錢 康范永升

（1.浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州第一醫(yī)院，浙江 杭州 310000；2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州310000）

·研究報告·

清肺方對類風濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺炎模型大鼠的TGF-β1作用的實驗研究*

錢 康1范永升2△

（1.浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州第一醫(yī)院，浙江 杭州 310000；2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州310000）

目的通過博來霉素誘導建立類風濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺炎大鼠模型，探討清肺方對間質(zhì)性肺炎大鼠的作用及其對TGF-β1的作用。方法清潔級SD大鼠48只，雄性，體質(zhì)量為160～180 g，適應性飼養(yǎng)1周后，通過氣管內(nèi)灌注3mg/mL博來霉素誘導建立大鼠間質(zhì)性肺炎動物模型，分為清肺方組，間質(zhì)性肺炎模型組，正常對照組，強的松組4組，各12只。用藥28 d后，對比清肺方組與間質(zhì)性肺炎模型組、強的松組、正常對照組之間的肺組織染色及纖維化評分，肺組織染色測量膠原面積，堿水解法檢測肺組織含量，檢測血清及肺組織TGF-β1。結(jié)果1）清肺方組大鼠肺組織纖維化程度、羥脯氨酸濃度均顯著低于間質(zhì)性肺炎模型組（P＜0.01）。2）清肺方組大鼠血清TGF-β1濃度低于間質(zhì)型肺炎模型組（P＜0.01）。3）清肺方組大鼠肺組織勻漿TGF-β1濃度低于間質(zhì)性肺炎模型組（P＜0.01）。結(jié)論1）清肺方對博來霉素誘導的大鼠間質(zhì)性肺炎、肺纖維化有抑制作用。2）清肺方對博來霉素誘導的大鼠間質(zhì)性肺炎的抑制作用機制可能與TGF-β1有關(guān)。

清肺方 類風濕關(guān)節(jié)炎 間質(zhì)性肺炎 轉(zhuǎn)化生長因子β1

間質(zhì)性肺炎是類風濕性關(guān)節(jié)炎并發(fā)癥，增加了類風濕性關(guān)節(jié)炎6%的死亡率［1］。其臨床表現(xiàn)主要為進行性呼吸困難和刺激性干咳，預后不良，診斷后的中位生存時間為3～5年。大部分患者因肺纖維化導致肺動脈高壓、呼吸困難、肺源性心臟病和右心衰竭死亡。目前還缺乏特異有效的治療手段。糖皮質(zhì)激素仍作為首選藥物廣泛用于臨床，但其療效不確切，且副作用大。因此研究治療具有非常重要的意義。

在探索類風濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺疾病治療的實驗研究中，合適的動物模型是成功的重要條件。研究表明，類風濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺疾病最常見的病理類型是普通型間質(zhì)性肺炎（UIP）［2-3］。在實驗造模中常參考肺間質(zhì)纖維化的動物模型。筆者在前期實驗研究中研究了多種建立間質(zhì)性肺炎動物模型的方法，并使用氣管內(nèi)灌注博來霉素成功建立間質(zhì)性肺炎動物模型。本實驗研究清肺方對博來霉素誘導的大鼠間質(zhì)性肺炎的作用，并初步探討其可能的作用機制，為臨床治療提供新的角度和思路?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠48只，雄性，體質(zhì)量160～180 g。實驗動物許可證號SYXK（浙）2016-0115。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度24～26℃，濕度50%～60%，24 h循環(huán)光照，每個標準飼籠6只，大鼠自由進食飲水，飼料均為普通清潔飼料。

1.2 試藥與儀器

1）試藥：鹽酸博來霉素 （日本化藥株式會社，H20090885）、強的松（西安利君沙制藥股份有限公司生產(chǎn)，090302）、清肺方（組成為太子參、麥冬、沙參、冬瓜子、桃仁、莪術(shù)、山慈菇、浙貝母、僵蠶、石見穿、蘆根、蒲公英，浙江中醫(yī)藥大學藥劑室提供）、羥脯氨酸測試盒 （南京建成生物工程研究所）、Masson染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）、10%水合氯醛（浙江中醫(yī)藥大學校附屬醫(yī)院提供，浙藥制字H020100240）、大鼠TGF-β1ELISA試劑盒（Ebioscience公司）。2）儀器：血生化儀器 （日立7020全自動生化分析儀，05007905）、冰凍切片機（德國Leica公司，CM 1850）、全自動干燥箱 （杭州藍天公司，DHG-9640C）、數(shù)顯恒溫水浴鍋，（常州澳華儀器有限公司，HH-2）、臺式高速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司，TG-16W）、低溫高速離心機（日本日立公司，CR21 G II）、旋渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司，QL-901）、超低溫冰箱（北京天地精儀科技有限公司，T11-86-340-LA）、超薄切片機（瑞典BROMMA公司LKB-V）、激光共聚焦熒光顯微鏡（日本Olmpus公司）、電子天平（上海梅特勒一一托利多儀器有限公司，PL203）、高壓蒸汽滅菌鍋（常州諾基儀器有限公司，YXQ-LS-75G）。

