李文婷，鄒偉，曹琳，張平(南華大學附屬南華醫(yī)院，湖南衡陽421002)

?

miR-145靶向抑制MMP-9表達對大鼠腦動脈血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響

李文婷，鄒偉，曹琳，張平
(南華大學附屬南華醫(yī)院，湖南衡陽421002)

目的 觀察miR-145對大鼠腦動脈血管平滑肌細胞(VSMC)增殖和遷移的影響，并探討其作用機制。方法 利用組織貼塊法分離大鼠腦基底動脈VSMC，將細胞分為3組，對照組轉染空載體；miR-145組轉染miR-145；miR-145+MMP-9組轉染miR-145后再轉染MMP-9。采用qPCR方法檢測各組MMP-9 mRNA表達，Western blotting法檢測MMP-9蛋白表達。向三組細胞中加入50 ng/mL TNF-α刺激細胞增殖，采用CCK8法檢測細胞增殖情況，Transwell小室檢測細胞遷移能力。根據TargetScan和miRanda數據庫預測，野生型MMP-9的3′-UTR區(qū)域含有miR-145靶向結合片段，采用雙熒光素酶報告基因檢測驗證miR-145和MMP-9的靶向關系。結果 miR-145組MMP-9 mRNA和蛋白表達均低于對照組(P均<0.05)，miR-145+MMP-9組MMP-9 mRNA和蛋白表達均高于miR-145組(P均<0.01)。加入TNF-α處理后，miR-145組的細胞增殖OD值低于對照組，miR-145+MMP-9組的細胞增殖OD值高于miR-145組(P均<0.01)；miR-145組細胞遷移數低于對照組，miR-145+MMP-9組細胞遷移數高于miR-145組(P均<0.01)。雙熒光素酶報告檢測結果顯示，miR-145能夠抑制野生型MMP-9的熒光素酶活性(P<0.01)，但不能抑制突變型MMP-9的熒光素酶活性。結論 miR-145能夠通過下調MMP-9抑制TNF-α誘導的大鼠腦動脈VSMC增殖和遷移。

腦梗死；血管平滑肌細胞；微小RNA；miRNA-145；基質金屬蛋白酶9；細胞增殖；細胞遷移

腦梗死的發(fā)病率、病死率和致殘率均很高，嚴重影響人類的身體健康和生活質量[1]。在我國，超過30%的腦梗死是由顱內動脈粥樣硬化性狹窄所致[2]。在動脈粥樣硬化(AS)斑塊形成的不同階段，血管平滑肌細胞(VSMC)的結構和功能都發(fā)生異常改變[3]，其釋放的基質金屬蛋白酶(MMP)是AS斑塊形成和破裂的重要因子[4]。MMP-9作為MMP家族成員，不僅可以充分降解Ⅳ型膠原-細胞基底膜成分，而且能夠促進炎癥反應和VSMC增殖、遷移，導致AS斑塊不穩(wěn)定，從而形成血栓[5]。因此，探討MMP-9在AS中的調節(jié)機制，對預防AS的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。微小RNA(miRNA)是由21～22個核苷酸組成的非編碼小RNA片段，通過與靶蛋白mRNA的3′-UTR結合發(fā)揮負向調控作用，參與細胞增殖、凋亡和分化的過程[6, 7]。腫瘤壞死因子TNF-α能夠通過與受體TNFR結合，激活NF-κB、MAPK和JNK等多條信號通路，來調節(jié)炎癥反應以及細胞增殖和轉移。miR-145作為VSMC中含量最多的miRNA，能夠通過KLF5和CD40及其下游信號因子來調節(jié)血管新生內膜病變形成[8, 9]。2016年6～12月，我們從大鼠腦基底動脈分離VSMC，轉染miR-145和MMP-9，加入TNF-α刺激細胞增殖，觀察細胞增殖和遷移能力的變化；并假設MiR-145靶向作用于MMP-9，對此假設進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠2～3只，體質量150～250 g，購自上海斯萊克實驗動物中心。20%胎牛血清(Bioind公司)，DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)，抗MMP-9抗體和山羊抗兔二抗(Goodhere生物公司)，質粒DNA(上海吉瑪制藥公司合成空載體NC和miR-145 mimics；美國Invitrogen公司合成miR-145 mimics和pcDNA3.1+HA-MMP-9)，脂質體2000(Invitrogen公司)，雙熒光素酶報告檢測試劑盒(Promega生物技術公司)，細胞增殖檢測試劑盒(日本同仁公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，光學顯微鏡(美國Olympus公司)，多功能酶標儀(美國Thermo公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 大鼠腦基底動脈VSMC的分離和原代培養(yǎng) 將大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，并放血處死。迅速取出整腦，解剖顯微鏡下分離大腦基底動脈。將基底動脈剪成0.5 mm×0.5 mm的組織塊，置入細胞培養(yǎng)瓶中，加入含20%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)液，豎直放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3～5 h。待組織塊與瓶底貼附后，將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉平放，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)10 d左右觀察到組織塊周圍的細胞相互融合且融合度達80%，即可進行傳代，取3代后細胞用于進一步實驗。

