胡曉靜，張貴斌，謝敏杰

可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑TPPU對大鼠局灶腦缺血后血腦屏障的保護(hù)作用

胡曉靜1，張貴斌1，謝敏杰2

目的：研究可溶性表氧化物水解酶抑制劑（sEHi）TPPU對腦缺血/再灌注損傷所致血腦屏障（BBB）破壞的作用。方法：線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血（MCAO）模型；45只大鼠隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組、模型組（制作MCAO模型）、TPPU組（于MCAO術(shù)前24 h、缺血再灌注后0、24及48 h經(jīng)大鼠尾靜脈注射TPPU），各15只。Garcia評(píng)分法評(píng)估神經(jīng)功能缺損及恢復(fù)情況；TTC法檢測大鼠腦梗死體積；干濕重法評(píng)估腦水腫程度；伊文氏藍(lán)（EB）法檢測BBB通透性；免疫熒光染色、western blot等方法檢測BBB相關(guān)蛋白含量的變化。結(jié)果：與模型組比較，TPPU能夠改善大鼠腦梗死后神經(jīng)功能缺損癥狀（P＜0.01），減小腦皮質(zhì)梗死體積，減少EB向腦組織滲漏，減輕血管性腦水腫，減輕MCAO后BBB緊密連接蛋白的丟失（均P＜0.05）。結(jié)論：TPPU能夠保護(hù)MCAO大鼠BBB完整性，減輕腦水腫，減小腦梗死體積，減輕神經(jīng)功能缺損癥狀。

TPPU；血腦屏障；緊密連接蛋白；腦缺血

缺血性腦卒中常伴隨血腦屏障（bloodbrain barrier，BBB）的開放或破壞，進(jìn)一步加重腦組織的損傷[1]。表氧化二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EETs）是一類具有生物活性的內(nèi)源性小分子物質(zhì)[2-4]，具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元、促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元軸突生長、血管平滑肌遷移、抗血管炎癥損傷等作用[5,6]。EETs在體內(nèi)產(chǎn)生后會(huì)迅速被表氧化物水解酶（soluble epoxidehydrolase,sEH）水解為無生物活性的二氫二十碳三烯酸（DHETs）[7]。抑制sEH的功能可間接提高體內(nèi)EETs含量。本實(shí)驗(yàn)通過sEH抑制劑1-三氟甲氧基苯基-3-(1-丙酰基哌啶-4-基)脲（1-trifluoromethoxyphenyl-3-(1-propionylpiperidin-4-yl)urea，TPPU）對腦缺血模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，探討EETs對缺血性腦卒中BBB是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SPF級(jí)SD大鼠45只，雄性，體質(zhì)量（250±10）g，隨機(jī)分為：假手術(shù)組、模型組、TPPU組各15只。

1.1.2 主要試劑 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）、伊文思藍(lán)購自美國sigma公司；兔抗ZO-1多克隆抗體（61-7300）、兔抗Occludin多克隆抗體（71-1500）、小鼠抗Claudin-5（4C3C2）（35-2500）購自美國Invitrogen公司；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、Cy3標(biāo)記驢抗兔IgG、HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗小鼠IgG購自美國Jackson ImmunoResearch公司；小鼠抗β-actin多克隆抗體、BCA蛋白定量試劑盒、western凝膠試劑盒、ECL超敏發(fā)光液購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 模型組及TPPU組采用常規(guī)線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。線栓包被端直徑（0.38±0.02）mm，進(jìn)線深度（20±2）mm；阻斷血流1 h后拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。入組標(biāo)準(zhǔn)：激光多普勒血流儀檢測，進(jìn)栓后血流下降至基線值的10%～20%，拔去線栓后血流恢復(fù)至基線值，且動(dòng)物清醒后Longa評(píng)分1～2分。剔除標(biāo)準(zhǔn)：評(píng)分0分、3分、4分；手術(shù)時(shí)間過長；出血較多；發(fā)生蛛網(wǎng)膜下腔出血。

