苗杰，韓永強(qiáng)，邸永輝，付琳，李輝(河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)人民醫(yī)院，河北邢臺(tái)054001)

?

食管胃交界部腺癌組織中Cx43、MT1-MMP表達(dá)及意義

苗杰，韓永強(qiáng)，邸永輝，付琳，李輝
(河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)人民醫(yī)院，河北邢臺(tái)054001)

目的 觀察食管胃交界部腺癌組織中縫隙連接蛋白43(Cx43)、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1(MT1-MMP)的表達(dá)，探討其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法 采集108例食管胃交界部腺癌組織(腫瘤組)、30例癌旁正常黏膜組織(正常組)、40例異型增生胃黏膜組織(增生組)。應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)Cx43、MT1-MMP表達(dá)，并分析二者異常表達(dá)與患者臨床病理資料的關(guān)系，采用Pearson相關(guān)分析法分析Cx43與MT1-MMP在食管胃交界部腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 Cx43在正常組、增生組和腫瘤組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為86.7%、52.5%、31.5%，正常組高于增生組和腫瘤組，增生組高于腫瘤組(P均<0.05)；MT1-MMP在正常組、增生組和腫瘤組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為10.0%、27.5%、80.6%，正常組低于增生組和腫瘤組，增生組低于腫瘤組(P均<0.05)。食管胃交界部腺癌患者中，腫瘤組織高/中分化、浸潤(rùn)深度未及漿膜層、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的Cx43陽(yáng)性率高于低/未分化、浸潤(rùn)深度侵及漿膜層、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；腫瘤組織低/未分化、浸潤(rùn)深度侵及漿膜層、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的MT1-MMP陽(yáng)性率高于高/中分化、浸潤(rùn)深度未及漿膜層、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P均<0.05)。Cx43和MT1-MMP在食管胃交界部腺癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.221，P<0.05)。結(jié)論 食管胃交界部腺癌組織中Cx43表達(dá)降低、MT1-MMP表達(dá)升高，二者在食管胃交界部腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

食管胃交界部腺癌；縫隙連接蛋白43；膜型基質(zhì)金屬蛋白酶

食管胃交界部腺癌是指發(fā)生在食管胃交界區(qū)域內(nèi)的腺癌，從解剖學(xué)的角度包括食管遠(yuǎn)端腺癌和胃賁門腺癌。近年來(lái)，全世界范圍內(nèi)食管胃交界部腺癌的發(fā)病比例逐年上升[1]?？p隙連接是細(xì)胞之間普遍存在的一種聯(lián)系方式，參與細(xì)胞間能量和信息的傳遞、電信號(hào)傳導(dǎo)的電偶聯(lián)、細(xì)胞間物質(zhì)交換的代謝偶聯(lián)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、凋亡及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。該通道的主要成分是縫隙連接蛋白(Cx)。Cx43基因被認(rèn)為是非突變型抑癌基因[2]，其表達(dá)異常及其導(dǎo)致的細(xì)胞間隙連接通訊(GJIC)功能改變與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)[3]。膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1(MT1-MMP)是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族中重要的一員，能降解細(xì)胞外基質(zhì)及血管基膜，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和血管形成。作為兩種重要的細(xì)胞間和細(xì)胞間質(zhì)相互作用因子，Cx43與MT1-MMP在惡性腫瘤中表達(dá)的關(guān)系尚無(wú)報(bào)道。本研究通過(guò)觀察Cx43和MT1-MMP在食管胃交界部腺癌組織中的表達(dá)情況，探討其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年1月～2011年12月邢臺(tái)市人民醫(yī)院胃鏡活檢和胃體外科手術(shù)切除標(biāo)本，其中食管胃交界部腺癌標(biāo)本108例(腫瘤組)，癌旁正常黏膜組織30例(正常組)，異型增生的黏膜組織40例(增生組)。腫瘤組男69例、女39例，年齡38～79歲、中位年齡65歲；組織學(xué)高分化57例，低分化51例，浸潤(rùn)深度侵及黏膜層及黏膜下層組49例，侵及肌層、漿膜層組59例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61例。患者術(shù)前均未接受放化療和其他治療。正常組取自腫瘤組癌旁大于2 cm處正常組織。增生組男26例，女14例，年齡28～72歲，中位年齡62歲。三組的性別、年齡具有可比性。

