遲宏罡，于豐彥，張軼，鄒穎＊＊

（1.廣東醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院中醫(yī)學教研室東莞523808；2.廣東醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院內(nèi)科學教研室東莞523808）

芍藥湯對實驗性結腸炎小鼠Notch信號通路的影響＊

遲宏罡1，于豐彥2，張軼1，鄒穎1＊＊

（1.廣東醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院中醫(yī)學教研室東莞523808；2.廣東醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院內(nèi)科學教研室東莞523808）

目的：研究芍藥湯對葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium，DSS）誘導的結腸炎小鼠Notch信號通路的影響，探討其治療結腸炎的療效和機制。方法：實驗設正常對照組、DSS組、DSS+芍藥湯組（17.8 g·kg-1），n= 10；3.5%DSS自由飲用7天制成結腸炎小鼠模型后第2天進行治療，連續(xù)7天。記錄小鼠的疾病活動指數(shù)（Disease Activity Index，DAI）評分，HE染色觀察病理改變并評分，檢測結腸髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）活性，ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）和白介素-6（Interleukin-6，IL-6）濃度，Real-time PCR法和免疫組化法檢測Notch-1、Hes-1、Math-1和黏蛋白2（Mucins-2，Muc-2）的表達。結果：與模型組比較，芍藥湯能有效降低結腸炎小鼠DAI評分、結腸組織病理學評分和MPO活性，增加結腸長度，抑制IL-6和TNF-α的表達，抑制Notch-1和Hes-1 mRNA及蛋白表達，促進Math-1和Muc-2 mRNA及蛋白表達。結論：芍藥湯能夠對DSS誘導的結腸炎小鼠模型起到保護作用，其作用機制可能與調(diào)控Notch信號通路有關。

炎癥性腸病芍藥湯Notch信號通路腸道黏膜屏障葡聚糖硫酸鈉

炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD）是一種較為常見的慢性反復發(fā)作的腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）和克隆恩?。–rohn?s Disease，CD）兩種類型[1]。近年來，IBD的發(fā)病率和患病率在我國有逐年增高的趨勢，由于該病的病因及發(fā)病機制復雜，具有病程纏綿、治愈難度大且容易復發(fā)的特點，已被WHO列為現(xiàn)代難治病之一。研究表明，腸道上皮細胞的增殖和分化在結腸上皮黏膜的維護和修復方面發(fā)揮非常重要的作用，Notch信號通路是腸道上皮細胞的自我更新和向不同譜系的細胞分化的重要調(diào)節(jié)通路，在維持腸道黏膜穩(wěn)態(tài)中起關鍵的作用[2]。芍藥湯出自《素問病機氣宜保命集》，具有清熱燥濕、調(diào)氣和血的功效，臨床和實驗研究表明芍藥湯治療IBD具有較好的療效[3,4]，但其治療IBD的機制尚未明確。本實驗采用葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodi?um，DSS）誘導小鼠結腸炎模型，探討芍藥湯對結腸炎的治療作用，并研究其對Notch信號通路的用，旨在深入研究芍藥湯治療IBD的療效和分子機制，為該方的臨床應用提供理論和實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑

DSS（美國MP Biomedicals公司，批號：160110）；髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20150718）；小鼠TNF-α和IL-6 ELISA檢測試劑盒（欣博盛生物有限公司批號：M160913-102a，M160913-004a，）；Trizol（美國Invitrogen公司，批號：108302）、RNase inhibitor、RT（逆轉錄）試劑盒（美國Thermo公司，批號：00145206）；兔多克隆抗體Notch-1、Hes-1、Math-1和黏蛋白2（Muc-2）Muc-2（北京博奧森生物技術有限公司，批號：AD082520、AE011537、AD01206618、AA10236618）；Biotek synergy 2多功能酶標儀（美國Bio-rad公司）；ABI 7500實時熒光定量PCR（美國ABI公司）。

1.2 藥物

芍藥湯方：芍藥30 g，黃芩、黃連、當歸各15 g，大黃9 g，木香、檳榔、炙甘草各6 g，肉桂5 g，以上藥物購自東莞市同仁堂藥店（批號：20150166）。采用傳統(tǒng)水煎方法，共煎煮兩次，第一次煎煮加入藥量10倍的水，侵泡30 min，煎煮1.5 h，紗布過濾，第二次煎煮將藥物殘渣加入6-8倍的水，煎煮1 h，將兩次藥液合并過濾后，水浴蒸發(fā)為濃度為1 g?mL-1的生藥，高溫滅菌后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗動物

