何國(guó)東，楊翔宇，李曉紅，潘 宇，余細(xì)勇

[1.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 511436；2.廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)醫(yī)學(xué)研究部，廣東 廣州 510080]

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老過程中的全基因組DNA甲基化水平變化

何國(guó)東1,2，楊翔宇2，李曉紅2，潘 宇2，余細(xì)勇1

[1.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 511436；2.廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)醫(yī)學(xué)研究部，廣東 廣州 510080]

目的使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中全基因組DNA甲基化水平，觀察其衰老過程中甲基化率的變化。方法從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中提取DNA，使用酶解法將DNA分解成單個(gè)脫氧核苷，采用超高效液相色譜法分離，正離子電噴霧與多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行定量，分析5-甲基脫氧胞嘧啶核苷、脫氧鳥嘌呤核苷的相對(duì)含量，計(jì)算全基因組DNA 甲基化率。結(jié)果對(duì)1 μg DNA樣本進(jìn)行1 h酶解反應(yīng)，2 min內(nèi)可分析出5.00×10-4水平以上的DNA甲基化率，日內(nèi)及日間精密度分別在7.12×10-2和0.119以內(nèi)。隨著骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，干細(xì)胞不斷衰老，其甲基化率逐漸降低，傳至P4～P6代時(shí)，干細(xì)胞甲基化率最低，隨著傳代的繼續(xù)，其甲基化率逐漸上升。結(jié)論此方法成功應(yīng)用于檢測(cè)研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在衰老過程中全基因組DNA甲基化水平的變化，得到了衰老影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞DNA甲基化的初步數(shù)據(jù)。經(jīng)考察，該方法樣本前處理方法簡(jiǎn)便，可操作性強(qiáng)，定量方式快速準(zhǔn)確，具有良好的靈敏度與重復(fù)性。

超高效液相色譜；質(zhì)譜；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；衰老；DNA甲基化；酶解法

基因組DNA甲基化檢測(cè)的方法眾多，如免疫組織化學(xué)法、糖基化化學(xué)標(biāo)記法、限制性內(nèi)切酶與重亞硫酸鹽測(cè)序法等等[1]，但以上方法測(cè)定過程繁瑣。隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法開始應(yīng)用于檢測(cè)DNA中的甲基化水平，其樣本處理方式主要分為兩種，一種是利用甲酸加熱水解DNA[2-3]，通過水解物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配成的溶液與其同位素內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)進(jìn)行含量測(cè)定，另一種是利用酶解的方式將DNA酶解，同樣通過酶解產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配成的溶液與其同位素內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)進(jìn)行含量測(cè)定[4-5]。不論是酸解還是酶解，由于是使用標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校準(zhǔn)定量，校準(zhǔn)曲線樣本無法模擬標(biāo)本DNA提取降解后的生物基質(zhì)，而降解DNA的過程步驟較為繁瑣，需時(shí)6～12 h，分析效率不高。本文在以前研究的基礎(chǔ)上，改進(jìn)DNA樣本處理方法和定標(biāo)方式，并應(yīng)用于分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)衰老過程中全基因組DNA甲基化水平。該方法樣本處理方式簡(jiǎn)單快速，分析周期短，重現(xiàn)性好，具有良好的靈敏度和精密度，可滿足生物樣品的全基因組DNA甲基化水平分析。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑ACQUILY UPLC超高效液相色譜儀(Waters，美國(guó))；Xevo TQ-s三重四極質(zhì)譜儀(Waters，美國(guó))；METTLER XA205DU十萬分之一電子分析天平(METTLER，德國(guó))；Allegra X-30R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(貝克曼，美國(guó))；SevenEasy Plus pH計(jì)(METTLER，德國(guó))；MDF-U73V超低溫冰箱(SANYO，日本)；LABSCALE TFF超純水機(jī)(MILLI-Q，美國(guó))；氣壓式手動(dòng)移液器(20、100、200、1000 μL)(GILSON，法國(guó))；Imagequant las 500生物分子成像儀(GE，美國(guó))； MCO-18M三氣培養(yǎng)箱(SANYO，日本)；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(Merinton，美國(guó))；OSE-PRO干式恒溫金屬浴(TIANGEN，中國(guó))；DNA Degradase Plus、5-Methylcytosine DNA Standard Set(Zymo Research，美國(guó))；乙腈(HPLC級(jí)，Merk，德國(guó))；間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(ScienCell，美國(guó))；Trypsin-EDTA Solution(碧云天生物技術(shù)，中國(guó))；Senescence β-Galactosidase Staining Kit(Cell Signaling Technology，美國(guó))；TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN，中國(guó))。

