薛一濤劉 鵬焦華琛劉廣志陳 煒

（1.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250000；2.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250000）

·研究報告·

復心湯對心衰大鼠DAG-PKC信號通路的影響*

薛一濤1劉 鵬2焦華琛1劉廣志2陳 煒2

（1.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250000；2.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250000）

目的通過觀察復心合劑對阿霉素誘導的心衰大鼠DAG/PKC信號通路表達的影響，探討DAG/PKC信號通路與心衰的關(guān)系。方法采用阿霉素誘導建立心衰大鼠模型，造模成功后給予復心湯、卡托普利藥物干預4周，比較不同組別大鼠心肌細胞內(nèi)DAG、PKC的表達量。結(jié)果心衰大鼠心肌細胞中DAG、PKC表達量增高；復心湯能夠降低心衰心肌細胞中DAG、PKC表達量。結(jié)論復心湯能夠改善心衰大鼠一般狀態(tài)，抑制心衰心肌細胞中DAG/PKC信號通路的過度表達。

復心湯 DAG PKC 心衰

心力衰竭是指各種病理因素導致各種心臟結(jié)構(gòu)改變或功能障礙，出現(xiàn)心臟充盈及（或）射血功能受損而引起的一組臨床綜合征［1-4］。有研究表明蛋白激酶C（PKC）存在于心臟所有的細胞內(nèi)［5］，當發(fā)生心衰時，不同亞型的PKC表達提高，引起心肌細胞的肥大。臨床已證明復心湯能夠改善患者心衰癥狀［6］。本文旨在通過探討復心湯是否通過影響DAG-PKC信號通路來改善心衰，推進心衰功能障礙機理的研究，開辟治療心衰的一條新路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性Wistar大鼠75只，體質(zhì)量180～220 g。實驗動物購于山東大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：Scxk（魯）20130009。飼養(yǎng)于溫度濕度恒定、人工光照明暗各12 h的清潔級動物飼養(yǎng)室內(nèi)，標準飼料和無菌水自由飲食。

1.2 試藥與儀器 1）藥物：復心合劑（由山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科提供，配制批號：20130509，規(guī)格：250 mL/瓶。組成：制附子30 g，仙靈脾30 g，葶藶子30 g，澤瀉20 g，當歸15 g，黃柏15 g）、鹽酸阿霉素（上海華藍生物科技有限公司；規(guī)格：100mg/瓶；產(chǎn)品批號：25316-40-9）、卡托普利片（中美上海施貴制藥有限公司；規(guī)格：12.5 mg×20片/盒；批準文號：國藥準字H31022986）、0.9%氯化鈉注射液（山東潔晶藥業(yè)有限公司；規(guī)格：500mL/瓶；批準文號：國藥準字H37021260）。2）試劑：TRIZOL RNA試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）、大鼠腦鈉肽（BNP）ELISA檢測試劑盒（上海研吉生物科技有限公司）、2x Taq Master Mix（北京康為世紀生物科技有限公司）、Oligo dT、RNA酶抑制劑、dNTP、M-MLV［均購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司］，RNA抑制劑、Taq酶、5×RT buffer（均購自上海生工生物有限公司），瓊脂糖：美國Promaga公司。其余試劑均由山東省中醫(yī)院中心實驗室提供。3）主要儀器：MP200-I型電子天平（上海第二天平儀器廠），紫外分光光度儀（ND-1000，型號JCS0112，Gene Company，美國），PCR擴增儀 （T-Gradient，Biometra，Germany），凝膠成象分析系統(tǒng) （Alpha 2200，美國），MICROMAX RF型高速低溫離心機（Thermo IEC美國），725型超低溫冰箱 （Thermo Forma美國），ULTRA-TURRAX勻漿機T-25 basic型（德國IKA公司）。SW-CJ-1F型超凈工作臺（蘇州安泰技術(shù)有限公司）。

