張麗娜，鄭妍，胡成進(jìn)，周月霞，陳英劍

(1.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，濟(jì)南 250031；2.青島慧康醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東青島 266520)

·臨床檢驗(yàn)技術(shù)研究·

焦磷酸測序快速檢測3種海洋性弧菌的方法學(xué)建立及創(chuàng)傷弧菌16S rRNA基因分型的研究

張麗娜1，鄭妍2，胡成進(jìn)1，周月霞1，陳英劍1

(1.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，濟(jì)南 250031；2.青島慧康醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東青島 266520)

目的 建立一種海洋致病性弧菌的快速診斷方法，為海洋性弧菌感染的臨床檢測構(gòu)建新的技術(shù)平臺。方法 分別針對創(chuàng)傷弧菌vvhA，副溶血弧菌和溶藻弧菌的toxR基因設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和測序引物，并PCR擴(kuò)增特異性DNA片段，制備單鏈模板，進(jìn)行焦磷酸測序，得到的堿基序列經(jīng)NCBI比對驗(yàn)證；對創(chuàng)傷弧菌16S rRNA基因進(jìn)行分型。結(jié)果 創(chuàng)傷弧菌的擴(kuò)增引物和測序引物均表現(xiàn)出較好的特異性，4株創(chuàng)傷弧菌均擴(kuò)增出167 bp大小的DNA片段，并且測序結(jié)果與NCBI比對達(dá)到100%匹配度，而其他菌株未見擴(kuò)增條帶，測序結(jié)果為陰性；11株副溶血弧菌和溶藻弧菌均分別擴(kuò)增出105 bp和134 bp大小的DNA片段，并且經(jīng)測序得到與預(yù)期相符的DNA堿基序列。4株創(chuàng)傷弧菌中1株屬于16S rRNA-A型，其余3株均屬于16S rRNA-B型。結(jié)論 本研究建立的PCR-焦磷酸測序方法是一種短核苷酸序列實(shí)時測定的新方法，具有高通量、精確、簡單易行的優(yōu)點(diǎn)，適用于海洋性致病菌及陸地感染細(xì)菌的快速精準(zhǔn)鑒定。

海洋性弧菌；焦磷酸測序；快速診斷；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

近年來海洋致病性弧菌已成為危害人類健康的重要病原菌之一，其感染進(jìn)展迅速，可引起胃腸炎、菌血癥等，死亡率較高[1-2]。而一般的微生物檢測方法耗時長，操作繁瑣，并且需要實(shí)驗(yàn)人員具備一定的經(jīng)驗(yàn)[3]。所以，亟須建立一種快速診斷海洋性弧菌的方法。本研究利用PCR-焦磷酸測序技術(shù)建立海洋性致病弧菌的檢測方法，旨在用于大中型實(shí)驗(yàn)室的海洋微生物快速精確鑒定，為臨床海洋性弧菌感染的早期快速診斷提供科學(xué)的適宜技術(shù)，并對海洋創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行16S rRNA基因分型。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究中所用的菌株均已明確鑒定，其中海洋創(chuàng)傷弧菌(M06)為韓國首爾大學(xué)食品生物技術(shù)與毒理營養(yǎng)研究所Sang Ho Choi惠贈，標(biāo)準(zhǔn)菌株創(chuàng)傷弧菌ATCC 27562、溶藻弧菌ATCC 17749等其余弧菌屬細(xì)菌來自于中國海洋微生物菌種保藏管理中心(青島)(表1所示)，其他非弧菌屬細(xì)菌均來源于濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院臨床分離保存菌株。

表1 菌株來源信息

1.2 儀器與試劑 PyroMark ID檢測系統(tǒng)(瑞典Biotage公司)，低溫高速離心機(jī)Centrifuge 5430R(德國Eppendorf公司)，熒光凝膠成像分析系統(tǒng)(美國UVP公司)，TC-XR型基因擴(kuò)增儀(日本BIOER公司)；2×PCR PreMix、DNA marker 2000(大連寶生物公司)，GoldView I型核酸染料(北京索萊寶公司)，2216E瓊脂粉(青島日水公司)，Streptavidin Sepharose(GE Healthcare公司)，焦磷酸測序試劑盒(Qiagen公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)及DNA模板的制備 取弧菌屬細(xì)菌采用三區(qū)劃線法接種于海洋微生物培養(yǎng)基2216E平板，培養(yǎng)溫度為28 ℃。非弧菌屬細(xì)菌接種于血平板，培養(yǎng)溫度為37 ℃， 置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

