅17.69 mg·L-1可釋放促炎細(xì)胞因子［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，人結(jié)腸癌細(xì)胞（Caco-2）暴露于納米氧化鋅6.4 mg·L-1［9］以及大鼠腎上皮細(xì)胞暴露于納米氧化鋅12.5 mg·L-1［10］均可造成DNA損傷。有關(guān)心臟毒性的研究顯示，納米氧化鋅可能通過干擾鈣穩(wěn)態(tài)引發(fā)心臟毒性。納米氧化鋅可以影響鈣滲透和導(dǎo)致胞質(zhì)中鈣的積累，進(jìn)而引起心肌損傷［11］。但納米氧化鋅對(duì)于心臟發(fā)育的毒性評(píng)估迄今為止還不完善。

斑馬魚出生7 d內(nèi)胚胎透明，可很清楚地觀察到斑馬魚的心臟結(jié)構(gòu)以及化學(xué)物對(duì)斑馬魚心臟發(fā)育的影響，因此是一種研究心臟功能損傷的理想脊椎動(dòng)物模型［12］。本研究采用斑馬魚胚胎和大鼠心肌細(xì)胞系（H9c2）作為研究模型，探討低劑量納米氧化鋅對(duì)于心臟發(fā)育的毒作用以及可能的分子機(jī)制。評(píng)價(jià)納米氧化鋅對(duì)心臟發(fā)育的毒性作用，有助于為納米氧化鋅的安全使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑

野生型斑馬魚AB系成魚由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供，Tg（cmlc2：nuc-dsRed）魚由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院周勇研究員惠贈(zèng)。斑馬魚的養(yǎng)殖和繁殖如下：水溫28°C，光照14 h（光亮）：10 h（黑暗），濕度為80%，胚胎培養(yǎng)于E3培養(yǎng)液（mol·L-1：NaCl 5，KCl 0.17，CaCl20.33，MgSO40.33），均不含亞甲基藍(lán)，并用NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0左右。

納米氧化鋅（Sigma-Aldrich，美國(guó)，貨號(hào)：677450，純度＞97%），Trizol總RNA提取試劑（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)，貨號(hào)：15596026），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本，貨號(hào)：RR037A），PCR熒光定量試劑盒（Roche，瑞士，貨號(hào)：04913850001）。

納米氧化鋅以滅菌雙蒸水溶解配成1 g·L-1儲(chǔ)備液。使用時(shí)，以胚胎培養(yǎng)液梯度稀釋儲(chǔ)備液至需求染毒濃度。

1.2 納米氧化鋅的表征

將納米氧化鋅稱重后分散于雙蒸水中，經(jīng)超聲（40 kHz）分散20 min后制備成懸浮液，將懸浮液滴在銅網(wǎng)上，室溫干燥后通過透射電子顯微鏡觀察納米氧化鋅在水中分布的形態(tài)。同時(shí)將納米氧化鋅水溶液置于激光粒度儀（英國(guó)馬爾文公司）進(jìn)行粒度分布和Zeta電位的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 斑馬魚胚胎染毒

實(shí)驗(yàn)前1 d晚間，將性成熟雌雄魚1∶1放入交配魚缸內(nèi)。次日清晨交配取受精卵，清洗后收集于24孔板，按照每孔10個(gè)，每組3孔，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。選擇正常的受精卵加入納米氧化鋅（0.5，2.5，5.0和10.0 mg·L-1）觀察胚胎生存狀態(tài)。

1.4 熒光定量PCR儀PCR檢測(cè)脊索同源（notochord homeobox，noto），T盒16（T-box 16，tbx16），tbx6和過短同源a（T，brachyury homolog a，ta）mRNA表達(dá)