1.3 分組與造模 1）實驗分組：健康成年Wistar雄性大鼠75只，按隨機數(shù)字表法分為空白組、卡托普利組、模型組、復心合劑低劑量組、復心合劑高劑量組，其中空白組11只，其余各組各16只。2）模型制備：采用腹腔注射阿霉素誘導大鼠心衰的造模方法復制動物模型。模型制備開始前，配置于實驗開始后取Wistar大鼠分別稱質(zhì)量，配制濃度為1 mg/mL的阿霉素溶液備用。實驗組按3mg/（kg·d）的劑量腹膜內(nèi)注射阿霉素溶液，每周1次，共6周，累計總量為18mg/kg。空白組給予腹腔內(nèi)注射與阿霉素等體積的生理鹽水，每周1次，共6周，實驗周期及注射次數(shù)同各實驗組。實驗第6周給藥后隨機選取空白對照組與模型組大鼠各5只，麻醉后取腹主動脈血液，測BNP，進行統(tǒng)計學評價，模型組與空白對照組相比有統(tǒng)計學意義者為造模成功。3）藥物干預：將卡托普利100mg粉碎，過200目篩，溶于160mL生理鹽水中備用。各組于最后一次阿霉素注射24 g后開始灌胃，空白組和模型組每天上午給予同體積比生理鹽水2mL/次灌胃；復心合劑低劑量組每天按4mL/kg劑量給予復心合劑灌胃；復心合劑，高劑量組每天按6mL/kg灌胃給予復心合劑灌胃；卡托普利組給予卡托普利6.25mg/kg的劑量開始灌胃。各組干預4周。

1.4 觀察指標及測定方法 1）大鼠行為體征及死亡情況的觀察：密切觀察大鼠的一般情況，包括進食水量、體質(zhì)量、呼吸、活動情況、精神狀態(tài)、大小便、外觀毛色、爪甲口唇、有無血性分泌物等，同時統(tǒng)計大鼠的死亡情況。2）血漿BNP的測定：藥物干預6周實驗結(jié)束后，各組實驗動物于最后一次給藥禁食12 h后，分別于模型組、對照組隨機取5只大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，剖開腹腔，于腹主動脈取血，放置離心機（3000 r/min）離心15min，測BNP水平，用SPSS17.0進行t檢驗，模型組與對照組相比較有統(tǒng)計學意義為造模成功。3）RT-PCR法檢測心肌細胞中DAG-βmRNA、PKC-αmRNA、PKC-εmRNA表達量。（1）RNA提取與分析：采用TRizol一步法提取組織總RNA，ND-1000分光光度計檢測A260/A280比值，驗證RNA純度和濃度。（2）RTRT反應體系為：采用oligo dT為RT反應引物，總反應體系為60μL，包括4μg的總RNA，5×RT buffer 12μL、RNA酶抑制劑120 U，10mM dNTP 6μL，M-MLV 600U，DEPC水調(diào)總體積至60μL，70℃5min，37℃5min，42℃，1 h，70℃，10min。（3）引物均由上海博尚生物技術(shù)有限公司設計與合成（詳見表1）。（4）PCR擴增：PCR總反應體積25μL，包括2x Taq MasterMix 12.5μL，cDNA 4μL，目的基因上下游引物（10μM）各1μL，補DEPC水至25μL，進行PCR擴增。循環(huán)參數(shù)：94℃預變性5min，94℃1min，58～60℃1 min，72℃1 min，2630個循環(huán)后，72℃延長10min。（5）目的基因表達水平分析：PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，后Alpha凝膠成像分析，計算條帶灰度值反應表達情況。系統(tǒng)分析圖像：以GAPDH為內(nèi)參照，計算各基因與同步GAPDH灰度值的比值作為相對表達量，比值越大，表達水平越高，反之則越低。