1.2 檢測(cè)方法 采用免疫組化法。將組織標(biāo)本用4%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切4 μm厚切片，脫蠟至水。加入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原修復(fù)，3%去離子過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；分別滴加Cx43兔抗人多克隆抗體(1∶200)和MT1-MMP兔抗人單克隆抗體(1∶200)4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。用已知的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 由兩名高年資病理科醫(yī)師采用雙盲法確認(rèn)。Cx43陽(yáng)性表達(dá)顆粒呈黃色或棕褐色，定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上，根據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行半定量分析判定。在染色均勻的區(qū)域，選取5個(gè)高倍視野(×400)。首先以著色強(qiáng)度評(píng)分，無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，淺棕色為2分，棕色為3分；再按陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分，<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；將兩評(píng)分相加，0～2分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。MT1-MMP陽(yáng)性表達(dá)顆粒呈黃色或棕褐色，先以染色強(qiáng)度評(píng)分，無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再按陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞1～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；將兩評(píng)分相乘，1～2為陰性，≥3為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組Cx43、MT1-MMP陽(yáng)性表達(dá)率比較 Cx43蛋白在正常組、增生組、腫瘤組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為86.7%(26/30)、52.5%(21/40)、31.5%(34/108)，正常組高于增生組和腫瘤組，增生組高于腫瘤組(P均<0.05)。MT1-MMP在正常組、增生組、腫瘤組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為10.0%(3/30)、27.5%(11/40)、80.6%(87/108)，正常組低于增生組和腫瘤組，增生組低于腫瘤組(P均<0.05)。

2.2 不同臨床病理參數(shù)食管胃交界部腺癌患者腫瘤組織中Cx43、MT1-MMP陽(yáng)性率比較 食管胃交界部腺癌患者中，腫瘤組織高/中分化、浸潤(rùn)深度未侵及漿膜層、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的Cx43陽(yáng)性率高于低/未分化、侵及漿膜層、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；腫瘤組織低/未分化、浸潤(rùn)深度侵及漿膜層、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的MT1-MMP陽(yáng)性率高于高/中分化、未侵及漿膜層、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P均<0.05)。不同性別、不同年齡患者的Cx43、MT1-MMP陽(yáng)性率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)患者食管胃交界部腺癌組織中Cx43、MT1-MMP陽(yáng)性率比較

2.3 食管胃交界部腺癌組織中Cx43與MT1-MMP表達(dá)的相關(guān)性 108例食管胃交界部腺癌組織中，Cx43和MT1-MMP均陽(yáng)性23例，均陰性10例，Cx43陽(yáng)性、MT1-MMP陰性11例，Cx43陰性、MT1-MMP陽(yáng)性64例。在腫瘤組織中Cx43與MT1-MMP的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.221，P<0.05)。

3 討論

細(xì)胞通訊是指生物體細(xì)胞與細(xì)胞間以化學(xué)物質(zhì)或電信號(hào)傳導(dǎo)信息的傳導(dǎo)機(jī)制，是維持機(jī)體正常組織結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)[4]。細(xì)胞間的連接有緊密連接、橋粒和縫隙連接等多種結(jié)構(gòu)，其中縫隙連接通道是細(xì)胞間直接進(jìn)行物質(zhì)交流的惟一膜通道結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)為相鄰細(xì)胞膜上連接子的相互連接。一個(gè)連接子由6個(gè)啞鈴型蛋白單體聚合環(huán)繞而成，該蛋白亞單體即為Cx。GJIC允許相對(duì)分子質(zhì)量小于1×103的小分子物質(zhì)通過(guò)，完成細(xì)胞間信息、能量和物質(zhì)交換功能，對(duì)細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、新陳代謝、增殖分化等過(guò)程起著重要的調(diào)控作用。Cx43是Cx基因家族中數(shù)量最多、分布最廣且最為重要的成員，除分化的紅細(xì)胞、骨骼肌及成熟精子細(xì)胞外，在人類幾乎所有的組織和細(xì)胞中都有表達(dá)。它是縫隙連接通道的重要組成部分，其組成的連接子在質(zhì)膜上以成簇形式出現(xiàn)，形成間隙連接斑，在細(xì)胞間信號(hào)傳遞中發(fā)揮著重要作用，其數(shù)量與GJIC的功能密切相關(guān)。Cx43在皮膚疾病、神經(jīng)系統(tǒng)[5]及心血管疾病[6]的生理病理變化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，Cx43基因是一種抑癌基因，可能通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞外環(huán)境旁分泌信號(hào)分子的釋放等途徑，對(duì)絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)起抑制作用。在許多腫瘤中Cx43基因失活，表達(dá)減少或缺失，造成GJIC功能減退，細(xì)胞間信號(hào)傳遞受到影響，造成內(nèi)環(huán)境不穩(wěn)定，為腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化提供了條件[7]。已有報(bào)道，Cx43在前列腺癌[8]、卵巢癌、乳腺癌、甲狀腺癌[9]等多種腫瘤中表達(dá)下降或缺失。本研究顯示，食管胃交界部腺癌組織中Cx43的表達(dá)低于正常黏膜組織，在高/中分化、未侵及漿膜層及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組中的表達(dá)高于低/未分化、侵及漿膜層及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。說(shuō)明Cx43參與了食管胃交界部腺癌的發(fā)生和進(jìn)展，影響其生物學(xué)行為并與其惡性程度相關(guān)。

