潘東峰，梁沛楓，肖紅燕，梁詩(shī)頌

·論 著·

環(huán)氧合酶-2、前列腺素E2在百草枯誘導(dǎo)肺纖維化大鼠中的表達(dá)

潘東峰1,2，梁沛楓2,3，肖紅燕2,4，梁詩(shī)頌1,2

目的 觀察百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠中環(huán)氧合酶-2(COX-2)、前列腺素E2(PGE2)的表達(dá)水平。方法 24只SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各12只，實(shí)驗(yàn)組給予百草枯(50 mg/kg)一次性腹腔注射。HE染色觀察染毒后28 d肺組織病理改變，雙抗體夾心法測(cè)定大鼠血清、肺泡灌洗液(BALF)中COX-2、PGE2水平，免疫組化檢測(cè)肺組織中COX-2、PGE2表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組染毒28 d后可見肺纖維改變，血清和BALF中COX-2表達(dá)水平均顯著增高[(371.02±23.19)比(958.24±35.29)，(351.09±22.54)比(943.68±33.17)pg/mL，P均<0.05)；血清和BALF中PGE2表達(dá)水平均顯著增高[(110.56±12.30)比(366.23±17.54)，(113.58±11.40)比(367.17±19.05)ng/L，P均<0.05)]；肺組織COX-2和PGE2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)、陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)和IHS評(píng)分均顯著增高(COX-2：9.00±2.09比36.67±3.07，1.00±0.00比2.83±0.40，1.33±0.52比5.67±0.81；PGE2：9.83±1.72比38.83±2.56，1.17±0.41比2.67±0.52，1.33±0.52比3.67±1.96，P均<0.05)。結(jié)論 COX-2、PGE2在百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠中高表達(dá)，參與了肺纖維的病理過程。

百草枯；環(huán)氧合酶-2；前列腺素E2；肺纖維化

百草枯(Paraquat，PQ)中毒誘發(fā)的肺間質(zhì)纖維化作為一種不可逆的病理?yè)p傷，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因[1]，但至今其病理機(jī)制還未闡明[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒后的炎癥反應(yīng)參與了組織器官的損害和最終的纖維化[3-6]。前列腺素E(PGE2)是炎癥反應(yīng)的主要炎性介質(zhì)之一，而環(huán)氧合酶-2(COX-2)則是促進(jìn)前列腺素類物質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)型酶，PGE2、COX-2是否參與百草枯中毒后肺纖維化過程尚不清楚。本研究通過百草枯誘導(dǎo)肺纖維化大鼠的實(shí)驗(yàn)性研究，旨在闡明COX-2-PGE2通路在百草枯肺纖維化中的作用，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)百草枯肺纖維化的發(fā)病機(jī)制、防治中毒后肺纖維化的發(fā)展提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器:市售百草枯(20%有效成分，江金帆達(dá)生化股份公司)，COX-2一抗，PGE2一抗，第二抗體試劑SP-9001 試劑盒，DAB顯色試劑試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。BX51T-PHD-J11顯微鏡(日本，奧林巴斯)，多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)CMOS(日本，奧林巴斯)，Image-Pro Plus(美國(guó)，Media Cybernetics 公司)。

1.2 動(dòng)物模型制備:清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD) 大鼠24 只，雌雄各半，鼠齡8～10周，體重180～220 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物批號(hào)：201401224。SD大鼠室溫下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組大鼠均給予PQ(50 mg/kg)一次性腹腔注射，后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)直至處死；對(duì)照組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)。

1.3 標(biāo)本采集:實(shí)驗(yàn)大鼠在染毒后0 d、28 d分別取6只，10%水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔注射麻醉后開腹，取腹主動(dòng)脈血3 mL；尖端磨平的14號(hào)針頭插入氣管中，結(jié)扎后經(jīng)氣管分3次向右肺內(nèi)注入生理鹽水3 mL，緩慢回抽收集肺泡灌洗液(BALF)，回收率>70%。動(dòng)脈血、BALF 1 200 r/min離心10 min后取上清液，分裝于-70 ℃凍存待測(cè)；結(jié)扎左肺門，于結(jié)扎線外側(cè)切除左肺，置于10%甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片，行HE染色觀察肺組織病理改變。

1.4 HE和Masson染色

1.5 血清、BALF中COX-2、PGE2水平測(cè)定:雙抗體夾心法測(cè)定大鼠血清、BALF中COX-2、PGE2水平。純化的抗COX-2、抗PGE2抗體制成固相抗體，COX-2、PGE2分別與 HRP 標(biāo)記的羊抗大鼠抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠血清、BALF中COX-2、PGE2濃度。