30只C57BL/6小鼠，SPF級，（雌性，7-8周，體重18-20 g），購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，合格證編號：SCXK（粵）2013-0002。動物飼養(yǎng)環(huán)境：室溫為（18-25℃），濕度為（60%-70%），正常更替光照，24 h供應飼料及飲用水。

2 實驗方法

2.1 造模

按照參考文獻[5]的方法制備急性結腸炎小鼠模型，在飲用水中加入DSS粉末，制成3.5%DSS溶液給小鼠自由飲用，連續(xù)7天，制成結腸炎模型。

2.2 動物分組及給藥

實驗隨機分為正常對照組、DSS組、DSS+芍藥湯組。其中，芍藥湯組給藥量為17.8 g·kg-1（此為前期研究確定的最佳劑量），其余兩組灌服相同劑量的純凈水，造模結束后第2天用芍藥湯進行藥物干預，每天1次，連續(xù)給藥7天。

2.3 疾病活動指數(shù)（Disease Action Index，DAI）評分及結腸長度測量

實驗期間觀察并記錄小鼠體重、大便性狀和血便情況，DAI=體重下降百分比+大便性狀分數(shù)+血便分數(shù)；參照文獻[6]DAI評分標準，體重分數(shù)：（0=體重無下降；1=1%-5%；2=5%-10%；3=10%-15%；4=＞15%）；大便性狀：（0=正常；2=糞便軟條狀；4=稀便）；血便：（0=大便陰血陰性；2=大便潛血；4=肉眼血便）。同時，實驗結束后，處死小鼠，分離闌尾至肛門之間的腸道，測量盲腸和近端直腸之間的距離。

2.4 結腸組織H&E染色及病理學評分

在10%福爾馬林中固定24 h以上的結腸組織，經(jīng)脫水、包埋后放在切片機上切片，厚度5 μm，蘇木精-伊紅（Hematoxylin Eosin，HE）染色，顯微鏡下觀察組織病理切片形態(tài)學變化及評分，參照文獻[7]的評分標準：（0分：未見明顯病理改變；1分：10%高倍視野中，呈低水平淋巴細胞浸潤，腸絨毛結構沒有破壞；2分：10%-25%高倍視野中，呈中等水平淋巴細胞浸潤，腸隱窩加深，腸壁增厚但未侵及肌層，未見潰瘍；3分：25%-50%高倍視野中，呈高水平淋巴細胞浸潤，血管增生，腸壁增厚并且侵及肌層，未見潰瘍；4分：明顯淋巴細胞浸潤，血管增生伴腸隱窩加深變形，腸壁增厚且侵及肌層，見潰瘍）。

2.5 MPO活性檢測

MPO是一種主要表達于中性粒細胞內(nèi)的過氧化物酶，在急性炎癥時大量的聚集，因此，MPO活性是腸道急性炎癥反應的一個重要指標。參照MPO活性檢測試劑盒說明書進行操作。

2.6 ELISA實驗

細胞因子在IBD的發(fā)病中起重要作用，其中最具有代表性的促炎因子是TNF-α，是目前治療IBD的關鍵靶點之一。其次，促炎因子IL-6的含量也在很大程度上反映了炎癥的輕重程度。因此，本實驗應用ELI?SA方法檢測小鼠結腸組織TNF-α和IL-6的濃度，方法按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

2.7 Real-time PCR實驗

Trizol試劑提取小鼠結腸總RNA，按照試劑盒的說明書進行逆轉錄為cDNA，各引物序列如下：Notch-1：Forward ACA TCC GTG GCT CCA TTG TCT A，Re?verse TCT TGT AAG GAA TAT TGA GGC TGC；Hes-1：Forward AAA ATT CCT CCT CCC CGG TG，Reverse TTT GGT TTG TCC GGT GTC G；Math-1：Forward AAA GGA GGC TGG CAG CAA，Reverse TGG TTC AGC CCG TGC AT；Muc-2：Forward GCT GAC GAG TGG TTG GTG AAT G，Reverse GAT GAG GTG GCA GAC AGG AGA C。在ABI 7 500熒光定量PCR儀上進行反應，以GAPDH基因為內(nèi)參，實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)結果采用2－ΔΔCt分析法。