1.3 造模及分組

1）造模 腹腔注射10%水合氯醛0.35mL/100 g體質(zhì)量麻醉大鼠，氣管插管后，向套管針內(nèi)注射3 mg/mL的博萊霉素溶液，劑量為3mg/kg體質(zhì)量，即1mL/100 g體質(zhì)量，正常對照組氣管內(nèi)灌注1mL/100 g體質(zhì)量生理鹽水，注射后立即將大鼠直立并旋轉(zhuǎn)，使藥物能夠均勻地分布于大鼠的肺內(nèi)。大鼠清醒后隨意進食。2）分組適應性飼養(yǎng)1周后，將大鼠按照隨機數(shù)字表法抽出12只為正常對照組，其余大鼠用博萊霉素造模后，按照隨機數(shù)字表法，將動物隨機分為間質(zhì)性肺炎模型組、強的松組、清肺方組，每組各12只。經(jīng)單因素標準差檢驗分析，各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義。

1.4 干預方法

造模24 h后開始灌胃給藥，每日1次。成人每日中濃度清肺方用量為生藥208 g，人體質(zhì)量按60 kg計算，大鼠劑量按照成人劑量的6倍計算，大鼠的等效劑量為每日20.8 g/kg。按照大鼠每日灌胃1mL/100 g的體積計算，清肺方中藥濃度為2.08 g/L，故將208 g生藥煎煮2次，混合濃縮至100mL。強的松組中強的松經(jīng)生理鹽水溶解后依照6mg/kg的劑量1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃，每日1次。間質(zhì)性肺炎模型組及正常對照組分別予1mL/100 g體質(zhì)量生理鹽水灌胃，每日1次。連續(xù)灌胃給藥28 d。

1.5 取材及病理標本制作

造模后連續(xù)灌胃給藥28 d，末次給藥后禁食不禁水。末次給藥后24 h，采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，劑量為0.35mL/100 g體質(zhì)量。麻醉后，大鼠心尖部取血，離心分離血清，置于 -80℃冰箱保存，以備后續(xù)檢測。取出并完整分離出雙肺，生理鹽水沖洗后，右肺置于-80℃冰箱保存，以備后續(xù)檢測；左肺用10%福爾馬林固定后，準備病理切片染色。

1.6 觀察項目

1.7 統(tǒng)計學處理

應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。檢驗數(shù)據(jù)正態(tài)性，符合正態(tài)分布，計量資料以（±s）表示。組間比較用單因素的方差分析（One-way ANOVA）。方差齊時用LSD-t檢驗組間兩兩比較分析，方差不齊時用Dunnett′s T3檢驗比較分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組肺組織病理染色比較

2.1.1 HE染色 見圖1。正常對照組大鼠肺組織病理HE染色可見肺泡結(jié)構(gòu)清晰完好，肺泡間隔細且均勻，無明顯炎性細胞浸潤、充血及水腫。間質(zhì)性肺炎模型組大鼠組織病理HE染色可見明顯淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞及巨噬細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔明顯增寬增粗，肺間質(zhì)纖維化明顯，可見實變病灶，局部有充血。清肺方組及強的松組大鼠肺組織病理HE染色均可見肺泡間隔增粗，少量炎性細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺組織輕度纖維化，無實變病灶。說明清肺方及強的松均能抑制大鼠肺間質(zhì)纖維化。