1.6 免疫組化:肺組織少許于磷酸鹽緩沖液沖洗，4%多聚甲醛(0.1 MPBS，pH 7.0～7.6，含0.1%DEPC)固定，乙醇脫水后石蠟包埋、切片。切片依次經(jīng)脫蠟、入水0.1 MPBS沖洗，0.01 M檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)修復(fù)；5%正常山羊血清封閉一抗4 ℃孵育24 h，二抗37 ℃孵育20 min，0.1MPBS洗3次×5 min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37 ℃ 20 min，0.1 MPBS沖洗；DAB顯色6 min，充分水洗；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min，充分水洗、1%鹽酸酒精分化、1%胺水反藍(lán)、充分水洗，經(jīng)70%乙醇5 min、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。選擇實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組免疫組化染色切片的陽(yáng)性和陰性組織相，進(jìn)行100×顯微照相，隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行免疫組化評(píng)分，采用 IHS 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]，A為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)：0～1%=0，1%～10%=1，10%～50%=2，50%～80%=3，80%～100%=4；B為陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)：0(陰性)，1(弱陽(yáng)性)，2(陽(yáng)性)，3(強(qiáng)陽(yáng)性)；IHS=A×B：“-”為0分，“+”為1～4分，“++”為5～8分，“+++”為9～12分。

2 結(jié)果

2.1 HE和Masson染色：對(duì)照組HE染色見肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁無增厚，肺泡腔大小均勻，腔內(nèi)未見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；實(shí)驗(yàn)組HE染色可見肺泡輕度融合擴(kuò)張，肺間隔輕度增生； Masson染色肺泡腔腔內(nèi)可見大量纖維素樣滲出物，肺間隔增寬，纖維組織增生(圖1-圖3，目錄后)。

2.2 血清和BALF中COX-2表達(dá)水平：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血清和BALF中COX-2表達(dá)水平在0 d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組染毒28 d后，血清和BALF中COX-2表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

表1 百草枯誘導(dǎo)肺纖維化大鼠血清和BALF中COX-2表達(dá)水平

2.3 血清和BALF中PGE2表達(dá)水平：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血清和BALF中PGE2表達(dá)水平在0 d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組染毒28 d后，血清和BALF中PGE2表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

表2 百草枯誘導(dǎo)肺纖維化大鼠血清和BALF中PGE2表達(dá)水平

2.4 肺組織中COX-2、PGE2免疫組化:免疫組化結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組肺組織中COX-2和PGE2較對(duì)照組顯著高表達(dá)(圖4-圖7，目錄后)，定量結(jié)果顯示見表3；實(shí)驗(yàn)組COX-2和PGE2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)、陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)和IHS評(píng)分均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表3 百草枯誘導(dǎo)肺纖維化大鼠肺組織中COX-2、PGE2免疫組化評(píng)分比較(分

3 討論

百草枯中毒后的肺纖維化的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，近年來隨著對(duì)百草枯中毒分子生物學(xué)機(jī)制研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)百草枯中毒后除了百草枯本身理化作用外，還有大量的炎性因子和細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-10(IL-10)、核轉(zhuǎn)錄因子(NF-КB)等都有被報(bào)道參與了組織器官的損害和最終的纖維化[3-6]，因而百草枯中毒后的炎癥反應(yīng)受到越來越多的重視。

花生四烯酸-誘導(dǎo)型酶COX-2-PGE2這一通路是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，而肺為這一途徑中的終極代謝產(chǎn)物PGE2滅活的主要器官(其首次經(jīng)過肺循環(huán)后，可有95%被代謝)。既往研究中[8-11]，COX-2-PGE2通路被證實(shí)在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化過程中扮演重要作用，由此推論COX-2-PGE2通路是博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的主要機(jī)制。但此推論僅僅是基于博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型研究所得，在百草枯所致的肺纖維化模型中是否具有相同的機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。前期已有學(xué)者證實(shí)[12]，PQ中毒后大鼠肺內(nèi)脂肪酸及羥脯氨酸含量均明顯上升，而羥脯氨酸含量則是衡量肺間質(zhì)纖維化的一個(gè)指標(biāo)，這似乎是PQ中毒患者出現(xiàn)肺間質(zhì)纖維化的一個(gè)因素。但在研究中并未涉及花生四烯酸(AA)的代謝終產(chǎn)物PGE2及代謝途徑中重要的限速酶COX-2的表達(dá)情況?；谏鲜隼碚摶A(chǔ)，我們假設(shè)，COX-2-PGE2通路參與了百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化過程。