1.3 細胞分組與處理 將VSMC分為對照組(轉染空載體)、miR-145組(轉染miR-145)、miR-145+MMP-9組(轉染miR-145后再轉染MMP-9)共3組。將細胞接種于24孔板中，待細胞生長融合度達80%時進行轉染。將質粒DNA與脂質體2000以1∶2.5的比例混合后加入到培養(yǎng)板中，6 h后更換為含10%胎牛血清和500 mg/mL G418的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)15 d左右觀察轉染效率，挑出克隆細胞進行鑒定和擴大培養(yǎng)。miR-145+MMP-9組先加入miR-145 mimics，篩選出穩(wěn)定表達miR-145的細胞，再加入pcDNA3.1+HA-MMP-9，挑選共表達miR-145和MMP-9的細胞進行實驗。

1.4 MMP-9 mRNA檢測 采用qPCR方法。取三組細胞，TRIzol法提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。以β-actin為內參基因，設計并合成引物。引物序列：MMP-9上游5′-GATCATTCCTCAGTGCCGGA-3′，下游5′-TTCAGGGCGAGGACCATAGA-3′；β-actin上游5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。qPCR反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。讀取基因擴增的Ct值，采用2-ΔΔCt法計算MMP-9 mRNA的相對表達量。

1.5 MMP-9蛋白檢測 采用Western blotting法。取三組細胞，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白；BCA法測定蛋白濃度；聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，分離膠濃度為10%；將蛋白質濕轉到醋酸纖維素膜上，脫脂牛奶室溫封閉2 h；加入一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜；二抗(辣根過氧化物標記的羊抗兔抗體)室溫下孵育1 h；目的條帶經ECL顯色后在BIO-RAD熒光成像儀檢測分析。Image Lab軟件對蛋白條帶進行半定量分析，以目標蛋白與β-actin的比值表示蛋白的相對表達量。

1.6 細胞增殖能力觀察 采用CCK8法。取三組細胞，加入胰酶消化后制備單細胞懸液，以8×103/孔加入96孔板中。細胞貼壁后，分別加入50 ng/mL TNF-α刺激細胞增殖，培養(yǎng)72 h后加入10 μL CCK8試劑，檢測各孔吸光度值。

1.7 細胞遷移能力觀察 取三組細胞，分別加入50 ng/mL TNF-α培養(yǎng)48 h。取細胞鋪在Transwell小室中，培養(yǎng)液換成不含血清的DMEM培養(yǎng)基，下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)液。細胞在血清的吸引下向下室遷移。48 h后，4%多聚甲醛溶液固定小室下表面的細胞，并進行結晶紫染色，鏡下觀察遷移至小室下表面的細胞，隨機選取5個視野進行計數。

1.8 miR-145對MMP-9的靶向作用觀察 采用雙熒光素酶報告實驗。經過TargetScan和miRanda數據庫預測，野生型MMP-9的3′-UTR區(qū)域含有miR-145靶向結合的片段(圖1)。合成突變型MMP-9 3′-UTR質粒，插入pGL3空載體中。取VSMC接種于24孔板中，將野生型MMP-9 3′-UTR質粒(WT)、突變型MMP-9 3′-UTR質粒(MUT)與miR-145 mimics(WT miR-145組、MUT miR-145組)或空載體(WT對照組、MUT對照組)共轉染。雙熒光素酶報告檢測試劑盒檢測各組熒光素酶的活性。

