王娟娟++++++馬利

[摘要] 目的 探討外周血T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）、腦脊液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及結(jié)核菌素試驗（PPD試驗）在結(jié)核性腦膜炎診斷中的應(yīng)用價值。 方法 選擇2015年1月～2016年12月延安大學(xué)附屬醫(yī)院收治的疑似結(jié)核性腦膜炎患者65例為研究對象，所有患者均行外周血T-SPOT.TB、腦脊液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及PPD試驗。觀察比較3種檢測方法的在結(jié)核性腦膜炎診斷中的靈敏度、特異度等。 結(jié)果 65例患者中，35例為結(jié)核性腦膜炎患者，30例為非結(jié)核性腦膜炎患者。結(jié)核性腦膜炎患者中，T-SPOT.TB陽性率為74.29%，明顯高于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及PPD試驗的陽性率（40.00%，57.14%），且PPD試驗陽性率高于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。在非結(jié)核性腦膜炎患者中，PPD試驗陽性率為26.27%，明顯高于T-SPOT.TB及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的陽性率（10.00%，0.00%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。在結(jié)核性腦膜炎診斷中，T-SPOT.TB的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為89.66%、75.00%、74.29%、90.00%，均明顯高于PPD試驗的71.43%、59.46%、57.14%、73.33%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；T-SPOT.TB在結(jié)核性腦膜炎診斷中的特異度、陽性預(yù)測值均高于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的52.63%、40.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 外周血T-SPOT.TB檢測在結(jié)核性腦膜炎診斷中具有較高的敏感度、特異度，有助于結(jié)核性腦膜炎的快速診斷，值得臨床推廣。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核性腦膜炎；外周血；T細胞斑點試驗； 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)；結(jié)核菌素試驗；診斷

[中圖分類號] R529.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（a）-0119-04

Application value of different testing methods in the diagnosis of tuberculous meningitis

WANG Juanjuan MA Li▲

Department of Neurology， Yan 'an University Affiliated Hospital， Shaanxi Province， Yan'an 716000， China

[Abstract] Objective To explore the application value of peripheral blood T-SPOT.TB， cerebrospinal fluid mycobacterium tuberculosis culture and tuberculin test （PPD test） in the diagnosis of tuberculous meningitis. Methods 65 cases of patients suspected tuberculous meningitis from January 2015 to December 2016 in Yan 'an University Affiliated Hospital were chosen as the research objects. All patients were given the test of peripheral blood T-SPOT.TB， cerebrospinal fluid mycobacterium tuberculosis culture and PPD test. The sensitivity， specificity in the diagnosis of tuberculous meningitis were compared among the three testing methods. Results Among 65 patients， there were 35 cases with tuberculous meningitis and 30 cases with non-tuberculous meningitis. In patients with tuberculous meningitis， the positive rate of T-SPOT.TB test was 74.29%， and it was significantly higher than that of mycobacterium tuberculosis cultivate and PPD test （40.00%， 57.14%）， and the positive rate of the PPD test was higher than that of mycobacterium tuberculosis culture， with statistically significant differences （P < 0.05）. In patients with non-tuberculous meningitis， the positive rate of PPD test was 26.27%， which was significantly higher than that of T-SPOT.TB and mycobacterium tuberculosis culture （10.00%， 0.00%）， with statistically significant differences （P < 0.05）. In the diagnosis of tuberculous meningitis， the sensitivity， specificity， positive predictive value， negative predictive value of T-SPOT.TB was 89.66%， 75.00%， 74.29%， 90.00% respectively， which were significantly higher than 71.43%， 59.46%， 57.14%， 73.33% of PPD test， with statistically significant differences （P < 0.05）； the specificity and positive predictive value of T-SPOT. TB were higher than those of the mycobacterium tuberculosis culture （52.63%， 40.00%）， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion Peripheral blood T-SPOT.TB test in the diagnosis of tuberculous meningitis has high sensitivity and specificity， which is helpful for the rapidly diagnosing tuberculous meningitis. It is worthy of clinical promotion.