1.2細(xì)胞衰老實(shí)驗(yàn)本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，BMMSCs由廣東省人民醫(yī)院血液科的4名骨髓捐贈(zèng)者的骨髓通過梯度離心法獲得原代細(xì)胞，使用間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別于25 mL培養(yǎng)瓶和35 mm培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，使用Trypsin-EDTA Solution消化傳代，留取一半細(xì)胞于-80℃冰箱保存，用于提取DNA。35 mm培養(yǎng)皿的細(xì)胞作β-半乳糖苷酶染色，使用Senescence β-Galactosidase Staining Kit進(jìn)行細(xì)胞染色，步驟按照試劑說明書進(jìn)行，驗(yàn)證細(xì)胞衰老。分別對(duì)第1、3、5、7、9、13代細(xì)胞進(jìn)行收集與染色。

1.3DNA的提取和酶解從-80℃冰箱取出的細(xì)胞樣本，置于常溫1 h后，使用TIANamp Genomic DNA Kit進(jìn)行DNA提取，步驟按照試劑說明書進(jìn)行，DNA樣本經(jīng)NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)，測(cè)定提取純度和濃度。取不小于1 μg DNA樣本，加入DNA Degradase Plus，其中包含2.5 μL buffer和 1 μL DNA Degradase，加入無核酶水補(bǔ)足反應(yīng)體積至25 μL，于OSE-PRO干式恒溫金屬浴中37℃反應(yīng)1 h，酶解后取2 μL用1.5×10-2瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)酶解效果，加入175 μL 1.0×10-3甲酸水溶液終止酶解反應(yīng)。

1.4超高效液相色譜串聯(lián)檢測(cè)串聯(lián)質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(Multiple Reaction Monitoring, MRM)定量；毛細(xì)管電壓(Capillary)3.0 kV，霧化溫度500℃，干燥氣流速650 L·h-1；5-甲基脫氧胞嘧啶核苷(5-methyl-2′-deoxycytidine , 5mdC)的定量離子對(duì)為242.03～126.00 m·z-1，錐孔電壓4 V，碰撞電壓6 V；2’-脫氧鳥苷(2′-deoxyguanosine, dG)的定量離子對(duì)為268.08～152.0 m·z-1，錐孔電壓2 V，碰撞電壓20 V。超高效液相色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3 C18 (1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；流動(dòng)相：A為5.0 mmol·L-1乙酸銨、2.0×10-3甲酸水溶液，B為乙腈；流速為0.3 mL·min-1；柱溫30℃，進(jìn)樣量5 μL；梯度洗脫程序：0～0.3 min，0.70 A；0.3～0.6 min，0.70 A降至0.05 A，0.6～1.2 min維持0.05 A，1.2～1.5 min升至0.70 A，1.5～2.0 min維持0.70 A。洗針液為1 ∶1甲醇水溶液。

1.5定標(biāo)曲線及質(zhì)控樣本的配制5-Methylcytosine DNA Standard Set包含有兩條序列一致、長(zhǎng)度均為897 bp、濃度均為50 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)DNA，其中一條DNA上的脫氧胞嘧啶全部經(jīng)過甲基化處理變?yōu)?mdC，另一條DNA上的脫氧胞嘧啶均未被修飾過。使用以上兩條標(biāo)準(zhǔn)DNA按比例混合，模擬出甲基化水平為(5.00×10-4、1.00×10-3、2.00×10-3、5.00×10-3、1.00×10-2、2.00×10-2、5.00×10-2、1.00×10-1)的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本和甲基化水平為(1.00×10-3、5.00×10-3、5.00×10-2)的質(zhì)控DNA樣本。按“1.3”的方法處理標(biāo)準(zhǔn)DNA和質(zhì)控DNA，同時(shí)檢測(cè)5mdC與dG的色譜峰面積，以5mdC/dG峰面積比值為縱坐標(biāo)，橫坐標(biāo)為甲基化水平，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.15mdC和dG質(zhì)譜特征與參數(shù)優(yōu)化以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)為掃描模式，通過梯度優(yōu)化毛細(xì)管電壓、霧化溫度、干燥氣流速、錐孔電壓、碰撞電壓等參數(shù)后，分別使得5mdC離子對(duì)(242.0～126.0 m·z-1)和dG離子對(duì)(268.0～152.0 m·z-1)靈敏度最高，優(yōu)化結(jié)果詳見實(shí)驗(yàn)部分。Fig 1A、1B為5 mdC和dG子離子掃描圖。從Fig 1可看出，5mdC對(duì)應(yīng)母離子為242.0 m·z-1，經(jīng)碰撞后生成的主要子離子為5-甲基胞嘧啶(126.0 m·z-1)；dG對(duì)應(yīng)母離子為268.0 m·z-1，經(jīng)碰撞后生成的主要子離子為鳥嘌呤(152.0 m·z-1)。