圖1 野生型MMP-9的3′-UTR區(qū)域含有miR-145靶向結合片段

2 結果

2.1 三組MMP-9 mRNA及蛋白表達比較 對照組、miR-145組、miR-145+MMP-9組MMP-9 mRNA的相對表達量分別為1、0.42±0.23、1.24±0.23，MMP-9蛋白表達量分別為0.89±0.12、0.34±0.13、1.16±0.06。miR-145組MMP-9 mRNA和蛋白表達均低于對照組(P均<0.05)，miR-145+MMP-9組MMP-9 mRNA和蛋白表達均高于miR-145組(P均<0.01)。

2.2 TNF-α處理后三組細胞增殖情況比較 對照組、miR-145組、miR-145+MMP-9組的細胞增殖OD值分別為2.32±0.15、1.84±0.18、2.37±0.11，miR-145組OD值低于對照組，miR-145+MMP-9組OD值高于miR-145組(P均<0.01)。

2.3 TNF-α處理后三組細胞遷移情況比較 對照組、miR-145組、miR-145+MMP-9組的遷移細胞數分別為(102±3)、(36±8)、(110±5)個，miR-145組細胞遷移數低于對照組，miR-145+MMP-9組細胞遷移數高于miR-145組(P均<0.01)。

2.4 miR-145對MMP-9 mRNA的靶向作用結果 WT對照組、WT miR-145組、MUT對照組、MUT miR-145組的熒光素酶相對活性分別為5.24±0.35、2.28±0.19、5.19±0.48、5.16±0.36。WT miR-145組的熒光素酶相對活性低于WT對照組(P<0.01)，MUT miR-145組與MUT對照組比較無統計學差異(P>0.01)。

3 討論

AS是一種炎癥性疾病，其發(fā)生發(fā)展始終伴隨著炎癥反應[10]。miRNA通過轉錄后水平調節(jié)蛋白質的表達從而參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，內皮細胞和平滑肌細胞中miRNA的表達與AS斑塊的形成密切相關[8]。血管內皮細胞的損傷與活化是AS的啟動因素，活化后的內皮細胞分泌血管細胞黏附分子1，促使中性粒細胞滲入內皮細胞層。SPRED1是一種細胞內血管新生信號的抑制子，破壞內皮細胞的完整性[11]。miR-126能夠靶向作用于血管細胞黏附分子1和SPRED1，當miR-126在內皮細胞中表達增高時，血管細胞黏附分子1和SPRED1表達下調，從而調控血管炎癥[12, 13]。VSMC的增生和遷移也是AS斑塊形成的重要因素。在miRNA與VSMC增生關系的研究中發(fā)現，當小鼠頸動脈管壁受損時，miR-221和miR-222表達上調；而在體外和活體小鼠頸動脈低表達miR-221和miR-222時，VSMC的增殖會受到抑制[14]。

研究表明，miR-145是血管壁及其新分離出來的VSMC上含量最為豐富的miRNA。miR-145的表達在血管新生內膜損傷時明顯下降，而體外過表達miR-145會顯著抑制VSMC的增殖和遷移[15]。冠狀動脈疾病患者體內miR-145會發(fā)生顯著變化，其在外周血中的表達水平與梗死灶面積相關，這表明miR-145在AS的研究中是很有價值的標志物，靶向調節(jié)miR-145對AS的治療具有很好的應用前景。Cheng等[16]發(fā)現，miR-145可以作為VSMC的表面標記調節(jié)細胞的表型轉化并參與細胞的功能調節(jié)，同時還通過KLF5、CD40等及下游信號分子參與血管新生內膜的損傷形成。

