徐 陽(yáng), 龔榜初, 吳開(kāi)云, 江錫兵, 劉同祥, 湯 丹, 孫維敏, 馬 攀， 滕國(guó)新

(1. 中國(guó)林科院 亞熱帶林業(yè)研究所 浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 杭州 311400； 2. 浙江省蘭溪市苗圃， 金華 321100)

甜柿幼胚搶救體系優(yōu)化研究

徐 陽(yáng)1, 龔榜初1, 吳開(kāi)云1, 江錫兵1, 劉同祥1, 湯 丹1, 孫維敏1, 馬 攀1， 滕國(guó)新2

(1. 中國(guó)林科院 亞熱帶林業(yè)研究所 浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 杭州 311400； 2. 浙江省蘭溪市苗圃， 金華 321100)

柿雜種敗育現(xiàn)象嚴(yán)重阻礙了甜柿雜交育種進(jìn)展，幼胚搶救技術(shù)可有效地克服這個(gè)障礙。以甜柿富有、晚御所、太秋的幼胚為材料，開(kāi)展培養(yǎng)基、柿品種、取胚時(shí)間4因素3水平正交試驗(yàn)。并在此基礎(chǔ)上，以太秋幼胚為材料，開(kāi)展了取胚時(shí)間、培養(yǎng)基成分的單因素試驗(yàn)。結(jié)果表明：1)影響柿幼胚搶救的因素影響依次為培養(yǎng)基、取胚時(shí)間、柿品種、培養(yǎng)條件；2)花后45～55 d取胚搶救，胚苗成苗率極低，此后，隨著胚齡增大，胚培苗成活率逐漸提高，但花后77 d取胚時(shí)，胚苗成苗率略有回落，因此長(zhǎng)三角地區(qū)柿幼胚搶救的最適取胚時(shí)間為：花后62～69 d；3)胚苗在不同培養(yǎng)基中的發(fā)育狀態(tài)、成苗率、苗高、生根數(shù)上均出現(xiàn)差異，1/2MS+ZT(0.4 mg/L)+ IBA(0.2 mg/L)+活性炭(3 g/ L)+蔗糖(70 g/ L)培養(yǎng)基中培苗發(fā)育良好，培養(yǎng)45 d后，成苗率為0.88，平均苗高為3.52 cm，平均生根數(shù)為2.52。

甜柿；幼胚搶救；取胚時(shí)間；培養(yǎng)基

甜柿(DiospyroskakiThunb)風(fēng)味好，具有良好的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益，一年種植多年受益，是山區(qū)脫貧致富的重要樹(shù)種[1]。自20世紀(jì)80年代以來(lái), 多家科研單位系統(tǒng)地開(kāi)展了甜柿引種[2-3]、高效栽培[4]、砧木選育[5-8]、雜交育種[9-10]、示范推廣[11]等工作。目前甜柿在中國(guó)20多個(gè)省市有栽培，面積15萬(wàn)～20萬(wàn)畝，每年不斷擴(kuò)大，其中長(zhǎng)三角地區(qū)是甜柿發(fā)展最有活力的地區(qū)之一[1, 12]。

柿新品種培育對(duì)柿未來(lái)發(fā)展至關(guān)重要，目前雜交育種是甜柿最重要的育種手段[12]，但柿為多倍體，柿種發(fā)育存在中途敗育現(xiàn)象[13-14]，且在優(yōu)良雜交組合中表現(xiàn)更為嚴(yán)重；同時(shí)個(gè)別品種在種胚未成熟前存在生理落果現(xiàn)象[15]。采用常規(guī)播種時(shí)，這些種胚發(fā)育不全的柿種不能成苗或萌芽率很低。磨盤(pán)柿(D.kakiThunb ‘Mopanshi’)、晚御所(D.kakiThunb ‘Okugosho’)、太秋(D.kakiThunb ‘Taishu’)等常用育種親本本身結(jié)籽率低，無(wú)形中也增加了雜種獲取難度。雜種獲取困難，已嚴(yán)重阻礙了甜柿育種進(jìn)展，導(dǎo)致目前我國(guó)優(yōu)新甜柿品種更新緩慢，缺乏自主品種權(quán)的甜柿[12]。