表1 引物序列及PCR產(chǎn)物長度

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用完全隨機設計的單因素方差分析（One-Way-ANOVA），組間兩兩比較采用SNK檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 實驗動物一般狀態(tài)觀察 造模過程中，與空白組比較，實驗組大鼠全部出現(xiàn)體質(zhì)量增長緩慢，一般狀態(tài)差，精神萎靡，活動量減少，進食進水量減少，蜷臥，呼吸急促，口周及鼻腔可見少量出血，背毛發(fā)黃，皮毛稀疏，大便稀薄，造模過程中高劑量組死亡1只。6周后藥物干預階段，模型組大鼠一般狀態(tài)進行性下降，死亡3只；復心合劑組與卡托普利組大鼠精神狀態(tài)較模型組改善，低劑量組死亡1只。對死亡大鼠尸體解剖發(fā)現(xiàn)死亡大鼠存在胸腔、腹腔積液，肝脾腫大。

2.2 造模BNP評價 見表2。藥物干預6周后，測定模型組大鼠血漿BNP水平明顯顯著高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表2 兩組大鼠血漿BNP水平比較（±s）

表2 兩組大鼠血漿BNP水平比較（±s）

與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n BNP空白對照組 5333.917±40.97模型組 5827.352±84.17**

2.3 各組大鼠心肌細胞中DAG-β、PKC-α、PKC-εmRNA表達量 見表3和圖1。實驗中未在心肌組織中未檢測到PKC-αmRNA的表達。與空白對照組比較，模型組大鼠心肌細胞中DAG-βmRNA、PKC-ε mRNA表達量明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.01）。與模型組比較，復心合劑高劑量組、卡托普利組、復心合劑低劑量組大鼠心肌細胞中DAG-βmRNA、PKC-εmRNA表達量明顯降低（均P＜0.01）。復心合劑高劑量組與卡托普利組比較，大鼠心肌細胞中DAG-βmRNA、PKC-εmRNA表達量均未見明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；復心合劑高劑量組與低劑量組比較，大鼠心肌細胞中DAG-βmRNA、PKC-εmRNA表達量有顯著差異（P＜0.01）。復心合劑低劑量組大鼠心肌細胞中DAG-βmRNA、PKC-ε mRNA表達量明顯高于卡托普利組（P＜0.01）。

表3 各組大鼠心肌細胞中DAG-β、PKC-ε相對表達量比較（±s）

表3 各組大鼠心肌細胞中DAG-β、PKC-ε相對表達量比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.01；與卡托普利組比較，◇P＜0.01；與復心合劑低劑量組比較，▽P＜0.01。

組 別 n DAG-β相對表達量 PKC-ε相對表達量空白對照組 10 0.357±0.0168*0.549±0.032*模型組 10 0.409±0.035 0.749±0.054復心合劑高劑量組 10 0.358±0.019▽0.535±0.031*▽復心合劑低劑量組 10 0.389±0.015*◇0.614±0.019*◇卡托普利組 10 0.354±0.023*0.520±0.021*