本研究從大鼠腦基底動脈中分離并鑒定VSMC，首先對該細胞進行miR-145轉染，發(fā)現MMP-9 mRNA和蛋白表達均受到明顯抑制，對穩(wěn)定表達miR-145的VSMC繼續(xù)轉染MMP-9后，細胞中MMP-9 mRNA和蛋白表達升高。向三組細胞加入TNF-α刺激細胞增殖，結果顯示對照組和miR-145+MMP-9組的細胞增殖和細胞遷移均高于對照組。表明miR-145能夠減少VSMC內MMP-9表達，抑制由TNF-α誘導的細胞增殖和細胞遷移，而細胞內MMP-9的高表達又能夠顯著逆轉miR-145的作用。在AS斑塊形成過程中，VSMC釋放的MMP是斑塊形成和破裂的重要因子[4，17]。有研究顯示，脂聯素能夠通過抑制MMP-9表達降低心腦血管的發(fā)生風險[18]。Guo等[19]在對新生內膜異常增生機制研究過程中發(fā)現，TNF-α可通過上調MMP-9表達而促進VSMC的遷移作用。另外，雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，MMP-9 mRNA含有miR-145的作用靶點，miR-145能夠顯著抑制野生型MMP-9(WT)的熒光素酶活性，但不能抑制突變型MMP-9(MUT)的熒光素酶活性。進一步證實了miR-145很可能是通過下調MMP-9來抑制大鼠腦動脈血管平滑肌細胞的增殖和遷移。

綜上所述，miR-145能夠抑制VSMC中的MMP-9 mRNA和蛋白表達，降低TNF-α對VSMC的增殖和遷移誘導增加作用；對穩(wěn)定轉染miR-145的VSMC進行MMP-9轉染后，MMP-9能夠有效逆轉miR-145對于TNF-α誘導的細胞增殖和遷移抑制作用；miR-145很可能是通過下調MMP-9來抑制VSMC的增殖和遷移。另外，miR-145對于靶基因MMP-9的具體調節(jié)機制還不清楚，仍需進一步探索。miR-145對于MMP-9的靶向調節(jié)關系為進一步研究miRNA對動脈粥樣硬化的靶向治療提供新的思路，同時為腦梗死的治療帶來新的希望。

[1] Bonita R, Mendis S, Truelsen T, et al. The global stroke initiative[J]. Lancet Neurol, 2004,3(7):391-393.

[2] Yu F, Lu J, Li Z, et al. Correlation of Plasma Vascular Endothelial Growth Factor and Endostatin Levels with Symptomatic Intra- and Extracranial Atherosclerotic Stenosis in a Chinese Han Population[J]. J Stroke Cerebrovasc Dis, 2017,26(5):1061-1070.

[3] Ross R. Atherosclerosis--an inflammatory disease[J]. N Engl J Med, 1999,340(2):115-126.

[4] Popovic S, Canovic F, Ilic M, et al. Matrix metalloproteinase-9 index as a possible parameter for predicting acute coronary syndrome in diabetics[J]. Vojnosanit Pregl, 2015,72(5):421-426.

[5] Kim HS, Kim HJ, Park KG, et al. Alpha-lipoic acid inhibits matrix metalloproteinase-9 expression by inhibiting NF-kappaB transcriptional activity[J]. Exp Mol Med, 2007,39(1):106-113.

[6] Paul P, Chakraborty A, Sarkar D, et al. Interplay between miRNAs and Human Diseases: A Review[J]. J Cell Physiol, 2017,232(10):617-624.

[7] Gu H, Liu Z, Zhou L. Roles of miR-17-92 Cluster in Cardiovascular Development and Common Diseases[J]. Bio Med Res Int, 2017,2017:9102909.

[8] Hutcheson R, Terry R, Chaplin J, et al. MicroRNA-145 restores contractile vascular smooth muscle phenotype and coronary collateral growth in the metabolic syndrome[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2013,33(4):727-736.

[9] Shimizu C, Kim J, Stepanowsky P, et al. Differential expression of miR-145 in children with Kawasaki disease[J]. PLoS One, 2013,8(3):e58159.

[10] Guo X, Li D, Chen M, et al. miRNA-145 inhibits VSMC proliferation by targeting CD40[J]. Sci Rep, 2016,6:35302.

[11] Harris TA, Yamakuchi M, Kondo M, et al. Ets-1 and Ets-2 regulate the expression of microRNA-126 in endothelial cells[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010,30(10):1990-1997.