未成熟胚搶救技術(shù)，可使可能敗育或退化的胚經(jīng)過(guò)適宜培養(yǎng)，獲得再生[16]。目前該技術(shù)在次郎(D.kakiThunb ‘Jirou’)、羅田甜柿(D.kakiThunb ‘Luotiantianshi’)和磨盤(pán)柿雜交育種中得到了初步嘗試和應(yīng)用[17-20]，但未見(jiàn)該技術(shù)在太秋等甜柿幼胚搶救中成功應(yīng)用的報(bào)道。同時(shí)已報(bào)道的各技術(shù)方案中，培養(yǎng)條件、取胚時(shí)間、培養(yǎng)基組成等環(huán)節(jié)上存在較大差異，如：我國(guó)武漢地區(qū)次郎甜柿幼胚搶救時(shí)間為花后50～60 d[20]，而日本的次郎甜柿，多在花后70 d進(jìn)行胚搶救[17]；磨盤(pán)柿利用添加6-BA(6-Benzylaminopurine，6-芐氨基腺嘌呤)的培養(yǎng)基進(jìn)行幼胚搶救，而羅田甜柿的幼胚培養(yǎng)基中則添加ZT(Zeatin，玉米素)，這些差異的存在不利于其他地區(qū)柿雜交育種應(yīng)用時(shí)進(jìn)行參考。據(jù)此，本試驗(yàn)以中國(guó)長(zhǎng)三角地區(qū)常用柿育種親本為材料，開(kāi)展幼胚搶救系統(tǒng)優(yōu)化研究，以期為本地區(qū)柿胚培養(yǎng)提供精確、可靠的參考，并進(jìn)而完善柿幼胚搶救技術(shù)體系，從而加快柿育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 幼胚培養(yǎng)因素的正交試驗(yàn)

為確定柿幼胚搶救體系中的關(guān)鍵影響因素，本文設(shè)立了培養(yǎng)基、柿品種、取胚時(shí)間(DAP, Days after pollination)4因素3水平正交優(yōu)化試驗(yàn)(表1)。其中，培養(yǎng)基以MS(Murashige and Skoog培養(yǎng)基)+5%蔗糖+8 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上，另設(shè)置兩種激素處理 [Zt (0.4 mg/L)、IBA(3-indolebutyric acid，3-吲哚丁酸)(0.3 mg/L)]。富有、晚御所、太秋為該地區(qū)甜柿育種中常用親本代表；以恒溫24℃、光照14 h為基礎(chǔ)培養(yǎng)條件，另設(shè)置了兩個(gè)培養(yǎng)條件處理 [先暗培養(yǎng)4 d后轉(zhuǎn)入基礎(chǔ)條件下培養(yǎng)、在培養(yǎng)基中加入活性炭(3 g/L)]。各組合培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8, 高壓滅菌備用。每組合接種30個(gè)幼胚, 重復(fù)3次。

表 1 甜柿幼胚搶救正交設(shè)計(jì)

1.2 幼胚取胚時(shí)間優(yōu)化

以太秋甜柿為材料，分別于花后40、47、55、62、69和77 d取胚，進(jìn)行幼胚類型觀測(cè)，每時(shí)間點(diǎn)觀察30～50個(gè)幼胚。分別以正交試驗(yàn)中1號(hào)和2號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行各時(shí)間點(diǎn)的幼胚培養(yǎng)，比較不同取胚時(shí)間對(duì)幼胚搶救培養(yǎng)的影響，每個(gè)取胚時(shí)間接種30～50個(gè)幼胚。

1. 3 培養(yǎng)基優(yōu)化

根據(jù)以往研究經(jīng)驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)中設(shè)計(jì)了6種培養(yǎng)基(表2)，以太秋甜柿65 DAP的幼胚為材料進(jìn)行培養(yǎng)，每7 d觀察各培養(yǎng)方案中幼胚發(fā)育狀態(tài)。