研究結(jié)果顯示，在百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化過程中，COX-2和PGE2均出現(xiàn)高表達(dá)，證實(shí)COX-2和PGE2在參與了百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化病理過程。追溯其理論基礎(chǔ)，在炎癥刺激如物理、化學(xué)等因素的作用下，細(xì)胞的磷脂酶被激活，從磷脂酶中釋放出AA，AA在環(huán)氧合酶(COX)等一系列酶的催化作用下最終會(huì)生成主要代謝產(chǎn)物-前列腺素類(PGs)。COX有兩種同工酶，即組成性酶COX-1和誘導(dǎo)型酶COX-2，其中誘導(dǎo)型酶COX-2在正常情況下并不存在，僅在各種化學(xué)、物理性損傷和生物因子(細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、內(nèi)毒素等)刺激下，經(jīng)過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用于COX-2的5’端轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，促進(jìn)COX-2轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)COX-2高表達(dá)，繼而促進(jìn)PGs的合成，介導(dǎo)疼痛、炎癥和發(fā)熱等反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了COX-2和PGE2在百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化病理過程中的表達(dá)情況，但研究?jī)H局限于COX-2和PGE2與肺纖維化的關(guān)系，至于這一通路上的其他因子是否也具有相同的效果，以及肺纖維化過程與其他細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)是否存在復(fù)雜的關(guān)系，尚需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Expression of cyclooxygenase 2 and prostaglandin E2in rats with paraquat induced pulmonary fibrosis

PAN Dongfeng1,2,LIANG Peifeng2,3,XIAO Hongyan2,4,LIANG Shisun1,2.

1.Department of Emergency,Ningxia People’s Hospital,Yinchuan 750002,China;2.The First Affiliated Hospital of Northwest University for Nationalities, Yinchuan 750002, China;3.Analysis department,Ningxia People’s Hospital,Yinchuan 750002,China;4.Pathology Department,Ningxia People’s Hospital,Yinchuan 750002,China

Objective To observe the expression of cyclooxygenase 2 (COX-2) and prostaglandin E2(PGE2) in rats with paraquat-induced pulmonary fibrosis.Methods 24 SD rats were randomly divided into the experimental group and control group (n=12),and the rats in the experimental group were given paraquat (50 mg/kg) by intraperitoneal injection for once.The pathology changes of lung tissue were evaluated by HE staining,the expression of COX-2 and PGE2in serum and alveolar lavage fluid (BALF) were detected by the double antibody clamp method,the expression of COX-2 and PGE2in lung tissue were detected by using the immunohistochemical method.Results Compared with the control group,pulmonary fibrosis changes were found in the experimental group after 28 days,the COX-2 expression in serum and BALF were significantly increased (371.02±23.19 vs.958.24 ± 35.29,351.09 ± 22.54 vs.943.68 ± 33.17) pg/ml (P<0.05);and PGE2in serum and BALF expression levels were significantly higher (110.56 ± 12.30 vs.366.23 ± 17.54,113.58 ± 11.40 vs.367.17±19.05 ng/L) (P<0.05);COX-2 of lung tissue and PGE2positive cells number classification,positive color intensity scale and IHS scores were significantly higher (COX-2:9.00±2.09 vs.36.67± 3.07,1.00±0.00 vs.2.83± 0.40,1.33±0.52 vs.5.67 ± 0.81 mm;PGE 2:9.83±1.72 vs.38.83±2.56,1.17± 0.41 vs.2.67±0.52,1.33± 0.52 vs.3.67 ±1.96) (P<0.05).Conclusion COX-2 and PGE2are higher expression in rats with pulmonary fibrosis induced by paraquat,they are participating in the pathological process of pulmonary fibrosis.

Paraquat;Cyclooxygenase2;ProstaglandinE2;Pulmonaryfibrosis

10.13621/j.1001-5949.2017.07.0588

寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NZ14161)

1.寧夏人民醫(yī)院急診科，寧夏 銀川 750002 2.西北民族大學(xué)第一附屬醫(yī)院，寧夏 銀川 750002 3.寧夏人民醫(yī)院統(tǒng)計(jì)室，寧夏 銀川 750002 4.寧夏人民醫(yī)院病理科，寧夏 銀川 750002

潘東峰(1977-)，男，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事急危重癥、中毒等相關(guān)研究。

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170713.0845.010.html

R735

A

2016-11-14 [責(zé)任編輯]王凱榮