[Key words] Tuberculous meningitis； Peripheral blood； T cells spot test； Mycobacterium tuberculosis culture； Tuberculin test； Diagnosis

結(jié)核性腦膜炎是由結(jié)核分枝桿菌引起腦膜、脊膜的非化膿性炎癥性疾病，是臨床上最為常見、嚴重的肺外結(jié)核，具有較高的致死率高和致殘率。結(jié)核性腦膜炎多起病隱匿，病程較慢，但也有部分患者起病較急，早期臨床表現(xiàn)較輕，但隨著顱內(nèi)壓的增高，患者常常表現(xiàn)出嚴重的腦膜刺激癥狀和顱內(nèi)壓增高表現(xiàn)，如頭痛、嘔吐和視乳頭水腫，嚴重時出現(xiàn)去腦強直發(fā)作或去皮質(zhì)狀態(tài)，因此早期診斷并給予及時治療尤為重要。目前結(jié)核性腦膜炎的診斷主要根據(jù)患者是否有其他部位的結(jié)核病史或結(jié)核接觸史、具有典型的臨床癥狀及體征、實驗室檢查。但是也有部分患者并無結(jié)核病史或結(jié)核接觸史，且沒有典型的臨床表現(xiàn)，因此，早期診斷僅依賴于實驗室檢查。目前臨床上常見的檢測方式有結(jié)核菌素實驗（PPD實驗）、腦脊液涂片、染色、鏡檢，以及外周血血象和影像學(xué)檢測等[1-4]。然而，大量研究結(jié)果顯示，PPD實驗的敏感度并不高，甚至存在一定的假陽性率[5-6]，因此臨床上僅將其作為輔助診斷手段。在腦脊液標本中直接檢出抗酸桿菌以及采用常規(guī)的培養(yǎng)方法分離出結(jié)核分枝桿菌仍然被認為是結(jié)核性腦膜炎實驗診斷的“金標準”。然而由于結(jié)核性腦膜炎多見于1～3歲的小兒，腰穿抽取腦脊液極為困難，且即使是成年人，腦脊液的獲取量也十分有限，且檢測結(jié)果還受細菌數(shù)量的影響，因此外周血T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）的出現(xiàn)為結(jié)核性腦膜炎提供了一個新的診斷途徑，其在結(jié)核病診斷中的價值已在大量臨床研究中[7-10]得到證實。本研究選擇延安大學(xué)附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）近兩年來收治的結(jié)核性腦膜炎疑似病例進行研究，分析目前臨床上常用的幾種實驗室檢測方法的診斷價值，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年1月～2016年12月我院收治的疑似結(jié)核性腦膜炎患者65例為研究對象，男41例，女24例；年齡15～65歲，平均（39.5±19.7）歲；病程1～40 d，平均（17.2±6.9）d。納入標準：患者均表現(xiàn)為頭痛、嘔吐、發(fā)熱、易激惹、頸項強直、癲癇、局部神經(jīng)損害表現(xiàn)、意識改變、昏睡等臨床癥狀和體征。排除標準：其他病毒、細菌、真菌感染所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，有腰穿禁忌證，3個月內(nèi)接受過抗結(jié)核治療。

1.2 診斷標準

結(jié)核性腦膜炎的臨床診斷標準[11]：具有以下1項或多項結(jié)核性腦膜炎的癥狀或體征：頭痛、嘔吐、發(fā)熱、易激惹、頸項強直、癲癇、局部神經(jīng)損害表現(xiàn)、昏睡、意識改變?；颊邞?yīng)滿足A或B標準：其中，A為具有典型的癥狀或體征的同時至少符合以下條件的1項：腦脊液中分離培養(yǎng)到結(jié)核分枝桿菌，腦脊液中鏡檢到抗酸桿菌，PCR法檢測到結(jié)核分枝桿菌；B為有疑似癥狀或體征及腦脊液改變同時在其與結(jié)核病組織學(xué)改變一致的腦或脊髓中鏡檢到抗酸桿菌，或肉眼可見的腦膜炎（尸檢時）。其他非結(jié)核性腦膜炎的診斷參考第7版《神經(jīng)病學(xué)》[12]。