1.2.2 藥物干預(yù) TPPU組于術(shù)前24 h、缺血再灌注后0、24及48 h經(jīng)大鼠尾靜脈注射TPPU（1.0 mg/kg）。其它2組注射等劑量溶劑。

1.2.3 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 雙人雙盲，于術(shù)前及再灌注后0、24、48及72 h采用Garcia18分制評(píng)分法，進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。

1.2.4 腦梗死體積測定 大鼠再灌注24 h后，采用TTC染色法測定腦梗死體積。各層面梗死面積(S)=(健側(cè)正常面積-患側(cè)正常面積)/健側(cè)正常面積×100%；梗死體積=1/2(S1+S2)+1/2(S2+S3)+…+1/2(Sn-1+Sn)；結(jié)果以百分?jǐn)?shù)表示。

1.2.5 血腦屏障通透性評(píng)估 大鼠再灌注22 h后尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)（Evans blue，EB）（4 mL/kg），循環(huán)2 h后取腦，常規(guī)配制已知濃度梯度EB溶液，測定620 nm處OD值，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過線性回歸方程計(jì)算各樣品EB含量。

1.2.6 腦水腫測定 再灌注48 h后，斷頭取腦，采用干濕重法測定腦含水量（110℃恒溫烤箱內(nèi)烘烤48 h至恒重）；腦組織含水量/%=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.2.7 免疫熒光染色評(píng)估BBB緊密連接蛋白變化 再灌注72 h后取腦，冰凍切片（前囟至前囟后3.0 mm），片厚10μm；ZO-1和occludin一抗稀釋比例為1:200，claudin-5為1:100；二抗稀釋比例均為1:200。熒光顯微鏡觀察，采集缺血半暗帶處圖像，假手術(shù)組采集與MCAO缺血半暗帶相對應(yīng)區(qū)域；所有圖像采集參數(shù)保持一致。

1.2.8 BBB緊密連接蛋白半定量 再灌注72 h后取腦取缺血邊緣區(qū)組織，western blot法測定ZO-1、occludin、claudin-5蛋白含量。蛋白終濃度為5μg/μl；SDS-凝膠電泳，每孔蛋白上樣量約40μg；轉(zhuǎn)膜條件：220 mA恒流，轉(zhuǎn)膜時(shí)間ZO-1及occludin為90 min，claudin-5及β-actin為60 min。室溫封閉2 h后孵育抗體，一抗稀釋比例：claudin-5（1:200）、ZO-1（1:200）、β-actin（1: 1000）、occludin（1:200）；二抗稀釋比例均為1:1000。加ECL化學(xué)發(fā)光液后用ChemiDocXRS+凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行連續(xù)曝光；軟件分析條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TPPU改善MCAO后神經(jīng)功能缺損癥狀

Garcia評(píng)分結(jié)果顯示，模型組大鼠缺血再灌注清醒后評(píng)分顯著低于假手術(shù)組，再灌注24 h評(píng)分進(jìn)一步降低，48 h后評(píng)分開始上升，但仍低于假手術(shù)組（均P＜0.01）；TPPU組各時(shí)間點(diǎn)得分均高于模型組（P＜0.01），見圖1。

圖1 TPPU對MCAO神經(jīng)功能重塑的影響

2.2 TPPU減小MCAO大鼠腦梗死體積

TTC染色結(jié)果顯示，TPPU組大鼠大腦半球和皮質(zhì)腦梗死體積小于模型組（P＜0.05），2組紋狀體梗死體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 TPPU對大鼠腦梗死體積的影響（±s）

表1 TPPU對大鼠腦梗死體積的影響（±s）

注：與模型組比較，①P＜0.05

組別 只數(shù) 皮質(zhì) 紋狀體 半球模型組TPPU組33 30.10±6.15 11.71±1.45①8.91±0.45 8.16±1.10 39.34±6.26 19.86±0.67①