1. 4 試驗(yàn)方法

幼果用自來(lái)水沖洗, 再用70%酒精浸泡30 s, 然后用1%次氯酸鈉(加入2～3滴Tween20)浸泡10 min, 無(wú)菌水沖洗3～4次。在無(wú)菌條件下剝?nèi)∮着呓臃N于各種培養(yǎng)基中。在恒溫28℃、光照14 h、光照強(qiáng)度31.2～39.0 μmol/m2·s的條件下培養(yǎng)。

表 2 用于幼胚培養(yǎng)試驗(yàn)的6種培養(yǎng)基

1. 5 數(shù)據(jù)分析

所有接種處理分別于14 d后統(tǒng)計(jì)幼胚萌發(fā)率，45 d后統(tǒng)計(jì)成苗率及株高。數(shù)據(jù)分析采用SPSS分析軟件。

2 結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)判定影響因素

分別于兩周后和兩個(gè)月后統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)處理中幼胚萌發(fā)率及成苗率，并進(jìn)行正交分析。R值的大小反映了各因素對(duì)萌發(fā)率、成苗率影響的大小。由表3可知，相對(duì)于成苗率，萌發(fā)率受實(shí)驗(yàn)因素的影響程度較大些。各因素中，影響幼胚萌發(fā)率和成苗率程度的因素排名基本一致，排名為：培養(yǎng)基>取胚時(shí)間>柿品種>培養(yǎng)條件。但K值顯示理論上最優(yōu)組合并未出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)設(shè)置中。因此有必要以太秋幼胚為材料，對(duì)培養(yǎng)基構(gòu)成和取胚時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，從而確定出柿幼胚培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)體系。

2.2 取胚時(shí)間篩選

各時(shí)間點(diǎn)柿胚類型觀測(cè)結(jié)果(表4)表明，柿雜種胚在40 DAP時(shí)多為球形胚；47 DAP時(shí)柿胚以心形胚為主，尚有一部分胚發(fā)育緩慢，仍為球形胚；55 DAP時(shí)，多數(shù)胚發(fā)育成魚(yú)雷胚；62 DAP以子葉胚為主，但存在部分魚(yú)雷胚；69～77 DAP，柿胚多為子葉胚，且69 DAP后新增子葉胚比例變緩；總體上與扈惠靈和徐莉清等柿胚觀測(cè)基本一致[20-21]。

表3 幼胚搶救培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表 4 不同取胚時(shí)間下各類型胚發(fā)生率

柿胚在球形胚和心形胚時(shí)期，較難進(jìn)行觀測(cè)與胚分離操作，40及47 DAP時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用幼種培育，其他時(shí)間段采用幼胚培養(yǎng)方式。如圖1所示，無(wú)論是1號(hào)培養(yǎng)基還是2號(hào)培養(yǎng)基，此階段胚培養(yǎng)成功率均很低，如40DAP，成苗率分別為3.6%和2.6%；花后47 d取胚，兩個(gè)培養(yǎng)基中胚培苗成苗率仍不超過(guò)10%；到第55天后，兩種培養(yǎng)基的胚培苗成苗率都顯著提升，成苗率達(dá)到40%～60%左右；此后，隨著胚齡增大，成活率逐漸提高，第62 DAP時(shí)，成苗率達(dá)到50%～70%；花后69 d取胚時(shí)，兩種培養(yǎng)基中胚培苗成苗率都達(dá)到最高；然而，到77 DAP取胚時(shí)，成苗率略有回落。

2.3 柿幼胚搶救技術(shù)的培養(yǎng)基組分篩選

正交試驗(yàn)表明，在胚挽救中最關(guān)鍵的問(wèn)題是尋找一種合適的培養(yǎng)基。其中，無(wú)激素的基本培養(yǎng)基中，胚培苗萌發(fā)率、成苗率都在較低水平；在培養(yǎng)基中添加IBA后，胚培苗各指標(biāo)都得到了提升，特別是生根數(shù)顯著提升；而添加ZT的培養(yǎng)基中胚培苗萌發(fā)率、成苗率、成苗效率顯著高于其他培養(yǎng)基，但生根數(shù)顯著低于其他兩種培養(yǎng)基，可見(jiàn)ZT和IBA在柿幼胚培養(yǎng)中都發(fā)揮著作用。據(jù)此下面試驗(yàn)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)與前人研究結(jié)果，共選用與設(shè)計(jì)6種培養(yǎng)基用于培養(yǎng)基優(yōu)化篩選試驗(yàn)。