2.8 免疫組化

取結腸組織先用10%福爾馬林固定，然后經(jīng)脫水、包埋、浸透和聚合后，將組織塊放在切片機上連續(xù)切片，厚度為5 μm。采用SP法測定小鼠結腸組織Notch-1、Hes-1、Math-1和Muc-2表達情況，具體方法參照免疫組化檢測試劑盒。

圖1 芍藥湯對結腸炎小鼠DAI評分的影響

圖2 芍藥湯對結腸炎小鼠結腸長度的影響

圖3 芍藥湯對結腸炎小鼠結腸組織MPO活性的影響

2.9 統(tǒng)計學方法

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料用均數(shù)標準差()表示。多組間比較采用單向方差分析（One-way ANOVA），先對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，方差齊時多重比較采用LSD方法檢驗，如方差不齊時采用近似F檢驗Welch法進行方差分析，多重比較采用Dunnett?s T3方法檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 芍藥湯對結腸炎小鼠DAI評分的影響

由圖1可見，正常對照組小鼠體重持續(xù)增長，大便正常；DSS組小鼠在造模第3天起體重明顯減輕，肛周出現(xiàn)明顯血便，DAI指數(shù)顯著升高，伴活動減少，毛發(fā)色澤變差，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.001）。芍藥湯治療組小鼠治療后第3天起體重開始逐漸回升，DAI指數(shù)顯著低于DSS組，大便逐漸成型，與DSS組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3.2 芍藥湯對結腸炎小鼠結腸長度的影響

由圖2可見，結腸長度縮短可以作為反映腸道炎癥嚴重程度的一項指標，DSS造模后小鼠結腸長度顯著縮短，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.001）；芍藥湯治療組小鼠與DSS組小鼠比較結腸長度增加，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），結果表明芍藥湯對DSS誘導的結腸炎小鼠結腸縮短有改善作用。

3.3 芍藥湯對結腸炎小鼠結腸組織MPO活性的影響

由圖3可見，DSS組小鼠腸道MPO活性顯著升高，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；而芍藥湯治療組小鼠結腸中MPO活性與DSS組比較則顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），說明芍藥湯可抑制腸道急性炎癥。

3.4 芍藥湯對結腸炎小鼠結腸組織H&E染色病理學評分的影響

由圖4、圖5可見，正常對照組小鼠結腸上皮完整，結構清晰，固有層有少量淋巴細胞，杯狀細胞豐富，腺管結構正常。DSS結腸炎組小鼠結腸上皮大量破損，脫落，杯狀細胞缺失，可見大量炎性細胞浸潤；結腸可見潰瘍，腺管破壞，隱窩膿腫，組織學評分與正常對照組比較，其差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；經(jīng)芍藥湯治療后，小鼠腸道組織學損傷得到顯著緩解，組織學評分與DSS組比較，其差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。

3.5 芍藥湯對結腸炎小鼠結腸組織TNF-α和IL-6的影響

圖4 各組小鼠結腸組織H&E染色（×200）

由圖6可見，與正常對照組比較，DSS組小鼠結腸組織TNF-α和IL-6的含量顯著增高，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。芍藥湯治療后，TNF-α和IL-6的表達降低，與DSS組比較差異有統(tǒng)計學意義。說明芍藥湯能夠有效的抑制結腸炎發(fā)病過程中促炎因子TNF-α和IL-6的分泌，具有一定的抗炎作用。

3.6 芍藥湯對結腸炎小鼠結腸組織Notch-1、Hes-1、Math-1和Muc-2 mRNA表達的影響

由圖7可見，與正常對照組比較，DSS組Notch-1和Hes-1 mRNA表達顯著增強，而Math-1和Muc-2 mRNA表達顯著降低，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；經(jīng)芍藥湯治療后，治療組中Notch-1和Hes-1 mRNA表達顯著降低，而Math-1和Muc-2 mRNA表達則明顯增強，與DSS組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3.7 芍藥湯對結腸炎小鼠結腸組織Notch-1、Hes-1、Math-1和Muc-2蛋白表達的影響

圖5 芍藥湯對結腸炎小鼠結腸組織病理學評分的影響

由圖8、圖9可見，與正常對照組比較，DSS組Notch-1和Hes-1的蛋白表達顯著增強，而Math-1和 Muc-2蛋白表達顯著降低，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；經(jīng)芍藥湯治療后，治療組中Notch-1和Hes-1蛋白表達水平顯著降低，而Math-1和Muc-2蛋白水平表達則明顯增強，與DSS組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖6 芍藥湯對結腸炎小鼠結腸組織TNF-α和IL-6的影響