MMPs是一個(gè)Zn2+依賴的、具有廣泛底物特異性的蛋白水解酶大家族。MT1-MMP是MMPs家族重要成員，它不但可以直接降解Ⅰ型和Ⅱ型膠原、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、玻黏蛋白和蛋白多糖[10]等細(xì)胞外基質(zhì)成分，而且還可以激活MMP-2降解基質(zhì)、促進(jìn)VEGF等多種促血管生長(zhǎng)因子表達(dá)、穿透血管壁和淋巴管壁以及幫助腫瘤細(xì)胞逃避宿主的免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。近年研究發(fā)現(xiàn)，MT1-MMP在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤[11]、頭頸部癌、膀胱癌、乳腺癌[12]等。本研究結(jié)果顯示，MT1-MMP在食管胃交界部腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為80.6%，高于正常食管胃交界部組織，MT1-MMP在低/未分化、侵及漿膜層及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管胃交界部腺癌組織中的表達(dá)高于高/中分化、未侵及漿膜層及淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移組。說(shuō)明MT1-MMP表達(dá)越高，EGJA浸潤(rùn)程度就越深，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性就越大。提示MT1-MMP可能促進(jìn)了食管胃交界部腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

本研究顯示，Cx43與MT1-MMP在食管胃交界部腺癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。提示Cx43和MT1-MMP蛋白可能相互作用，參與了食管胃交界部黏膜上皮細(xì)胞癌變的發(fā)生及發(fā)展。De Bock等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在急性炎癥時(shí)，MMP可以與Cx43的C-末端形成連接，并影響后者的縫隙通道功能。Liew發(fā)現(xiàn)給大鼠靜脈注射TNF-α后，大動(dòng)脈組織內(nèi)MMP-2水平升高并伴隨Cx40的下降。Givvmani等[14]發(fā)現(xiàn)，TIMP-2基因敲除小鼠的心臟壓力負(fù)荷與MMP-9、MT1-MMP水平升高密切相關(guān)，并且導(dǎo)致心內(nèi)膜Cx37和Cx43水平明顯下降，進(jìn)而加重心功能異常。但Cx43與MT1-MMP在腫瘤中的具體相互作用機(jī)制尚有待研究。

綜上所述，Cx43蛋白的低表達(dá)和MT1-MMP的高表達(dá)，均可能參與了食管胃交界部腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，對(duì)它們相互作用機(jī)制的進(jìn)一步深入研究，有望為該腫瘤的治療提供新思路。

[1] 張祥宏.食管胃交界腺癌診斷治療的有關(guān)問(wèn)題[J].中國(guó)腫瘤臨床，2008，35(21)：1201-1205.

[2] Herrero-González S, Gangoso E, Giaume C, et al. Connexin43 inhibits the oncogenic activity of c-Src in C6 glioma cells[J]. Oncogene, 2010,29(42):5712-5723.

[3] 李建玲,蘇震,劉海旺,等.Cx43與Smad1在胃癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué),2014,4(4):19-22.

[4] Jongsma HJ, Wilders R. Gap junctions in cardiovascular disease[J]. Circ Res, 2000,86(12):1193-1197.

[5] Lee GH, Jang B, Choi HS, et al. Upregulation of connexin 43 expression viaC-Jun N-Terminal Kinase Signaling in prion disease[J]. J Alzheimers Dis, 2015,49(4):1005-1019.

[6] Michela P, Velia V, Aldo P, et al. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases[J]. Eur J Pharmacol, 2015(768):71-76.

[7] 吳瑾,周紅鳳,王翠華,等.胃癌中連接蛋白32和43的表達(dá)及細(xì)胞間隙連接通訊功能的研究[J].中華腫瘤雜志,2007,29(10):742-747.

[8] Xu N, Chen HJ, Chen SH, et al. Reduced connexin 43 expression is associated with tumor malignant behaviors and biochemical recurrence-free survival of prostate cance[J]. Oncotarget, 2016,7(41):67476-67484.

[9] Darr EA, Patel AD, Yu G, et al. Reduced Cx43 gap junction plaque expression differentiates thyroid carcinomas from benign disease[J]. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 2011,137(11):1161-1165.

[10] Koshikawa N, Giannelli G, Cirulli V, et al. Role of cell surface metalloprotease MT1-MMP in epithelial cell migration over laminin-5[J]. J Cell Biol, 2000,148(3):615-624.

[11] Takino T, Nakada M, Li Z, et al. Tip60 regulatesMT1-MMPtranscription and invasion of glioblastoma cells through NF-κB pathway[J]. Clin Exp Metastasis, 2016,33(1):45-52.

[12] Linder S. MT1-MMP: Endosomal delivery drives breastcancermetastasis[J]. J Cell Biol, 2015,211(2):215-217.

[13] De Bock M, Wang N, Decrock E, et al. Intracellular cleavage of the Cx43 C-terminal domain by matrix-metalloproteases: a novel contributor to inflammation[J]. Mediators Inflamm, 2015,(2015):257471.

[14] Givvimani S, Kundu S, Narayanan N, et al. TIMP-2 mutant decreases MMP-2 activity and augments pressure overload induced LV dysfunction and heart failure[J]. Arch Physiol Biochem, 2013,119(2):65-74.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.018

R735.2

B

1002-266X(2017)26-0057-03

2017-02-08)