表 5 正交試驗(yàn)中不同培養(yǎng)基的胚培苗生長(zhǎng)情況

圖1 不同取胚時(shí)間對(duì)幼胚搶救成苗率的影響

Fig 1 Effect of different embryo-collecting time on seedlings rate of persimmon immature embryo culture

圖2 幼胚培養(yǎng)各發(fā)育歷程情況總覽Fig 2 The overview of different embryos-seedling development course

各培養(yǎng)基中，接種4 d后，幼胚變得飽滿，胚軸開(kāi)始伸長(zhǎng)，胚軸底部出現(xiàn)藍(lán)色分泌物。但部分胚到接種70 d后也無(wú)變化，視為“死苗”(見(jiàn)圖2)。接種7 d后，胚軸明顯伸長(zhǎng)，且顏色變黑，明顯出現(xiàn)根組織，子葉逐漸平展開(kāi)，顏色開(kāi)始轉(zhuǎn)綠。接種14 d后，出現(xiàn)了不同的發(fā)育歷程，其中，有部分胚培苗的根“騰空生長(zhǎng)”，莖、葉并無(wú)明顯增大，呈現(xiàn)出“跳苗”現(xiàn)象(如圖2中歷程2)，且“跳苗”狀態(tài)一直維持；一些胚培苗莖部迅速伸長(zhǎng)且粗大，顏色翠綠，而子葉發(fā)育遲緩，且出現(xiàn)明顯“黃化”現(xiàn)象，到接種30 d后，子葉才開(kāi)始正常發(fā)育(如圖2中歷程3)；一部分正常發(fā)育，根、莖、葉發(fā)育協(xié)調(diào)(如圖2中歷程4)；另培養(yǎng)時(shí)，還出現(xiàn)發(fā)育歷程5(見(jiàn)圖2)，即接種14 d后，子葉迅速膨大、平展、顏色墨綠，根、莖發(fā)育遲緩。具有歷程3、4和5的胚培苗在接種60～70 d后最終均能呈現(xiàn)正常苗。此外，又有部分胚培苗整體發(fā)育遲緩，20 d后，幼胚才呈現(xiàn)進(jìn)一步發(fā)育狀態(tài)，到100 d后，才逐漸發(fā)育成苗，但各部分發(fā)育協(xié)調(diào)(如圖中歷程6)。

如表5、6與圖3顯示，各培養(yǎng)基胚培苗在發(fā)育歷程、成苗率、苗高及生根數(shù)均出現(xiàn)差異。無(wú)激素添加的MS培養(yǎng)基，幼胚發(fā)育遲緩，以發(fā)育歷程6為主，成苗率、苗高、生根數(shù)等顯著低于其他培養(yǎng)基。添加激素ZT的1、2和3號(hào)培養(yǎng)基中胚培苗發(fā)育啟動(dòng)早，歷程4的胚培苗比率顯著高于其他培養(yǎng)基。但只添加高濃度ZT的培養(yǎng)基，胚培苗生根數(shù)為各培養(yǎng)基中最低。而配合使用激素ZT和IBA的培養(yǎng)基幼胚搶救培養(yǎng)效果較好，其中1號(hào)與2號(hào)培養(yǎng)基中幼胚成苗率、生根數(shù)指標(biāo)都顯著高于其他培養(yǎng)基，苗高也顯著高于5、6號(hào)培養(yǎng)基。且2號(hào)培養(yǎng)基中胚培苗發(fā)育較為均衡，具有發(fā)育歷程3、4和5的胚培苗總比率最高，為0.92。1/2N(1號(hào)、2號(hào)培養(yǎng)基)和3/4NMS(4號(hào)培養(yǎng)基)的中“跳苗”比率高于其他培養(yǎng)基。

表6 不同培養(yǎng)基下幼胚成活率、苗高和生根數(shù)