采用煮沸法提取細(xì)菌DNA：取50 μL ddH2O于1.5 mL EP管中，挑取菌落調(diào)至1～2個麥?zhǔn)蠞岫葐挝?，振?5 s，煮沸10 min后立即冰浴3 min，13 000 r/min離心5 min，取上清作為DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆?。革蘭陽性菌則需要加入溶菌酶和蛋白酶K破壁后煮沸提取。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中海洋創(chuàng)傷弧菌vvhA和16S rRNA基因序列、副溶血性弧菌toxR基因序列、溶藻弧菌toxR基因序列的同源性比對結(jié)果，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)焦磷酸測序PCR擴(kuò)增引物和測序引物，引物序列見表2。16S rRNA基因引物設(shè)計(jì)區(qū)域見圖1，4個不同的單核苷酸位點(diǎn)的位置分別是第998、1 000、1 013和1 016位。引物均由Invitrogen公司合成。

表2 引物序列信息

注：F，上游引物；R，下游引物；S，測序引物；BIO，生物素標(biāo)記引物。

注：紅色字體處為4個單核苷酸位點(diǎn)。

圖1 創(chuàng)傷弧菌16S rRNA基因分型引物設(shè)計(jì)區(qū)域

1.3.3 PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳 PCR反應(yīng)體系50 μL：2×PreMix 25 μL，10 μmol/L的上、下游擴(kuò)增引物各1 μL，模板DNA 1 μL和去離子水22 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，退火30 s(其中創(chuàng)傷弧菌vvhA基因和16S rRNA基因擴(kuò)增退火溫度55 ℃，副溶血弧菌toxR基因擴(kuò)增退火溫度58 ℃，溶藻弧菌toxR基因擴(kuò)增退火溫度55 ℃)，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán);72 ℃終延伸8 min。6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于含GoldView I型核酸染料的15 g/L的瓊脂糖凝膠中，100 V電泳25 min。熒光凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.3.4 焦磷酸測序 取20 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加樣于八聯(lián)排PCR管中，加入2 μL鏈霉親合素包被的磁珠、40 μL結(jié)合緩沖液(binding buffer)和18 μL超純水，室溫1 400 r/min搖動10 min；打開真空泵開關(guān)，將真空工具(vacuum prep tool)在高純水中清洗30 s，然后抓取PCR管中與磁珠結(jié)合后的PCR產(chǎn)物，分別在70%乙醇中清洗5 s，變性緩沖液(denatureation buffer)清洗5 s，最后移到清洗緩沖液(washing buffer)中清洗10 s；將vaccum prep tool放入含有退火預(yù)混液(24.5 μL退火緩沖液和0.5 μL測序引物)的PyroMarkQ24反應(yīng)板的上方，關(guān)掉泵，輕輕搖動，釋放磁珠；將PyroMarkQ24反應(yīng)板在80 ℃放置2 min，自然冷卻到室溫后放入焦磷酸測序儀。測序程序采用SQA模式，按 ATCG的堿基排列順序循環(huán)10次(基因分型的測定程序采用AQ模式，其余步驟相同)，根據(jù)軟件給出的劑量在試劑倉中加入底物混合物、酶混合物和4種脫氧核糖核苷酸，將PyroMarkQ24反應(yīng)板和試劑倉放入PyroMark lD系統(tǒng)中進(jìn)行焦磷酸測序。測序峰及相應(yīng)的DNA 堿基序列由軟件自動分析產(chǎn)生。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)傷弧菌vvhA基因、副溶血弧菌以及溶藻弧

菌toxR基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 創(chuàng)傷弧菌vvhA基因擴(kuò)增結(jié)果顯示，4株創(chuàng)傷弧菌均擴(kuò)增出167 bp大小的DNA片段，而其他弧菌和臨床分離株未見擴(kuò)增條帶(圖2)；11株副溶血弧菌均擴(kuò)增出105 bp大小的DNA片段(圖3)，11株溶藻弧菌均擴(kuò)增出134 bp大小的DNA片段(圖4)。

注：M，2 000 bp DNA marker；1，陰性對照；2～5，創(chuàng)傷弧菌；6～7，溶藻弧菌；8～9，副溶血弧菌；10～11，哈維氏弧菌；12，美人魚弧菌；13，查格斯氏弧菌；14，弗氏弧菌；15，費(fèi)氏弧菌；16，大腸埃希菌；17，肺炎克雷伯菌；18，陰溝桿菌；19，銅綠假單胞菌；20，鮑曼不動桿菌；21，嗜麥芽假單胞菌；22，金黃色葡萄球菌；23，表皮葡萄球菌；24，腸球菌。