圖1 RT-PCR分析DAG-β、PKC-ε在心衰大鼠心肌中的表達

3 討 論

在心臟所有細胞中都有PKC的存在，在成人心肌中可以檢測到9種PKC異構(gòu)體，在成年大鼠心肌中大約有10種PKC異構(gòu)體表達，其中75%是cPKC。cPKC主要存在于膜、胞漿和核-細胞骨架3部分。在正常成熟鼠心中證實存在ɑ、δ、ε-PKC，ξPKC只存在于非肌細胞中［7］，β-PKC是否存在尚有爭論。與新生鼠比較，成年鼠心中α、δ-PKC表達都有所降低，但ε-PKC無明顯變化。α-PKC存在于膜、胞漿和核-細胞骨架，δ-PKC只存在于核細胞骨架部分。ε-PKC存在于所有3個部分。與正常心肌細胞比較，心衰肌細胞中PKC的活性明顯增加［8］。不同的心衰類型，PKC通路發(fā)生不同的作用，研究顯示在充血性心力衰竭中，分布在膜、核-細胞骨架部分的主要表現(xiàn)為ε、β1和β2-PKC活性明顯增加［9］。在擴張性心肌病和缺血性心肌病引起的導致的心衰中，α、β1和β2-PKC活性提高更明顯 ，ε-PKC未見明顯改變［10］。過去普遍認為ε-PKC被認為參與在心肌缺血預處理過程中具有心肌保護作用的調(diào)節(jié)。然而，最近研究表明ε-PKC還參與了心室增厚與心衰的發(fā)病過程［11-12］。在本次實驗中，空白組及實驗各組中都未檢測到α-PKCmRNA的表達，可能為成年Wister雄性大鼠心肌組織中無α-PKC。模型組與空白組比較，大鼠心衰癥狀較重，心肌細胞中DAG-βmRNA、PKC-εmRNA表達量顯著增高，表明在心肌細胞衰亡過程DAG/PKC信號通路過度激活，與眾多學者研究結(jié)果相符。

在心衰與肥大心肌細胞中PKC過度表達，激活轉(zhuǎn)錄基因，細胞內(nèi)蛋白合成量都增加［13］，但在肥大心肌細胞中以收縮蛋白為主［14］，在發(fā)生衰竭的心肌細胞中合成的蛋白以結(jié)構(gòu)蛋白為主［15］。本實驗中筆者觀察到：模型組大鼠心肌組織中DAG-βmRNA、PKC-εmRNA表達量明顯高于其余各組（P＜0.01），說明在心肌細胞發(fā)生衰亡的過程中DAG/PKC信號通路處于過度激活狀態(tài)。復心湯高低劑量組與卡托普利組大鼠心肌細胞中DAG-βmRNA、PKC-εmRNA表達量較模型組有明顯減低（均P＜0.01），表明復心湯及卡托普利能夠抑制心衰細胞中DAG/PKC信號通路的表達，來發(fā)揮抗心力衰竭的作用，其中高劑量組與低劑量組在抑制該通路表達方面差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示在一定劑量范圍內(nèi)，復心合劑在抑制DAG-PKC信號通路的表達方面呈現(xiàn)劑量依賴性，劑量越高療效越好。復心合劑高劑量組與卡托普利組在抑制PKC表達方面未見明顯差異（P＞0.05），前期已有學者研究發(fā)現(xiàn)ACEI能夠降低PKC-ε表達，提示復心合劑高劑量在改善心衰，抑制心室肥厚，改善心衰心室重構(gòu)的某些方面與卡托普利具有等同效果。

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E ffect of Fuxin Decoction on DAG-PKC Signaling Pathway in Rats w ith Heart Failure

XUE Yitao，LIUPeng，JIAOHuachen，etal. Affiliated Hospitalof Shandong University of TraditionalChineseMedicine，Shandong，Jinan 250000，China.

Objective：To investigate the relationship between DAG/PKC signaling pathway and heart failure by observing the effectof Fuxin Decoction on the expression ofDAG/PKC signaling pathway in ratswith Adriamycin induced heart failure.M ethods：Themodel of rats with heart failure was induced by Adriamycin.After successful modeling，the ratswere treated with Fuxin Decoction and captopril for4 weeks.The expressions of DAG and PKC in themyocardial cells of differentgroupswere compared.Results：The expression of DAG and PKC in cardiacmyocytes increased in heart failure rats.Fuxin Decoction could reduce the expression of DAG and PKC in heart failure heartmuscle cells.Conclusion：Fuxin Decoction can improve the general state of ratswith heart failure and inhibit the overexpression ofDAG/PKC signaling pathway in heart failure cells.

Fuxin Decoction；DAG；PKC；Heart failure

R285.5

A

1004-745X（2017）07-1141-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.004

2017-04-11）

國家自然科學基金 （81273703）