圖7 芍藥湯對結腸炎小鼠結腸組織Notch-1、Hes-1、Math-1和Muc-2 mRNA表達的影響

圖8 各組小鼠結腸組織Notch-1、Hes-1、Math-1和Muc-2免疫組化結果（×200）

4 討論

圖9 芍藥湯對結腸炎小鼠結腸組織Notch-1、Hes-1、Math-1和Muc-2蛋白表達影響

目前，臨床常用于治療IBD的藥物主要有氨基水楊酸類藥物、糖皮質激素、免疫抑制劑、炎性介質抑制劑和抗生素等[8]，雖然這些藥物可緩解IBD患者的臨床癥狀，但仍存在很多局限性和副作用，不適于長期應用。中醫(yī)藥治療IBD具有較好的優(yōu)勢，其特點是多途徑、多層次、多靶點并且可以長期維持用藥治療，毒副作用較少。因此，進行結腸炎中藥開發(fā)及研究有效驗方的治療機制具有非常重要的意義。IBD屬于中醫(yī)的“腸澼”、“久痢”和“休息痢”等疾病的范疇，病位在大腸，涉及了脾、肝、腎、肺等多個臟腑，其誘因主要是飲食失調(diào)，病機是脾失健運，濕熱蘊結腸腑、氣滯血瘀。因此，在治療上應以清熱燥濕，調(diào)和氣血為主。芍藥湯中黃芩、黃連性味苦寒，入大腸經(jīng)，可清熱燥濕，解毒瀉火，祛除病因，二藥共為君藥；重用白芍養(yǎng)血和營、緩急止痛，當歸養(yǎng)血活血，木香、檳榔行氣導滯，四藥相配，調(diào)氣和血，共為臣藥；大黃苦寒沉降，瀉熱通便，以少量肉桂防苦寒傷中，二藥共為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，與芍藥相配可緩急止痛，為佐使。諸藥合用，清熱燥濕解毒，調(diào)氣和血，下痢可愈，且可到促進腸道潰瘍愈合的作用。臨床和實驗研究均證實芍藥湯對活動期結腸炎具有較好的治療作用，但是其機制尚未明確[9,10]。本研究觀察了芍藥湯對DSS誘導的結腸炎小鼠的保護作用，并從Notch信號通路探討了芍藥湯治療結腸炎的作用機制。我們的研究結果證實芍藥湯能夠有效的抑制DSS誘導的結腸炎小鼠的腸道炎癥反應，并能抑制Notch信號通路中Notch-1和Hes-1的表達，促進Math-1和Muc-2的表達，其治療結腸炎的機制可能與對Notch信號通路的調(diào)控有關。

DSS誘導的實驗性結腸炎是目前最常用的IBD的動物模型，其病理表現(xiàn)與人類的結腸炎非常相似，DSS對結腸黏膜上皮有直接毒性作用并能夠激發(fā)炎癥，臨床癥狀表現(xiàn)主要有明顯的體重減輕、腹痛腹瀉、血便等，結腸組織病理學分析可見廣泛的隱窩和上皮細胞損傷、中性粒細胞和巨噬細胞浸潤、組織水腫等組織學改變[11]。本實驗使用3.5%DSS造模，從造模第3天起，小鼠逐漸出現(xiàn)體重下降，稀水樣便及肉眼血便，DAI評分、MPO指數(shù)、組織病理學觀察和評分及炎癥因子TNF-α和IL-6均較正常組小鼠顯著升高，且可見結腸嚴重縮短。芍藥湯治療能夠顯著增加結腸炎小鼠的體重和結腸的長度，緩解腹瀉和血便等臨床癥狀，并且能夠降低MPO的活性和組織病理學評分，對炎癥因子TNF-α和IL-6均具有較好的抑制作用，表明芍藥湯能緩解結腸炎的癥狀，抑制腸道過度的炎癥反應，進一步證實了芍藥湯對活動期結腸炎具有較好的療效。