圖2 創(chuàng)傷弧菌vvhA基因擴(kuò)增及特異性分析

注：M，2 000 bp DNA marker；1，陰性對照；2～12，副溶血性弧菌。

圖3 副溶血弧菌toxR基因擴(kuò)增

注：M，500 bp DNA marker；1～11，溶藻弧菌；12，陰性對照。

圖4 溶藻弧菌toxR基因擴(kuò)增

2.2 創(chuàng)傷弧菌vvhA基因、副溶血弧菌以及溶藻弧菌toxR基因焦磷酸測序結(jié)果 所有菌株的焦磷酸測序均測出22～30 bp大小不等的DNA堿基序列，從表2可觀察到，創(chuàng)傷弧菌MO6測出的堿基序列與NCBI網(wǎng)站比對的MO6的vvhA堿基序列完全一致(GenBank: KU680790.1)，其中第5個堿基為G，第26個堿基為A；而另外3株創(chuàng)傷弧菌的第26個堿基均突變?yōu)镃，其中創(chuàng)傷弧菌C6的第5個堿基突變?yōu)镃。11株副溶血弧菌測出的堿基序列均為5′-TGTAAACAGCAGTACGCAAATCGG-3′，11株溶藻弧菌測得的堿基序列均為5′-GAGTTGGTAGCCACGTTTAGGT-3′，并且與NCBI網(wǎng)站比對的匹配率均達(dá)到100%。

表3 創(chuàng)傷弧菌焦磷酸測序檢測結(jié)果

2.3 創(chuàng)傷弧菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增和焦磷酸測序結(jié)果分析 4株創(chuàng)傷弧菌均擴(kuò)增出121 bp大小的16S rRNA的DNA片段，并經(jīng)過焦磷酸測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中創(chuàng)傷弧菌MO6 4個單核苷酸位點(diǎn)測出的堿基分別為TAAA，屬于16S rRNA-B型，其余3株測出的堿基分別是為ATGC，均屬于16S rRNA-A型。見圖5。

注：M，500 bp DNA marker；1，陰性對照；2～5，創(chuàng)傷弧菌。

圖5 創(chuàng)傷弧菌16S rRNA基因擴(kuò)增

3 討論

微生物的檢測已從傳統(tǒng)的生化免疫學(xué)方法逐漸轉(zhuǎn)向基因水平[4]。特定序列的確定是細(xì)菌鑒定與分類的黃金標(biāo)準(zhǔn)，常用的sanger法適合長序列的測定，操作復(fù)雜，在臨床實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用受限[5]。本研究中建立的PCR-焦磷酸測序方法是短核苷酸序列實(shí)時測定的一種新方法[6]，既可用于已知序列的驗(yàn)證性測序，又可用于未知序列的探索性測序，結(jié)果分析也非常簡單，無需復(fù)雜的分析軟件，具有高通量、自動化、簡單易行的優(yōu)點(diǎn)，適用于微生物快速精確鑒定。

細(xì)菌16S rRNA基因被認(rèn)為是細(xì)菌種屬水平檢測的專屬基因。但是，海洋性弧菌屬細(xì)菌的16S rRNA序列高度保守，比如，創(chuàng)傷弧菌的核酸序列和納瓦拉弧菌的一致性高達(dá)96%，與33株其他弧菌的核酸相似性也達(dá)到90%以上[7]。此外，焦磷酸測序只能測出幾十個核苷酸序列，因此，不適于用16S rRNA作為高同源性海洋性弧菌檢測的靶標(biāo)基因。水溶性胞外蛋白溶細(xì)胞素為創(chuàng)傷弧菌一個重要的致病因子，vvhA是其編碼基因[8]。因此，我們使用vvhA基因作為創(chuàng)傷弧菌檢測的靶基因。研究發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌和溶藻弧菌的同源性非常高，tlh基因、tdh基因的引物均不能用于兩者的鑒別[9]。Croci等[10]評估了不同靶基因的副溶血弧菌的PCR的鑒定方法，指出toxR基因作為靶基因具有理想的準(zhǔn)確性，本研究結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)。