由上述試驗(yàn)可以確定，在長(zhǎng)三角地區(qū)進(jìn)行柿幼胚搶救最佳方案為：62～69 DAP取胚，采用[1/2MS+ZT(0.4 mg/L)+ IBA(0.2 mg/L)+活性炭(3 g/ L)+蔗糖(70 g/ L)]培養(yǎng)基，胚培苗發(fā)育良好(如圖4-a)，培養(yǎng)45 d后，成苗率為0.88、平均苗高為3.52 cm、生根數(shù)平均為2.52，此時(shí)進(jìn)行煉苗、移栽，移栽30 d后成活率在85%以上(圖4-b)。

圖3 各培養(yǎng)基中幼胚發(fā)育情況分布比率

圖4 2號(hào)培養(yǎng)基中胚苗培育與移栽情況

a:培養(yǎng)45 d后的胚培苗；b:移栽30 d后的幼苗

3 討論

柿種發(fā)育過(guò)程中存在普遍而嚴(yán)重的胚早期退化現(xiàn)象，極大地降低了育種效率[12, 18-19]。通過(guò)胚搶救技術(shù)，可使敗育或退化的柿幼胚，獲得再生，從而提高育種效率[16]。然而，植物胚拯救過(guò)程中影響因素有很多，本試驗(yàn)對(duì)甜柿幼胚搶救體系中主要影響因素進(jìn)行正交分析。與多數(shù)植物一樣[22-24]，本文正交試驗(yàn)顯示培養(yǎng)基成分和胚齡也是甜柿幼胚搶救體系中主要影響因素。

3.1 取胚時(shí)間

理論上，在柿胚發(fā)育早期進(jìn)行胚搶救，可最大限度獲得柿種質(zhì)，但本試驗(yàn)與磨盤(pán)柿[21]及次郎[20]的幼胚培養(yǎng)都顯示，40～47 DAP的幼胚成苗率都較低，這也與毛桃(AmygdaluspersicaBatsch)[25]、甜瓜(Cucumismelo)[26]、百合(Liliumbrownii)[27]等多種植物難以在球形胚和心形胚階段建立幼胚搶救體系的結(jié)論一致。許多研究表明[20- 21, 26]，幼胚搶救成功率與胚發(fā)育狀態(tài)密切相關(guān)。植物胚動(dòng)態(tài)發(fā)育是一個(gè)由異養(yǎng)階段向自養(yǎng)階段逐漸轉(zhuǎn)化的過(guò)程，異養(yǎng)階段的幼胚難以培養(yǎng)，而始于心形胚發(fā)育后期的自養(yǎng)植物幼胚則較容易培養(yǎng)[24]。同樣，本試驗(yàn)中，采用55 DAP時(shí)魚(yú)雷胚進(jìn)行搶救，胚培苗成苗率顯著提升，此后隨著胚齡增大，胚逐漸進(jìn)入子葉胚，成活率與成苗率都逐漸提高，這也與桃(Amygdaluspersica)、杏(Armeniacavulgaris)、李(Prunussalicina)和梅(Armeniacamume)等成苗率與胚齡正相關(guān)的結(jié)論[22, 24]相一致。而本實(shí)驗(yàn)顯示，77 DAP的胚成苗率略有回落，可能此時(shí)幼胚過(guò)度成熟，胚細(xì)胞生長(zhǎng)分裂能力已大大下降，甚至已啟動(dòng)休眠系統(tǒng)[28]，不適宜胚培養(yǎng)；又或是由于此時(shí)胚乳硬化，取胚時(shí)易對(duì)胚產(chǎn)生機(jī)械損傷，影響胚活力；雖其根本原因尚未明確，但與傳統(tǒng)柿幼胚培養(yǎng)極少采用花后80 d的幼胚進(jìn)行胚培養(yǎng)的操作處理[17-19]相吻合。