腸黏膜屏障功能障礙在IBD的發(fā)病機制中起非常關鍵的作用，結腸上皮黏膜的持續(xù)性損傷是其主要病理改變，而腸道上皮細胞的增殖和分化在結腸上皮黏膜的維護和修復方面發(fā)揮重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路可調(diào)控黏膜上皮細胞的增殖分化程序，對維持腸道未分化隱窩祖細胞的增殖和決定隱窩祖細胞的命運起重要作用[12]。Notch信號通路由Notch受體、Notch配體和DNA結合蛋白組成，可通過促進腸上皮細胞向吸收細胞轉換，減少分泌細胞特別是杯狀細胞的數(shù)量[13]，而在用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號或敲除Notch信號的靶基因Hes-1后，可導致小鼠腸道腸內(nèi)杯狀細胞增加[14]。杯狀細胞作為腸道上皮細胞中的分泌型細胞，其分泌的MUC、腸三葉因子（ITF）和抵抗素樣分子β（RELMβ）等成分構成腸道表面覆蓋的一層保護性黏液屏障，在腸道和上皮之間起著重要的防御作用，可使上皮細胞免受腸道內(nèi)微生物的侵害[15]。杯狀細胞的分化與Hes-1基因和Math1基因的表達關系非常密切，Hes-1是由Notch信號誘導的基本的堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉錄抑制物，而鼠源Math-1蛋白是bHLH轉錄因子，可誘導MUC-2的表達，但受到Hes-1的抑制。本研究結果表明，芍藥湯能夠調(diào)控DSS誘導的結腸炎小鼠模型Notch信號通路，可以抑制Notch-1的過度活化，抑制Notch信號通路靶基因Hes-1的表達，同時促進Math-1蛋白的表達，從而調(diào)節(jié)Hes-1和Math-1之間的平衡，進一步增加MUC-2的表達，進而促進腸道黏膜屏障的再生，發(fā)揮對IBD的治療作用。

綜上所述，本研究結果證實芍藥湯能有效緩解DSS誘導的結腸炎小鼠腸道的炎癥反應，其作用機制可能與Notch信號通路有關。

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Effects of Shaoyao Tang on Notch Signaling Pathway among Experimental Colitis in Mice

Chi Honggang1,Yu Fengyan2,Zhang Yi1,Zou Ying1
(1.Department of Traditional Chinese Medicine,The Second Clinical Medical College,Guangdong Medical University,Dongguan 523808,China;2.Department of Internal Medicine,The Second Clinical Medical College,Guangdong Medical University,Dongguan 523808,China)

This study was aimed to examine the effect of Shaoyao Tang(SYT)on the treatment of dextran sulfate sodium (DSS)-induced experimental colitis in mice via targeting the Notch signaling pathway.The mice were equally and randomly divided into the normal control group(control),model group(DSS),DSS+SYT group(17.8 g·kg-1),n=10.Mice were administered with 3.5%DSS for 7 days for the model establishment.And then,SYT was given to the model group on the second day after the induction of colitis with DSS for 7 days.The effects were studied by the disease activity index (DAI),histological analysis by HE staining,myeloperoxidase(MPO)activity.ELISA was used to measure secretion of tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-6(IL-6)in the colon tissues.The expression of mRNA and protein of Notch-1,Hes-1,Math-1 and Mucin-2(Muc-2)were detected using real-time PCR and immunohistochemistry.The results showed that compared with the model group,SYT attenuated symptoms of colitis by decreasing DAI score, histopathologic score and MPO activity,as well as increasing the colon length.SYT treatment also inhibited the production of IL-6 and TNF-α in colon tissues of mice.Furthermore,SYT significantly blocked the expression of mRNA and protein of Notch-1 and Hes-1,but increased the expression of Math-1 and Muc-2.It was concluded that SYT exerted the anti-inflammatory activity in mice model of DSS-induced colitis by inhibiting the Notch signaling pathway.

Inflammatory bowel disease,Shaoyao Tang,Notch signaling pathway,intestinal mucosal barrier,dextran sul?fate sodium

10.11842/wst.2017.04.024

R285

A

（責任編輯：陳寧，責任譯審：王晶）

2017-02-26

修回日期：2017-03-25

＊國家自然科學基金委青年科學基金項目（81603592）：黃芩湯調(diào)控NLRP6炎癥小體對結腸炎腸道黏液屏障功能保護作用的機制研究，負責人：鄒穎；廣東省中醫(yī)藥局科研項目（20141150）：黃芩湯通過Notch與Wnt/β-catenin通路croostalk多靶點調(diào)控結腸癌發(fā)生發(fā)展的機制，負責人：鄒穎；東莞市社會科技發(fā)展項目（2014108101054）：基于Notch/Wnt信號通路探討黃芩湯干預結腸炎及其癌變的機制研究，負責人:鄒穎。

＊＊通訊作者：鄒穎，副教授，碩士生導師，主要研究方向：中西醫(yī)結合防治消化系統(tǒng)疾病研究。