圖1 各組肺組織HE染色比較（HE染色，400倍）

2.1.2 Masson染色 見圖2。光鏡下可見正常對照組大鼠肺組織病理Masson染色未見肺組織纖維化，肺泡間隔無明顯增寬，肺泡結(jié)構(gòu)尚正常。間質(zhì)性肺炎模型組大鼠肺組織病理Masson染色可見肺組織膠原纖維明顯增多，肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞甚至消失。清肺方組及強的松組肺組織病理Masson染色可見肺組織膠原纖維較正常對照組增多，肺泡間隔增粗，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞?？梢娗宸畏郊皬姷乃删芤种撇﹣砻顾卣T導的大鼠肺間質(zhì)纖維化。

圖2 各組肺組織Masson染色比較（Masson染色，400倍）

2.2 各組肺組織羥脯氨酸含量比較

見表1。與正常對照組比較，各模型組大鼠肺組織羥脯氨酸含量明顯升高，且差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與間質(zhì)性肺炎模型組相比，清肺方組、強的松組大鼠肺組織羥脯氨酸含量明顯降低，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。清肺方組與強的松組大鼠肺組織羥脯氨酸含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明清肺方及強的松均能抑制博來霉素誘導的大鼠間質(zhì)性肺纖維化。

表1 各組大鼠肺組織羥脯氨酸含量、血清及肺組織TGF-β1濃度比較（±s）

表1 各組大鼠肺組織羥脯氨酸含量、血清及肺組織TGF-β1濃度比較（±s）

與間質(zhì)性肺炎模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別 n 羥脯氨酸含量（μg/mg）血清TGF-β1濃度（pg/mL）肺組織TGF-β1濃度（pg/mL）正常對照組 8 29874.679±5871.298**間質(zhì)性肺炎模型組 8 68532.547±7954.322△△強的松組 8 47987.633±9856.567*△△0.196±0.034**16731.605±7321.278**0.578±0.049△△80822.431±8279.551△△0.407±0.057**△△53180.451±9897.463**△△清肺方組 8 48036.524±8766.597**△0.419±0.036**△△54597.823±9832.716**△△

2.3 各組TGF-β1濃度比較

見表1。1）血清TGF-β1濃度比較：與正常對照組比較，清肺方組、強的松組大鼠血清TGF-β1濃度明顯升高，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與間質(zhì)性肺炎模型組比較，清肺方組、強的松組大鼠血清TGF-β1濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。清肺方組與強的松組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明清肺方及強的松均能抑制博來霉素誘導的間質(zhì)性肺炎大鼠的血清TGF-β1，其抑制大鼠肺纖維化的作用機制與血清TGF-β1有關(guān)。2）肺組織TGF-β1濃度比較：與正常對照組比較，清肺方組、強的松組大鼠肺組織勻漿TGF-β1濃度明顯升高，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與間質(zhì)性肺炎模型組比較，清肺方組、強的松組TGF-β1濃度均明顯降低，且差異有統(tǒng)計學意義 （P<0.01）。清肺方組與強的松組之間肺組織勻漿TGF-β1濃度差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）?？梢娗宸畏郊皬姷乃删芤种撇﹣砻顾卣T導的間質(zhì)性肺炎大鼠的肺組織TGF-β1，其抑制大鼠肺纖維化的作用機制與肺組織TGF-β1有關(guān)。