1.3 檢測方法

入院后，所有患者都分別接受PPD實驗、外周血T-SPOT.TB檢測以及腰穿抽取腦脊液進行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。

1.3.1 PPD實驗 卡介菌純蛋白衍生物的稀釋劑（50 U/mL，成都生物制品研究所）。于患者左前臂掌側(cè)下1/3處，皮內(nèi)注入上述稀釋液0.1 mL，48～72 h后檢查注射部位反應(yīng)，測量浸潤硬結(jié)橫徑及垂直徑的平均值，浸潤硬結(jié)平均直徑<5 mm為陰性，≥5 mm為陽性。

1.3.2 T-SPOT.TB檢測 檢測人外周血抗凝全血中的結(jié)核特異抗原刺激活化的效應(yīng)T細胞，根據(jù)T-SPOT.TB試劑盒（Oxford Immunotec Oxford UK）說明書進行操作。使用肝素抗凝管采集患者外周靜脈血5～10 mL，密度梯度離心法分離外周血單個核細胞。在已包被抗體的微量板的4個孔中，分別加入陰性對照細胞培養(yǎng)液、陽性對照植物血凝素、抗原A（早期分泌性靶抗原6，ESAT-6）以及抗原B（濾液培養(yǎng)蛋白10，CFP-10）。每孔加入外周血單個核細胞后置于培養(yǎng)箱37℃溫育16～20 h后，從培養(yǎng)箱中取出后去除細胞培養(yǎng)液，恢復(fù)至室溫；采用磷酸鹽緩沖液（PBS）反復(fù)洗滌5次，采用PBS 200倍稀釋濃縮標記抗體試劑；每個反應(yīng)孔加入500 μL辣根過氧化物酶標記的鏈霉菌卵白素，在37℃孵育1 h，后棄標記抗體工作液，PBS反復(fù)洗滌5次，每個反應(yīng)孔加入ACE底物顯色溶液50 μL后室溫孵育7 min；采用去離子水徹底洗滌培養(yǎng)板終止反應(yīng)，室溫干燥培養(yǎng)板，記錄每個反應(yīng)孔內(nèi)深藍色清晰斑點數(shù)目。陽性判斷標準：陰性對照孔斑點數(shù)≤5個，檢測孔A或檢測孔B斑點數(shù)≥6個，判斷為陽性；陰性對照孔斑點數(shù)≥6個，檢測孔A或檢測孔B斑點數(shù)≥2倍陰性對照孔斑點數(shù)，判斷為陽性。反之均為陰性。

1.3.3 腦脊液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng) 腰穿后留取腦脊液1～2 mL進行結(jié)核菌快速培養(yǎng)，采用BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)鑒定/藥敏儀（美國BD公司生產(chǎn)）進行結(jié)核菌培養(yǎng)及藥敏試驗，將腦脊液嚴格按照MGITTM Procedure Manual要求進行培養(yǎng)，若滿8周仍無菌生長即報告培養(yǎng)陰性。

1.4 觀察指標

比較T-SPOT.TB試驗、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、PPD試驗的陽性檢出率。比較T-SPOT.TB試驗、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、PPD試驗在結(jié)核性腦膜炎中的診斷價值，計算靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。敏感度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%；特異度=真陰性/（假陽性+真陰性）×100%；陽性預(yù)測值=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%；陰性預(yù)測值=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種方法檢測情況比較

65例結(jié)核患者中結(jié)核性腦膜炎35例，非結(jié)核性腦膜炎30例。30例非結(jié)核性腦膜炎中化膿性腦膜炎11例，隱球菌性腦膜炎3例，病毒性腦膜炎13例，梅毒性腦炎3例。比較3種方法對結(jié)核性腦膜炎及非結(jié)核性腦膜炎患者的診斷情況，結(jié)核性腦膜炎患者中，T-SPOT.TB陽性率明顯高于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及PPD試驗陽性率，PPD試驗陽性率高于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。在非結(jié)核性腦膜炎患者中，PPD試驗陽性率明顯高于T-SPOT.TB及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。提示PPD試驗的假陽性率較高，其次為T-SPOT.TB，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)最低。