Fig 1 Product ion scanning of 5mdC(A) and dG (B)

2.2液相色譜條件優(yōu)化Fig 2中A1、A2分別為最低定量下限標(biāo)準(zhǔn)樣本中5mdC和dG的色譜圖；Fig 2中B1、B2分別為BMMSCs樣本中5mdC和dG的色譜圖，從圖中可以看出，5mdC保留時(shí)間為1.06～1.08 min，dG保留時(shí)間為1.11 min，兩分析物峰型對(duì)稱，無拖尾現(xiàn)象，無雜峰干擾。Fig 2中C1和C2為連續(xù)10針500 μg·L-15mdC和dG混合溶液后的1針空白樣本，從圖中可以看出，連續(xù)高濃度進(jìn)樣后對(duì)空白樣本并無干擾，該液相方法無殘留效應(yīng)，洗針液也滿足分析要求。

Fig 2 Chromatographic separation of 5mdC and dG

2.3BMMSCs衰老模型的驗(yàn)證Fig 3為P1、P3、P5、P7、P9、P13代細(xì)胞染色結(jié)果，陽性率結(jié)果分別為0.02、0.11、0.35、0.72、0.86、0.94。BMMSCs經(jīng)過不斷傳代培養(yǎng)，逐漸出現(xiàn)衰老特征，細(xì)胞體積逐代增大，細(xì)胞質(zhì)逐漸鋪開，細(xì)胞核逐代增大并且顏色不斷加深，β-半乳糖苷酶染色陽性率逐漸增加，顏色逐代加深。

2.4樣本前處理方法考察使用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA提取，收集到的DNA樣本取2 μL用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)進(jìn)行純度與濃度測(cè)定，A260/A280比值在1.8～2.0之間，濃度在50 ～100 mg·L-1，結(jié)果顯示該方法提取的DNA樣本純度與濃度均滿足檢測(cè)要求。采用2.5 μL Degradase buffer和 1 μL DNA Degradase對(duì)1 μg DNA樣本進(jìn)行酶解，降解產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析(Fig 4)，1 h與2 h酶解反應(yīng)效果一致且酶解效果優(yōu)異，故酶解反應(yīng)1 h即可滿足分析需要。

2.5方法學(xué)考察本方法采用兩條標(biāo)準(zhǔn)DNA(5-Methylcytosine DNA Standard Set)作為定標(biāo)曲線和質(zhì)控樣本進(jìn)行方法學(xué)考察和樣本分析定量。按照生物樣品測(cè)定方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[6]，考察日內(nèi)、日間3個(gè)分析的批精密度與準(zhǔn)確度。每個(gè)分析批包含1條定標(biāo)曲線、最低定量下限和三水平質(zhì)控樣本，最低定量下限和每水平質(zhì)控樣本平行處理6份。Tab 1為該方法學(xué)的精密度、準(zhǔn)確度及最低定量下限驗(yàn)證數(shù)據(jù)。

Tab 1 Validation of accuracy and precision

CV: Coefficient of variance; RE: Relative error.