3 討 論

類風濕關(guān)節(jié)炎并發(fā)間質(zhì)性肺炎的發(fā)病機制尚不明確，可能與類風濕關(guān)節(jié)炎患者的免疫異常有關(guān)。美國胸科協(xié)會推薦肺纖維化的治療方案是糖皮質(zhì)激素加免疫抑制劑。但長期大量應用激素伴有顯著、不可逆的毒性作用，包括高血糖、骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮、血管缺血性壞死、誘發(fā)和加重感染和胃腸道勃膜損傷等。同時，激素治療仍缺乏循證醫(yī)學證據(jù)，也有研究者認為，單獨應用激素既不能改善病程，也不能提高生存率。當代多數(shù)醫(yī)家認為，類風濕關(guān)節(jié)炎合并間質(zhì)性肺炎可以歸為中醫(yī)“肺痹”“肺痿”的范疇［4］。清肺方是根據(jù)陳湘君教授在臨床治療風濕病并發(fā)間質(zhì)性肺炎的經(jīng)驗中總結(jié)出的方劑，以“培土生金”為主要治法，太子參歸脾、肺經(jīng)，以太子參為君藥，益氣健脾，生津潤肺；麥冬歸心、脾、肺經(jīng)，養(yǎng)陰潤肺，益胃生津；沙參歸肺、胃經(jīng)，養(yǎng)陰清肺，益胃生津；冬瓜子歸肝經(jīng)，潤肺化痰，消癰利水；三者共為臣藥，補益肺胃，養(yǎng)陰生津。桃仁歸心、肝、大腸經(jīng)，活血祛瘀，止咳平喘；莪術(shù)入肝、脾經(jīng)，破血行氣，消積止痛；山慈菇歸肝、脾經(jīng)，清熱解毒，化痰散結(jié)；浙貝母歸肺、心經(jīng)，清熱散結(jié)，化痰止咳；僵蠶歸肝、肺、胃經(jīng)，息風止痙，祛風止痛，化痰散結(jié)；諸藥合用化痰散結(jié)，活血祛瘀。石見穿歸肝經(jīng)，活血化瘀；清熱利濕；散結(jié)消腫；蘆根歸肺經(jīng)、胃經(jīng)，清熱生津，除煩止嘔，利尿；蒲公英入肝、胃經(jīng)，清熱解毒，利尿散結(jié)；三藥共用清熱解毒，利水消腫。全方共奏益氣養(yǎng)陰、活血祛瘀、化痰散結(jié)之效。正切類風濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺疾病氣陰兩虛，痰瘀互結(jié)之病機。在臨床研究中，風濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺疾病患者應用清肺方治療后，臨床癥狀及肺部CT表現(xiàn)明顯改善，治療效果顯著?，F(xiàn)代藥理研究證明，太子參［5］、北沙參［6］、麥冬［7］、冬瓜子［8］、桃仁［9］等均具有一些明顯的抗氧化作用的成分，抑制肺纖維化的形成。

氣管內(nèi)插管灌注博來霉素是建立間質(zhì)性肺炎動物模型公認的造模方法［10］。輕脯氨酸是膠原纖維中的特有成分，它能直接反應組織膠原纖維的含量變化情況，可作為衡量其膠原組織代謝的重要指標。本實驗中清肺方組大鼠肺組織病理結(jié)果明顯輕于間質(zhì)性肺炎模型組，且清肺方組大鼠肺組織羥脯氨酸含量低于間質(zhì)性肺炎模型組，說明清肺方可抑制大鼠肺組織纖維化。

TGF-β1是具有廣泛功能的細胞因子，能誘導肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)換，合成細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白如膠原、糖蛋白、纖維結(jié)合素產(chǎn)生，調(diào)節(jié)炎癥反應及免疫功能，在肺纖維化發(fā)生發(fā)展發(fā)揮了重要作用［11］。同時，TGF-β1和氧化損傷、炎癥因子密切相關(guān)［12］。一項研究報道［13］，TGF-β1可刺激上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞（EMT），從而促進纖維化發(fā)展。而且，在TGF-β1等細胞因子的刺激下，成纖維細胞分化形成肌成纖維母細胞 （myofibroblast），不僅僅使產(chǎn)生膠原的能力大大提高，合成大量膠原蛋白，而且具有收縮性，造成ECM調(diào)節(jié)失衡［14］，使肺組織結(jié)構(gòu)破壞［15］。因此抑制TGF-β1可以抑制肺纖維化的形成及發(fā)展［16］。在實驗中，清肺方組血清及肺組織TGF-β1濃度低于間質(zhì)性肺炎模型組，說明清肺方對博來霉素誘導的大鼠間質(zhì)性肺炎的作用機制與血清及肺組織TGF-β1濃度有關(guān)。

［1］ Bonbartz T，Nannini C，Medina-Velasquez YF，et al.Incidence and mortality of interstitial lung disease in rheumatoid arthritis：a population-based study［J］.Arthritis Rheum，2010（62）：1583-1591.

［2］ Lee H，Kim DS，Yoo B，et al.Histopathologic pattern and Clinical featuresof rheumatoid arthritis-associated interstitial lung disease［J］.Chest，2005（127）：2019-2027.

［3］ Tanaka N，Kim JS，Newell JD，etal.Rheumatoid arthritis-related lung diseases：CT findings［J］.Radiology，2004（232）：81-91.

［4］ 崔紅生，邱冬梅，武維屏.肺間質(zhì)纖維化從絡(luò)病辨治思路［N］.中國中醫(yī)藥報，2004-06-03.