本研究通過PCR-焦磷酸測序技術(shù)建立了海洋性創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌快速鑒定的方法，僅通過二十幾個堿基序列就可鑒定特異性弧菌，而其他對照菌株未擴(kuò)增出目的條帶。針對創(chuàng)傷弧菌vvhA基因的焦磷酸測序結(jié)果，我們查找其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，共450個氨基酸組成中測出的突變位點(diǎn)是第119個氨基酸絲氨酸和第126個氨基酸丙氨酸位點(diǎn)，分別發(fā)生G-C和A-C突變后，密碼子UCU和GCC變成UCG和GCG，表明該位點(diǎn)雖然發(fā)生了突變但其氨基酸序列沒有改變, 以致該基因表達(dá)的溶細(xì)胞素蛋白沒有發(fā)生變化。

根據(jù)16S rRNA基因的序列變異，海洋創(chuàng)傷弧菌又進(jìn)一步分為2個基因型，分別是16S rRNA基因A型和B型。Vickery等[11]發(fā)現(xiàn)，94%的致死臨床株屬于16S rRNA-B型，而環(huán)境株中僅占6%，這表明16S rRNA基因型可能是創(chuàng)傷弧菌潛在毒力的一種指標(biāo)?；蚍中蛯α餍胁W(xué)監(jiān)測有重要意義，有助于從基因水平了解細(xì)菌的致病機(jī)制和耐藥機(jī)制，為臨床患者的個體化用藥提供依據(jù)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，創(chuàng)傷弧菌16S rRNA兩種基因型的1 536個堿基中有17個堿基不同[12]，故選取5′末端的4個核苷酸位點(diǎn)設(shè)計(jì)焦磷酸測序基因分型試驗(yàn)，并成功對4株創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行了基因分型。但是，由于實(shí)驗(yàn)菌株數(shù)量有限，對此有待于進(jìn)一步擴(kuò)大菌株數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究建立的PCR-焦磷酸測序方法是短核苷酸序列實(shí)時檢測的一種新方法，具有高通量、高效精確、自動化、簡單易行的優(yōu)點(diǎn)，不僅適用于海洋性致病菌的快速鑒定，也適用于陸地感染細(xì)菌的快速精確鑒定。

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(本文編輯：劉群)

Establishment of a PCR-pyrosequencing method for the rapid detection of three marine vibrios and the investigation on 16S rRNA genotyping ofVibriovulnificus

ZHANGLi-na1,ZHENGYan2,HUCheng-jin1,ZHOUYue-xia1,CHENYing-jian1

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,GeneralHospitalofJinanMilitaryRegionofPLA,Jinan250031,Shandong; 2.DepartmentofLaboratoryMedicine,HuiKangHospitalofQingdao,Qingdao266520,Shandong,China)

Objective To establish a rapid diagnostic method for the detection of marine vibrios, and then construct a new technology platform for the clinical diagnosis of marine vibrio infection. Methods A pair of PCR primers and a sequencing primer based on thevvhAgene ofV.vulnificusand thetoxRgenes ofV.parahemolyticusandV.alginolyticuswere designed respectively, and then the specific DNA fragments were amplified. Next, the single-stranded DNA templates were prepared for pyrosequencing. The obtained base sequence was validated by NCBI alignment. In addition, the 16S rRNA genotyping ofV.vulnificuswas also performed. Results The PCR primers and sequencing primer ofV.vulnificusshowed good specificity, and a 167 bp DNA fragment was amplified from 4 strains ofV.vulnificus. The pyrosequencing results completely matched with thevvhAgene sequence ofV.vulnificus. Meanwhile, the control strains were negative. A 105 bp DNA fragment and a 134 bp DNA fragment were amplified from 11 strains ofV.parahemolyticusandV.alginolyticus, respectively, and the pyrosequencing results were consistent with the expected sequence. In addition, one of 4 strains ofV.vulnificuswas identified as 16S rRNA-A type, and the other 3 as 16S rRNA-B type. Conclusion The PCR-pyrosequencing method established in this study is a new method for the real-time detection of short nucleotide sequences. It has some advantages such as high throughput, high precision and simple operation, and may be applied to the fast and accurate identification of marine and terrestrial pathogenic bacteria.

marine vibrio; pyrosequencing; rapid diagnosis; PCR

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.01

全軍“十二五”科研重點(diǎn)項(xiàng)目(BWS12J014)。

張麗娜，1987年生，女，技師，碩士，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。

胡成進(jìn)，主任醫(yī)師，博士，E-mail:hcj6289@163.com。

R446.5

A

2017-05-19)