2.3 TPPU改善大鼠腦梗死后繼發(fā)腦水腫

缺血再灌注后，模型組大鼠梗死側(cè)腦組織含水量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），TPPU組腦組織含水量明顯低于模型組（P＜0.05）；假手術(shù)組左右半球及各組健側(cè)腦組織含水量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.4 TPPU減小BBB通透性

缺血再灌注后，模型組大鼠患側(cè)腦組織EB滲漏明顯多于假手術(shù)組（P＜0.05），TPPU組EB滲漏明顯少于模型組（P＜0.05）；假手術(shù)組左右半球及各組健側(cè)EB含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.5 TPPU保護(hù)BBB結(jié)構(gòu)完整

模型組大鼠BBB緊密連接蛋白ZO-1、occludin及claudin-5表達(dá)明顯低于假手術(shù)組（P＜0.01），TPPU組上述蛋白表達(dá)量高于模型組（P＜0.05），見圖2、3，表3。

表2 各組腦組織EB滲漏量及腦含水量（±s）

表2 各組腦組織EB滲漏量及腦含水量（±s）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組TPPU組只數(shù)333 EB含量/(μg/100mg)左腦0.54±0.04 4.73±0.18①1.20±0.32②右腦0.49±0.05 0.62±0.04 0.53±0.05組別假手術(shù)組模型組TPPU組腦含水量/%左腦77.93±0.49 82.76±0.26①80.40±0.58②右腦77.62±0.39 78.38±0.46 77.74±0.25

圖2 血腦屏障緊密連接蛋白的表達(dá)（免疫熒光，×40）

圖3 血腦屏障緊密連接蛋白的表達(dá)（western blot）

表3 血腦屏障緊密連接蛋白的表達(dá)（±s）

表3 血腦屏障緊密連接蛋白的表達(dá)（±s）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組TPPU組只數(shù)333 occludin 1.04±0.07 0.38±0.05①0.75±0.07②ZO-1 1.37±0.05 0.71±0.05①1.15±0.04②claudin-5 2.62±0.13 1.03±0.09①2.13±0.14②

3 討論

急性腦梗死缺血半暗帶帶處存在大量存活的神經(jīng)元細(xì)胞，在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血液供應(yīng)，該處神經(jīng)元可存活下來并恢復(fù)功能[8]。EETs具有擴(kuò)管、抗炎、血管再生等作用，可能成為腦缺血治療潛在靶點(diǎn)。腦缺血后EETs在神經(jīng)血管單元多種細(xì)胞中發(fā)揮作用[9]，但EETs對缺血后BBB是否具有保護(hù)作用尚無研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過抑制EETs的水解酶活性間接提高缺血腦組織中EETs含量，探索其對卒中后BBB的作用。

體內(nèi)EETs來自花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的代謝。缺血、缺氧時(shí)磷脂酶A2激活，使AA從膜磷脂中游離出來[10]。游離的AA是多種二十碳活性物質(zhì)的重要前體，可經(jīng)CYP450表氧化酶途徑代謝為EETs、HETEs等。根據(jù)烯鍵位置不同，EETs存在4種同分異構(gòu)體，即5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET和14,15-EET。EETs在體內(nèi)極不穩(wěn)定，其烯鍵極易被sEH加水水解為二醇而降低活性。外源性加入EETs和（或）應(yīng)用sEH抑制劑常用于EETs相關(guān)研究。sEH抑制劑能通過常規(guī)方式給藥，保證實(shí)驗(yàn)條件一致，常用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