［5］ 余國奠，劉峻，陳喻，等.6個不同產(chǎn)地的太子參對超氧自由基清除作用的研究［J］.中國野生植物資源，2000，19（4）：7-9，19.

［6］ Ng TB，Liu F，Wang HX.The antioxidant effects of aqueous and organic extract of panaxquin quefolium，panaxnotogiseng，codonopsis pilosula，pseudostellaria heterophylla and glehnia littoralis［J］.JEthno，2004，93（2）：285-288.

［7］ 袁春麗，孫立，袁勝濤，等.麥冬有效成分的藥理活性及作用機制研究進展［J］.中國新藥雜志，2013，22（21）：2496-2502.

［8］ 周清，江浩，高云濤，等.冬瓜籽水提物抗氧化作用研究［J］.微量元素與健康研究，2010，27（5）：22-23.

［9］ 王亮.桃仁多糖對OH及O2－的清除研究［J］.大連民族學院學報，2009，11（1）：96.

［10］Teixeira KC，Soares FS，Rocha LCD，et al.Attenuation of bleomycin-induced lung injury and oxidative stress by N-acetylcysteine plus deferoxamine［J］.Pulm Pharmacol Ther，2008，21（2）：309-316.

［11］Scotton CJ，Chambers RC.Molecular targets in pulmonary fibrosis：themyofibroblast in focus［J］.Chest，2007，132（4）：1311-21.

［12］振娟，朱楷，王學彬，等.類風濕關(guān)節(jié)炎合并間質(zhì)性肺炎的臨床分析［J］.青島醫(yī)藥衛(wèi)生，2014，46（5）：347-349.

［13］Camara J，JaraiG.Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha［J］.Fibrogenesis Tissue Repair，2010，3（1）：2.

［14］楊雅茹，黃艷，李俊.TGF-β1介導的Smads與ERK通路在肺纖維化中的作用及相互關(guān)系［J］.中國藥理學通報，2010，25（5）：561-563.

［15］Phan SH.Biology of fibroblasts and myofibroblasts［J］.Proc Am Thorac Soc，2008，5（3）：334-337.

［16］Aytemur ZA，Hacievliyagil SS，IRAZM，et al.Effects of iloproston bleomycin-induceol pulmonary fibrosis in rats compaied withmethy-prednisolome［J］.Rev Port Preumol，2012，18（6）：272-277.

Experimental Study on the Effect of Qingfei Decoction on TGF-β1in Ratsw ith Rheumatoid Arthritis Associated Interstitial Pneumonia

QIAN Kang，F(xiàn)AN Yongsheng.Hangzhou First People′s Hospital Affiliated toZhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310000，China.

Objective：To establish a ratmodel of rheumatoid arthritis associated interstitial pneumonia induced by bleomycin，and to explore the effect of Qingfei Decoction on interstitial pneumonia and its effect on TGF-β1.M ethods：48 male SD rats，weight 160～180 g，were fed adaptively for one week and the ratmodel of interstitial lung diseasewere established bymeans of pour 3mg/kg BLM into trachea and divided into 4 groups：Qingfei Decoction group，the interstitial pneumoniamodel group，the normal control group and predmisone group，12 in each. After 28 days′medication，lung tissue staining and fibrosis scores were compared among all groups.The area of collagen wasmeasured by lung staining，and the content of lung tissue was detected by alkaline hydrolysis.TGF-β1 in serum and lung tissues were detected.Results：1）The degree of fibrosis and hydroxyproline concentration in lung tissue in Qingfei Decoction group were obviously lower than those of the interstitial pneumonia model group（P<0.01）.2）Concentration of serum TGF-beta1 in Qingfei Decoction group was lower than that of the interstitial pneumoniamodel group（P<0.01）.3）Concentration of TGF-beta 1 of Lung homogenate in Qingfei Decoction group was lower than the interstitial pneumoniamodel group（P<0.01）.Conclusion：1）Qingfei Decoction has an inhibitory effect on bleomycin induced interstitial pneumonia and pulmonary fibrosis in rats.2）The treatmentmechanism of QingfeiDecoction to BLM-ILDmay be related to TGF-beta1.

QingfeiDecoction；Rheumatoid Arthritis；Interstitial lung Disease；TGF-β1

R285.5

A

1004-745X（2017）07-1163-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.010

2017-05-05）

浙江省杭州市衛(wèi)生科技計劃項目（2017A02）

△通信作者（電子郵箱：fyszjtcm@163.com）