[12] Kar S, Bali KK, Baisantry A, et al. Genome-Wide Sequencing Reveals MicroRNAs Downregulated in Cerebral Cavernous Malformations[J]. J Mol Neurosci, 2017,61(2):178-188.

[13] Chu M, Wu R, Qin S, et al. Bone Marrow-Derived MicroRNA-223 Works as an Endocrine Genetic Signal in Vascular Endothelial Cells and Participates in Vascular Injury From Kawasaki Disease[J]. J Am Heart Assoc, 2017,6(2):e004878.

[14] Liu X, Cheng Y, Zhang S, et al. A necessary role of miR-221 and miR-222 in vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia[J]. Circ Res, 2009,104(4):476-487.

[15] Ji R, Cheng Y, Yue J, et al. MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of MicroRNA in vascular neointimal lesion formation[J]. Circ Res, 2007,100(11):1579-1588.

[16] Cheng Y, Liu X, Yang J, et al. MicroRNA-145, a novel smooth muscle cell phenotypic marker and modulator, controls vascular neointimal lesion formation[J]. Circ Res, 2009,105(2):158-166.

[17] Peeters W, Moll FL, Vink A, et al. Collagenase matrix metalloproteinase-8 expressed in atherosclerotic carotid plaques is associated with systemic cardiovascular outcome[J]. Eur Heart J, 2011,32(18):2314-2325.

[18] Ohashi K, Ouchi N, Matsuzawa Y. Anti-inflammatory and anti-atherogenic properties of adiponectin[J]. Biochimie, 2012,94(10):2137-2142.

[19] Guo L, Ning W, Tan Z, et al. Mechanism of matrix metalloproteinase axis-induced neointimal growth[J]. J Mol Cell Cardiol, 2014,66:116-125.

Effects of microRNA-145 on proliferation and migration of rat arterial vascular smooth muscle cells through targeting MMP-9

LIWenting,ZOUWei,CAOLin,ZHANGPing

(NanhuaHospitalAffiliatedtoUniversityofSouthChina,Hengyang421002,China)

Objective To observe the effects of microRNA-145 on proliferation and migration of rat arterial vascular smooth muscle cells (VSMC) and its mechanism.Methods The rat brain basilar arterial VSMC was isolated by tissue patch assay. Then the cells were divided into three groups: the control group (transfection with empty carrier), miR-145 group (transfection with miR-145 mimics), and miR-145+MMP-9 group (transfection with miR-145 mimics and MMP-9). The mRNA and protein expression of MMP-9 was detected by qPCR and Western blotting, respectively. We added 50 ng/mL TNF-α to stimulate the cell proliferation, which was then examined by CCK8 assay. Transwell chamber was used to detect the cell migration ability. TargetScan and miRNAda identified 3′-UTR of MMP-9 mRNA had the target sequence of miR-145 in VSMCs. Luciferase reporter gene was used to validate the correlation between miR-145 and MMP-9.Results The MMP-9 mRNA and protein expression of the miR-145 group was significantly lower than that of the control group (bothP<0.05), while the MMP-9 mRNA and protein expression in miR-145+MMP-9 group was higher than that of the miR-145 group (bothP<0.05). After TNF-α treatment, OD value of the miR-145 group was lower than that of the control group, and OD value in miR-145+MMP-9 group was higher than that of miR-145 group (bothP<0.05). Meanwhile, the miR-145 group had a significantly smaller number of migration cells than the control group, while the migration cells in miR-145+MMP-9 group were more than those of the miR-145 group (bothP<0.01). Luciferase reporter revealed that miR-145 inhibited the relative luciferase activity of wild type MMP-9, but did not inhibit the mutant MMP-9.Conclusion MiR-145 inhibits the proliferation and migration of rat basilar arterial VSMC through down-regulating MMP-9.

cerebral infarction; vascular smooth muscle cell; microRNA; miR-145; matrix metalloproteinase 9; cell proliferation; cell migration

湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研計劃項目(C2016087)。

李文婷(1983-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向為腦血管疾病及神經退行性疾病。E-mail: liwentinghnhy@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.007

R743.3

A

1002-266X(2017)26-0025-04

2017-02-19)