2.2 3種方法在結(jié)核性腦膜炎中的診斷價值

T-SPOT.TB在結(jié)核性腦膜炎診斷中的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均明顯高于PPD試驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；T-SPOT.TB在結(jié)核性腦膜炎診斷中的特異度、陽性預(yù)測值高于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），雖敏感度及陰性預(yù)測值低于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

3 討論

結(jié)核性腦膜炎不僅具有較高的死亡率還極易與其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染相混淆，如化膿性腦膜炎、隱球菌性腦膜炎、病毒性腦膜炎、梅毒性腦炎等，因此誤診率極高。臨床上常用的腦脊液涂片鏡檢或培養(yǎng)結(jié)核桿菌，其陽性檢出率較低，且對于合并有其他疾病免疫力低下或服用免疫抑制劑的患者，極有可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因此尋找高敏感性和高特異性的診斷方法顯得尤為重要。

ESAT-6/CFP-10融合蛋白是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群基因RD-l區(qū)域的結(jié)核特異性蛋白抗原，該區(qū)只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和少數(shù)致病性分枝桿菌基因組中，為結(jié)核分枝桿菌及少數(shù)非結(jié)核分枝桿菌所特有的T細胞刺激抗原，可針對細胞上的刺激，產(chǎn)生INF-γ，且在診斷結(jié)核性疾病時不受是否接種卡介苗的影響[13]。因此，兩種抗原多肽制備的聯(lián)合應(yīng)用可提高檢測的敏感性及特異性?；谝陨显淼腡-SPOT.TB技術(shù)是目前最敏感的檢測結(jié)核抗原特異性T淋巴細胞的技術(shù)，即應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點法或酶聯(lián)免疫吸附法定量檢測全血或外周血中特異性T細胞在特異性抗原的刺激下產(chǎn)生的特異性INF-γ[14-15]。主要適用于2～3周以上不明原因發(fā)熱患者的結(jié)核病篩查、免疫力低下或合并HIV感染的肺外結(jié)核患者的診斷，及接種過卡介苗人群的結(jié)核病篩查，該項檢測技術(shù)既簡單快捷，同時也避免了因免疫功能受損而導(dǎo)致的假陽性率。有報道顯示，T-SPOT.TB診斷肺結(jié)核的敏感度為94.1%[16]。甘路民等[17]將該項技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核性腦膜炎的診斷中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB試驗診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感性為87.18%，特異性為87.80%，優(yōu)于PPD試驗。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核性腦膜炎患者中，T-SPOT.TB陽性率為74.29%，敏感度為89.66%，特異度為75.00%，陽性率及特異度均明顯高于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及PPD試驗，敏感度高于PPD試驗，進一步肯定了T-SPOT.TB在結(jié)核性腦膜炎診斷中的價值，與既往的研究結(jié)果一致[18-22]。此外，張秀英等[23]對不同的檢測樣本進行比較，結(jié)果顯示結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液ELISPOT試驗的陽性檢出率高于外周血，且腦脊液ELISPOT試驗的特異度高于外周血，可見受感染組織的ELISPOT試驗較單純外周血檢測對診斷活動性結(jié)核病有更具特異性。本研究中，因取材較為困難，僅對采集的腦脊液進行了結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，但陽性檢測率并不高，考慮可能是由樣本本身含菌量較少所致。然而外周血T-SPOT.TB檢測彌補了這一不足，本研究中結(jié)核性腦膜炎患者的陽性檢出率為74.29%，對于腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)陰性的患者提供了有效而簡捷的診斷方式[24-25]。

綜上所述，外周血T-SPOT.TB檢測在結(jié)核性腦膜炎診斷中具有較高的敏感度、特異度，且檢測方法簡單、快速，有助于結(jié)核性腦膜炎的快速診斷，值得在臨床上推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2017-02-25 本文編輯：程 銘）