綜合各取胚時(shí)間幼胚培養(yǎng)效果，本文表明花后62～69 DAP為柿幼胚培養(yǎng)最佳取胚時(shí)間。與日本的次郎[17]、中國(guó)的北京磨盤(pán)柿[19]以及武漢羅田甜柿[18]等研究中采用70 DAP時(shí)進(jìn)行胚搶救相比，本文的胚搶救時(shí)間提前了1周左右，增大了柿雜種獲得率的同時(shí)也節(jié)約了育種時(shí)間；而與冷平等認(rèn)為花后60～80 DAP為北京地區(qū)磨盤(pán)柿胚培養(yǎng)的最佳時(shí)期[21]相比，本文為柿胚搶救提供了更為精細(xì)的取胚參考時(shí)間。以往研究表明由于柿胚發(fā)育的地域性差異，同品種柿的最適取胚時(shí)間在各地有別，如徐莉清等研究表明武漢地區(qū)次郎甜柿幼胚搶救時(shí)間為花后50～60 DAP[20]，而日本地區(qū)的次郎甜柿，多在70 DAP時(shí)進(jìn)行胚搶救[17]，這也暗示了中國(guó)浙北、皖南、蘇南等長(zhǎng)三角區(qū)域的甜柿育種中，采用本試驗(yàn)取胚時(shí)間進(jìn)行幼胚搶救，相對(duì)其他研究中的取胚時(shí)間更為適宜。

3.2 培養(yǎng)基成分

本文正交試驗(yàn)及以往試驗(yàn)表明，柿胚挽救關(guān)鍵是合適培養(yǎng)基的配置。細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素在植物幼胚培養(yǎng)中起到主要作用[22-24]，而漿果類水果胚培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分裂素常用ZT或6-BA，生長(zhǎng)素常使用IBA或IAA[24, 26]。柿組織培中較低的氮濃度，培養(yǎng)效果較好[29-30]。柿組培中培養(yǎng)基存在褐化問(wèn)題，需要在培養(yǎng)基中增加了還原劑或吸附劑[18-19]。據(jù)此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了6種培養(yǎng)基進(jìn)行幼胚培養(yǎng)試驗(yàn)。

與6-BA能有效地打破的葡萄(Vitisvinifera)胚早期發(fā)芽[31]不同的是，本實(shí)驗(yàn)中添加ZT培養(yǎng)基中的柿胚發(fā)育啟動(dòng)明顯早于其他培養(yǎng)基，這與多數(shù)研究者認(rèn)為ZT是柿胚萌發(fā)啟動(dòng)中關(guān)鍵因子的結(jié)論相一致[17-18]，也與柿組培中培養(yǎng)基中ZT效果好于6-BA的結(jié)論相一致[32-33]。雖然沒(méi)有添加激素的5號(hào)培養(yǎng)基在Sugiura[33]和朱偉玲[34]胚培養(yǎng)研究中取得了較好的結(jié)果，但在本文中幼胚發(fā)育緩慢，且成苗率及苗高較低。筆者推測(cè)Sugiura試驗(yàn)中前期體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含有大量ZT，致使用于幼胚培養(yǎng)的體胚中殘留大量ZT，以致在無(wú)ZT的培養(yǎng)基中也能取得較好的培養(yǎng)效果。而朱偉玲在試驗(yàn)中采用的是花后180～200 DAP成熟胚，胚發(fā)育啟動(dòng)已經(jīng)完成了。這些也從側(cè)面說(shuō)明了ZT在幼胚萌發(fā)啟動(dòng)中的重要作用。但較高ZT濃度，對(duì)柿生根存在不利影響，如本文中只添加較多ZT的6號(hào)培養(yǎng)基中，胚發(fā)育雖然啟動(dòng)正常，但成苗率和苗高較低，這也可能是根和莖段發(fā)育缺少生長(zhǎng)素參與，在培養(yǎng)中需添加生長(zhǎng)素。據(jù)此，本試驗(yàn)中比較了IBA和IAA的效果，結(jié)果表明IBA的使用下，柿胚成苗率、苗高、培養(yǎng)效果均顯著高于添加IAA的培養(yǎng)基，同時(shí)也好于沒(méi)有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基。