4 hpf斑馬魚胚胎染毒納米氧化鋅2.5和 5 mg·L-1至17 hpf，清洗后Trizol試劑溶解，并超聲處理進(jìn)行勻漿加入氯仿，離心，加入異丙醇，乙醇洗滌RNA沉淀，測(cè)定濃度，-70℃保存。逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。引物序列為：noto上游：CATGGTGGGATCTGAACGCT，下游CCTGGGATCCAGGGCTTTTT；tbx16上游：GAAGGCTGAGCGATACTCCC，下游GCTGTACACGTCTCGATGGT；ta上游：ATCATCTCCTTAGCGCCGTG，下游AGCACGGGAAACATTCGTCT；tbx6上游：GTGCAACCCAACAATGACCC，下游ATGGAGGGAAGGG-AAATGCG；β肌動(dòng)蛋白上游：ACTCAGGATGCGGAAACTGG，下游AGGGCAAAGTGGTAAACGCT。按照PCR熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，記錄Ct值，以2-△△Ct表示mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 斑馬魚胚胎心率和心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)

4 hpf斑馬魚胚胎暴露納米氧化鋅2.5和 5 mg·L-1至72 hpf，將72 hpf斑馬魚胚胎置于體視鏡（日本奧林巴斯公司）下進(jìn)行觀察。記錄斑馬魚胚胎在1 min內(nèi)的心跳次數(shù)。每組包含10個(gè)斑馬魚胚胎。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

將心肌細(xì)胞標(biāo)記紅色熒光蛋白Tg（cmlc2∶nucdsRed）的斑馬魚交配得到胚胎。這些胚胎的心肌細(xì)胞核能發(fā)出紅色熒光。納米氧化鋅（0，2.5和5.0 mg·L-1）染毒至72 hpf收集胚胎，采用共聚焦顯微鏡（德國(guó)卡爾蔡司公司）對(duì)Tg（cmlc2：nucdsRed）斑馬魚心臟進(jìn)行分層掃描，獲得心臟多個(gè)層面的圖片。根據(jù)斑馬魚心臟解剖結(jié)構(gòu)，確定心室和心房的區(qū)域，對(duì)紅色熒光標(biāo)記的心肌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。每組包含10個(gè)斑馬魚胚胎。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 H9c2細(xì)胞染毒和細(xì)胞存活檢測(cè)

H9c2用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。在96孔板中，每孔加入100 μL 5000個(gè)細(xì)胞，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，與納米氧化鋅（0，0.1，0.5，1.0，5.0和10.0 mg·L-1）進(jìn)行共培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)24 h后，從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出96孔板，每孔加入10%體積的Alamar Blue溶液。加完Alamar Blue后，將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)，波長(zhǎng)為570和600 nm，細(xì)胞存活率（%）=（117216×處理組A570nm-80586×處理組A600nm）/（117216×細(xì)胞組A570nm-80586×細(xì)胞組A600nm）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 透射電子顯微鏡觀察H9c2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

取納米氧化鋅（0，0.1和0.5 mg·L-1）共培養(yǎng)的細(xì)胞，消化后離心得到細(xì)胞團(tuán)塊。立即浸入2.5%戊二醛。用磷酸0.1 mol·L-1漂洗，15 min×3次。用1%鋨酸固定液固定3 h。經(jīng)過漂洗，固定和包埋過程后，使用LKB-1型超薄切片機(jī)切片60 nm。然后用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。透射電鏡觀察，拍片。每個(gè)組分別選取20個(gè)視野。

1.8 H9c2細(xì)胞ATP水平檢測(cè)

取納米氧化鋅（0，0.1和0.5 mg·L-1）共培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞，加入約200 μL裂解液。裂解后4℃下12 000×g離心5 min，取樣品上清，用于后續(xù)的測(cè)定。按照0.01，0.03，0.1，0.3，1.0，3.0和10.0 μmol·L-1濃度配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。加100 μL ATP檢測(cè)工作液到檢測(cè)孔或檢測(cè)管內(nèi)用化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定發(fā)光值。計(jì)算出樣品中ATP的濃度。同時(shí)測(cè)定每個(gè)樣品蛋白濃度，將得到的結(jié)果 除以蛋白濃度來矯正誤差。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 H9c2細(xì)胞耗氧率檢測(cè)