sEH抑制劑是一類脲衍生物，通常其羰基上1位氨基結(jié)合非極性基團(tuán)，3位氨基結(jié)合極性基團(tuán)，電荷分布類似于EETs，能夠與EETs競爭sEH催化位點(diǎn)，抑制sEH對EETs的降解。近來，通過引入構(gòu)象限制結(jié)構(gòu)如哌嗪環(huán)，研究者合成了穩(wěn)定性較好的sEH抑制劑，如APAU、TPPU等。TPPU水溶性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，能夠通過口服給藥或靜脈給藥。TPPU作為底物類似物與EETs競爭sEH結(jié)合位點(diǎn)，抑制sEH活性，減少EETs的降解，間接提高組織EETs含量[11]，發(fā)揮EETs生理效應(yīng)。研究表明，TPPU能降低血管緊張素II依賴性高血壓小鼠的血壓值，減輕非甾體抗炎藥雙氯芬酸鈉誘導(dǎo)的小鼠腸潰瘍，抑制CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化、博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，減輕小鼠急性胰腺炎炎癥反應(yīng)，減輕小鼠心梗后心肌纖維化及心肌重構(gòu)。TPPU對腦缺血所起作用尚無報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TPPU擴(kuò)張MCAO大鼠腦血管，對恢復(fù)缺血半暗帶腦血流和恢復(fù)神經(jīng)功能具有顯著效果；TPPU減少M(fèi)CAO腦梗死體積，其中對減少皮質(zhì)區(qū)梗死體積顯著，而紋狀體梗死體積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與紋狀體缺乏側(cè)枝循環(huán)的代償作用有關(guān)；TPPU對腦梗死血腦屏障完整性具有保護(hù)作用，減少內(nèi)皮細(xì)胞通透性，減輕血管性腦水腫，與EETs擴(kuò)張血管、抗炎、抑制凋亡、促進(jìn)血管增殖等作用一致。TPPU除了通過提高內(nèi)源性EETs含量發(fā)揮腦保護(hù)作用外是否存在其他機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次證明，可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑TPPU有助于保護(hù)MCAO大鼠血腦屏障完整性，減輕腦水腫，減小腦梗死體積，減輕神經(jīng)功能缺損癥狀，發(fā)揮腦缺血神經(jīng)保護(hù)作用。

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（本文編輯：唐穎馨）

The Protective Effects of Soluble Epoxidehydrolase Inhibitor TPPU on Blood Brain Barrier fol-lowing Cerebral Ischemia in Rats

HU Xiao-jing1,ZHANG Gui-bin1,XIE Min-jie2.
1.Department of neurology,Xiangyang No.1 People’s Hospital,Hubei University of Medicine,Hubei 441000,China;2.Department of neurology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China

Objective:To investigate the effect of soluble epoxidehydrolase inhibitor(sEHi)TPPU on blood brain barrier(BBB)function in rats after focal ischemia.Methods:Rat focal cerebral ischemia model was established by transient middle cerebral artery occlusion(MCAO)via intraluminal suture.Forty-five male SD rats were randomly divided into three groups:the sham group,MCAO group and TPPU group(n=15 respectively). Neurologic deficits and behavioral function recovery were assessed by Garcia neurological severity score.The degree of cerebral edema was evaluated by dry/wet weight method.The infarct volume was evaluated by TTC staining.BBB permeability was determined by detecting the leakage of Evens Blue(EB)dye in the brain tissue. Immunofluorescent staining and western blotting were used to observe the content changes of tight junction proteins of BBB.Results:Compared with those in the MCAO group,the treatment of TPPU helped to improve the neurological deficits,decrease the infarct volume of cerebral cortex,reduce the vasogenic brain edema,decrease the leakage of EB in brain tissue and alleviate the loss of tight junction proteins in BBB(P＜0.05).Conclusion: TPPU plays an active role in protecting the BBB integrity,mitigating cerebral edema,decreasing infarct volume and ameliorating the neurological deficit in rats after MCAO.

TPPU;blood-brain barrier;tight junction protein;cerebral ischemia

R741；R741.02；R743

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.04.002

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科湖北 襄陽 441000

2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢 430030

國家自然科學(xué)基金（No.81371312）

2017-05-17

張貴斌zgb1969@126.com