柿組培中，由于次生代謝產(chǎn)物較多，培養(yǎng)基容易褐化。本試驗(yàn)表明，添加活性炭的效果好于PVP，這也與谷曉峰的柿培養(yǎng)結(jié)果相一致[18]。較低氮源，雖有利于柿胚發(fā)育，但本文在1/2N和3/4NMS的培養(yǎng)過(guò)程中存在一定比率跳苗的現(xiàn)象，和磨盤(pán)柿幼胚試驗(yàn)結(jié)果相似[35]；反而本文在1/2MS培養(yǎng)基下，大量元素間比例可能較為均衡，胚培養(yǎng)中較少出現(xiàn)跳苗現(xiàn)象，胚苗各器官發(fā)育較為均衡。故綜合各方面培養(yǎng)效果表現(xiàn)，本課題組選擇2號(hào)培養(yǎng)基作為幼胚搶救培養(yǎng)基，培養(yǎng)45 d后，成苗率與傳統(tǒng)柿幼胚培養(yǎng)相當(dāng)，而平均苗高、生根數(shù)等指標(biāo)高于傳統(tǒng)柿幼胚培養(yǎng)研究[18-21, 35]。

針對(duì)長(zhǎng)三角地區(qū)柿育種中幼胚搶救缺乏直接的技術(shù)參考，本文以該地區(qū)常用育種親本為材料，開(kāi)展正交與單因素試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明：該地區(qū)柿胚搶救宜于62～69 DAP取胚，采用1/2MS+ZT(0.4 mg/L)+IBA(0.2 mg/L)+活性炭(3 g/ L)+蔗糖(70 g/ L)為培養(yǎng)基進(jìn)行幼胚培養(yǎng)。這一結(jié)果為該地區(qū)的柿育種工作提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

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Optimization of immature embryo rescue technique system for persimmon

XU Yang1, GONG Bang-chu1, WU Kai-yun1, JIANG Xi-bing1, LIU Tong-xiang1, TANG Dan1, SUN Wei-ming1, MA Pan1， TENG Guo-xin2

(1. Key Laboratory of Tree Breeding of Zhejiang Province, Research Institute of subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Hangzhou 311400; 2. Plant Nursery of Lanxi Citry in Zhejiang Province, Jinhua 321100, China)

The high percentage of abnormal seeds during the growth of its hybrid seriously hampered the development of the persimmon cross-breeding research. The technique of immature embryo rescue could rescue abortive embryos to obtain hybrid seedlings. The immature embryo ofD.kakiThunb ‘Fuyu’,D.kakiThunb ‘Okugosho’,D.kakiThunb ‘Taishu’ was used as the experimental materials, an orthogonal experiment of L9(34)was adopted to study for embryo rescue. Then, using the immature embryo ofD.kakiThunb ‘Taishu’as the experimental materials, media and embryo-collecting time were respectively determined as univariate factor for further single factor experiment. The results showed that according to the effect on immature embryo rescue,the order for the factors was as follows: media, embryo-collecting time, persimmon varieties, and cultivation conditions. The seedling rates of embryos from 45 days after pollination (DAP) to 55 DAP were extremely low. Though, the embryo culture seedling rates increase as embryo age increased. The seedling rates of embryo from 77 DAP dropped slightly. So, the optimal embryo-collecting time for persimmon immature embryo rescue in the lower area of the Yangtze River is: 62-69 DAP. An extensive variation existed in the development process, embryo seedlings rate, seedling height and root number of persimmon immature embryo in different medium. By comparative analysis, the optimal medium for persimmon immature embryo rescue is 1/2 MS+ZT (0.4 mg/L) + IBA(0.2 mg/L)+Activated carbon (3 g/L)+Sucrose (70 g/L). After cultivating for 45 days, the average seedlings rate, average seedling height and average root number of persimmon immature embryo can, be up to 0.88, 3.52 cm and 2.52 respectively.

persimmon; immature embryo rescue; embryo-collecting time; medium

2016-08-30；

2016-09-08

“十二五”科技計(jì)劃課題“澀柿和甜柿高效生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”(2013BAD14B05)；國(guó)家林業(yè)局948項(xiàng)目(2013-4-26)；浙江省科技廳十三五果品農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)“柿棗新品種選育”課題(2016C02052-10)

徐 陽(yáng)，博士，助理研究員，研究方向?yàn)榻?jīng)濟(jì)林良種選育與高效栽培，E-mail：xuyang198610@163.com

龔榜初，研究員，研究方向?yàn)榻?jīng)濟(jì)林良種選育與高效栽培，E-mail：gongbc@126.com

S665.2

B

2095-1736(2017)04-0110-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.04.110