將H9c2細(xì)胞接種在專用的96孔板上。待細(xì)胞貼壁后，加入納米氧化鋅（0，0.1和0.5 mg·L-1），每個(gè)組別至少5個(gè)復(fù)孔。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。分別向探針板A，B和C孔加入寡霉素、羰基氰對(duì)三氟甲氧基苯腙（trifluorometh oxycarbonyl cyanidephenyl hydrazone，F(xiàn)CCP）、抗霉素和魚藤酮。將96孔板置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中2 h。將96孔板置于儀器上平衡20 min。待平衡結(jié)束后，使用Seahorse生物能量測(cè)定儀（美國(guó)Seahorse Bioscience公司）檢測(cè)，計(jì)算耗氧率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果 用x±s表示。數(shù)據(jù)分析軟件為SPSS 20.0。在統(tǒng)計(jì)分析前，對(duì)待統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行Shapiro-Wilk檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)的正態(tài)性。如果滿足正態(tài)性，進(jìn)行單因素方差分析以及多重比較采用LSD法檢驗(yàn)。如果沒有滿足正態(tài)性，則進(jìn)行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)以及對(duì)于兩組以上數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較采用LSD法檢驗(yàn)。采用Fisher精確卡方檢驗(yàn)進(jìn)行百分率的比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納米氧化鋅表征

納米氧化鋅在雙蒸水中的粒徑分布為（331±3）nm。納米氧化鋅在雙蒸水中的zeta電位為（24.7±0.9）mV。

2.2 納米氧化鋅對(duì)斑馬魚胚胎存活率的影響

48 hpf的斑馬魚胚胎納米氧化鋅LC50為 21.81 mg·L-1。與正常對(duì)照組相比，＜5 mg·L-1的劑量暴露下，胚胎死亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（數(shù)據(jù)略）。

2.3 納米氧化鋅對(duì)斑馬魚胚胎心率的影響

與正常對(duì)照組相比，納米氧化鋅2.5 mg·L-1不會(huì)引起心率下降，5 mg·L-1可導(dǎo)致斑馬魚胚胎心率顯著降低〔153±4vs（175±3）min-1，n=3，P＜0.01〕。

2.4 納米氧化鋅對(duì)斑馬魚胚胎心肌細(xì)胞數(shù)目的影響

與正常對(duì)照組相比，納米氧化鋅2.5 mg·L-1組斑馬魚心室心肌細(xì)胞數(shù)目減少（P＜0.05），5 mg·L-1組斑馬魚心房和心室心肌細(xì)胞的數(shù)目減少（P＜0.05）（圖1）。

Fig.1 Effect of zinc oxide nanoparticles（ZnO-NPs）on 72 hpf zebrafish myocardial cells.（×40）Embryos were exposed to ZnO-NPs from 4 to 72 hpf.x±s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control group.

2.5 納米氧化鋅對(duì)于中胚層心臟發(fā)育noto，tbx16，ta和tbx6 mRNA表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，納米氧化鋅2.5和5 mg·L-1暴露組分別在17 hpf時(shí)引起noto，ta和tbx6 mRNA表達(dá)降低（P＜0.01），對(duì)tbx16 mRNA無(wú)影響（圖2）。

2.6 納米氧化鋅對(duì)H9c2細(xì)胞存活的影響

Fig.2 Effect of ZnO-NPs on mRNA expressions of notochord homeobox（noto），T-box 16（tbx16），T，brachyury homolog a（ta）and tbx6 of 17 hpf zebrafish.Embryos were exposed to ZnO-NPs from 4 to 17 hpf.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

與細(xì)胞對(duì)照組相比，納米氧化鋅0.5 mg·L-1引起細(xì)胞活力的降低（P＜0.05）。后續(xù)研究選擇無(wú)細(xì)胞活力影響的0.1 mg·L-1和影響細(xì)胞活力的最低濃度0.5 mg·L-1（圖3）。

Fig.3 Effect of ZnO-NPs on H9c2 cells viability by Alamar Blue.H9c2 cells were treated with ZnO-NPs for 24 h.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.7 納米氧化鋅對(duì)H9c2細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電子顯微鏡觀察結(jié)果 （圖4）表明，細(xì)胞對(duì)照組線粒體正常，納米氧化鋅0.1 mg·L-1組部分線粒體嵴消失，0.5 mg·L-1組出現(xiàn)較多的線粒體空泡化。

Fig.4 Effect of ZnO-NPs on H9c2 cell mitochondria organelles ultrastructure.H9c2 cells were treated with ZnO-NPs for 24 h.Arrows show mitochondrial vacuolation.

2.8 納米氧化鋅對(duì)H9c2細(xì)胞ATP和耗氧率的影響

納米氧化鋅0.1和0.5 mg·L-1可顯著降低細(xì)胞ATP水平（P＜0.05），減少細(xì)胞耗氧率（P＜0.01）（表1）。

Tab.1 Effect of ZnO-NPs on ATP and oxygen consumption rate of H9c2 cells

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，納米氧化鋅在非致死劑量時(shí)，可引起斑馬魚胚胎心臟發(fā)育毒性，表現(xiàn)為胚胎心率降低以及心肌細(xì)胞數(shù)目減少，且心臟發(fā)育關(guān)鍵基因表達(dá)降低。納米氧化鋅還會(huì)引起心肌細(xì)胞線粒體損傷。

通過對(duì)斑馬魚胚胎染毒納米氧化鋅后，發(fā)現(xiàn)其心臟相關(guān)指標(biāo)（心臟發(fā)育特異基因，心率，心肌細(xì)胞數(shù)目）受到影響，因此后續(xù)我們采用大鼠心肌細(xì)胞（H9c2）進(jìn)行亞細(xì)胞器的研究，并發(fā)現(xiàn)線粒體超微結(jié)構(gòu)和功能有損傷的現(xiàn)象。在生理情況下，線粒體可通過為鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提供能量，進(jìn)而調(diào)節(jié)鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和胞漿代謝水平，因此線粒體在心肌細(xì)胞中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。線粒體的有氧糖酵解是心臟主要的能量來源和代謝形式，并且線粒體對(duì)于胚胎發(fā)育過程中的相關(guān)基因表達(dá)也起著一定的作用［13］。有研究報(bào)道，線粒體與心臟發(fā)育關(guān)系密切［14］。心肌細(xì)胞的分化過程中，線粒體的結(jié)構(gòu)和功能也會(huì)動(dòng)態(tài)地相應(yīng)改變［15］。線粒體雖與心臟發(fā)育有關(guān)，但以往研究尚未涉及到納米氧化鋅，本研究揭示了納米氧化鋅可能通過損傷線粒體引起心臟發(fā)育毒性。

以往研究報(bào)道，納米氧化鋅可通過影響炎癥和免疫相關(guān)的基因表達(dá)，導(dǎo)致斑馬魚胚胎的卵黃囊和心包水腫［16］。納米氧化鋅引起斑馬魚胚胎ROS升高，進(jìn)而激活線粒體和胱天蛋白酶通路介導(dǎo)的凋亡效應(yīng)［17］。納米氧化鋅還可部分通過氧化應(yīng)激來?yè)p傷斑馬魚胚胎的孵化和運(yùn)動(dòng)能力［18］。

本研究發(fā)現(xiàn)，納米氧化鋅可引起斑馬魚心臟發(fā)育起始階段3個(gè)關(guān)鍵基因noto，ta和tbx6 mRNA下調(diào)。已有研究發(fā)現(xiàn)，noto和ta mRNA與心臟循環(huán)功能有關(guān)［19］。Tbx6屬于T-box家族的一員，可與sox2共同調(diào)節(jié)中胚層的分化［20］，并能調(diào)節(jié)Notch通路部分基因轉(zhuǎn)錄，由于Notch通路是斑馬魚心臟發(fā)育中重要的通路之一，提示tbx6對(duì)斑馬魚心臟發(fā)育具一定調(diào)控作用。我們的研究還首次發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅可引起心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷和功能受限，具體表現(xiàn)為ATP和耗氧率的降低。而生物體內(nèi)線粒體的損傷會(huì)進(jìn)一步引起胞內(nèi)ROS水平增加及凋亡過程的激活。本研究或可解釋之前發(fā)現(xiàn)的納米氧化鋅處理誘發(fā)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的結(jié)果［21］。此外，本研究發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅暴露可引起斑馬魚胚胎心率降低，心肌細(xì)胞數(shù)目減少，也是心臟潛在毒性的機(jī)制之一。

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Effect and mechanism of zinc oxide nanoparticle on cardiac development of zebrafish embryos

XU Cheng,ZHANG Chun-lan,SHAO Wen-tao,GU Ai-hua
(School of Public Health,Nanjing Medical University,Nanjing 211166,China)

OBJECTlVETo explore the toxic effects of zinc oxide nanoparticls(ZnO-NPs)on cardiac development of zebrafish embryos and rat myocardial cell lines(H9c2),as well as potential molecular mechanisms.METHODSZnO-NPs were characterized.Zebrafish embryos were exposed to different doses of ZnO-NPs(0,0.5,2.5,5.0 and 10.0 mg·L-1)for 24 to 96 h at 4 h post fertilization (4 hpf).The embryo mortality was observed.The expressions of notochord homeobox(noto),T-box 6 (tbx16),T,brachyury homolog a(ta),and tbx6 which were related to cardiac mesoderm were investigated using real-time PCR at 17 hpf.The heart rate and number of cardiomyocytes of embryos〔Tg(cmlc2:nucdsRed)〕exposed to 0,2.5 and 5 mg·L-1ZnO-NPs were detected at 72 hpf.Rat myocardial cell lines (H9c2)were treated with ZnO-NPs(0.1,0.5,1.0,5.0 and 10.0 mg·L-1)for 24 h.Cell viability was measured with Alamar Blue method.Mitochondrial ultrastructure was observed by transmission electron microscopy.Cellular ATP was detected using chemiluminescence,and oxygen consumption rate(OCR) was examined with Seahorse instrument.RESULTSThe particle size of ZnO-NPs was(331±3)nm. The ZnO-NPs LC50of zebrafish embryos at 48 hpf was 21.81 mg·L-1.The mRNA expressions of noto, ta and tbx6 were reduced after ZnO-NPs 2.5 mg·L-1treatment at 17 hpf.The heart rate of 72 hpf zebrafish was 153 min-1in the ZnO-NPs 5 mg·L-1group,12.6%lower than that in the cell vehicle group (P＜0.01),and the number of cardiomyocytes decreased by 15.5%(P＜0.01)compared with the cell vehicle group.Reduced cell viability and mitochondrial vacuolation were observed in H9c2 after ZnO-NPs 0.5 mg·L-1exposure.Compared with the cell vehicle group,the cell ATP decreased by 25.7%(P＜0.05),and OCR decreased by 27.2%(P＜0.01).CONCLUSlONLow-dose ZnO-NPs exposure has effect on the cardiac development of zebrafish,mainly due to reduced heart rate and decreased number of cardiomyocytes.These changes may be related to the decreased expressions of cardiac development-related genes and the impairment of mitochondrial structure and function.

zinc oxide;nanoparticls;zebrafish;cardiac development;toxicity

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81573174);Outstanding Youth Fund of Jiangsu Province(SBK2014010296);and Open Project Program of State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology(KF2015-01)

GU Ai-hua,E-mail:aihuagu@njmu.edu.cn

R99

A

1000-3002-（2017）06-0655-06

2017-03-25接受日期：2017-05-10）

（本文編輯：?jiǎn)毯纾?/p>

國(guó)家自然科學(xué)基金（81573174）；江蘇省杰出青年基金（SBK2014010296）；環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（KF2015-01）

徐誠(chéng)，男，博士研究生，主要從事環(huán)境危險(xiǎn)因素對(duì)胚胎發(fā)育的危害及機(jī)制研究。

顧愛華，E-mail：aihuagu@njmu.edu.cn