2.6對(duì)BMMSCs樣本的分析利用上述方法對(duì)來自4個(gè)不同個(gè)體的P1～P13代BMMSCs的DNA甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)。Fig 5為檢測(cè)結(jié)果，BMMSCs從P1代開始DNA甲基化水平逐漸下降，至P4～P6代時(shí)DNA甲基化水平最低，P7～P13代DNA甲基化水平則逐漸上升。

3 討論

DNA甲基化已是公認(rèn)的重要表觀遺傳學(xué)修飾之一，其動(dòng)態(tài)調(diào)控對(duì)細(xì)胞的正常生理功能起著舉足輕重的作用[7-8]。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases, DNMTs) 的作用介導(dǎo)下，S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM) 會(huì)提供一個(gè)甲基基團(tuán)，把基因組DNA序列中的胞嘧啶(cytosine, C) 甲基化轉(zhuǎn)化為5-甲基化胞嘧啶(5-methylcytosine, 5-mC) 的過程[9]。分析全基因組DNA甲基化水平對(duì)于研究干細(xì)胞分化過程中基因組DNA甲基化修飾的作用，以及干細(xì)胞多分化潛能的維持與定向分化等機(jī)制具有重要的作用[10-11]。

Fig 3 Results of BMMSCs β-galactosidase staining

Fig 4 Agarose gel electrophoresis of DNA degradation products

Fig 5 The DNA methylation level of BMMSCs of P1-P13

由于衰老會(huì)對(duì)表觀遺傳學(xué)產(chǎn)生異常的改變[12]，本次研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)人BMMSCs衰老過程中DNA甲基化率的變化進(jìn)行觀察。

衰老細(xì)胞通常體積會(huì)增大，在 pH 6.0的環(huán)境下，有高酶活性的β-半乳糖苷酶，以X-Gal為底物，在衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下會(huì)生成深藍(lán)色產(chǎn)物[13]。由于β-半乳糖苷酶染色結(jié)果受pH影響較大[14]，為防止染色結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性，染色過程中嚴(yán)格控制染液pH值范圍在5.9～6.1。由β-半乳糖苷酶染色的結(jié)果看，BMMSCs隨著傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，出現(xiàn)不斷衰老的現(xiàn)象。

收集各代BMMSCs的DNA后，利用DNA Degr-adase Plus試劑降解DNA，與傳統(tǒng)酸法降解或酶法降解相比，無需分多步進(jìn)行，操作步驟簡(jiǎn)單，樣本前處理時(shí)間亦大大縮減，可操作性強(qiáng)。由于5mdC和dG為強(qiáng)極性弱堿化合物，因此，采用適合極性化合物分析專用柱ACQUITY UPLC HSS T3 C18，經(jīng)過多次流動(dòng)相調(diào)整，以乙腈-甲酸乙酸銨溶液峰型最好，分析單個(gè)樣本時(shí)間只需2 min。之前的實(shí)驗(yàn)方法[4-5]多數(shù)使用降解產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按比例配制的溶液作為定標(biāo)曲線樣本，溶液基質(zhì)與待測(cè)樣本DNA酶解后的基質(zhì)不同，定標(biāo)曲線無法校正樣本前處理過程中帶來的誤差。本方法使用標(biāo)準(zhǔn)DNA作為定標(biāo)曲線與質(zhì)控品樣本，與待測(cè)樣本經(jīng)過統(tǒng)一的酶解法處理，提高了定量準(zhǔn)確性。

一項(xiàng)關(guān)于BMMSCs傳代擴(kuò)增培養(yǎng)與干細(xì)胞干性的維持關(guān)系的研究[15]發(fā)現(xiàn)，隨著傳代BMMSCs的干性逐漸增強(qiáng)，傳代至P5～P6代時(shí)，干細(xì)胞干性最強(qiáng)，隨著傳代的繼續(xù)，其干性逐漸下降。而本研究則發(fā)現(xiàn)，隨著傳代BMMSCs不斷衰老，甲基化率逐漸降低，傳至P4～P6代時(shí)細(xì)胞甲基化率最低，隨著傳代的繼續(xù)，其甲基化率逐漸上升。提示BMMSCs的細(xì)胞干性與其DNA甲基化水平存在密切聯(lián)系。

綜上所述，本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定細(xì)胞中全基因組DNA甲基化水平的方法，并應(yīng)用于觀察BMMSCs在衰老過程中DNA甲基化水平的變化，得到了衰老影響B(tài)MMSCs的全基因組甲基化率的初步數(shù)據(jù)。該方法樣本前處理方法簡(jiǎn)便，可操作性強(qiáng)，定量方式快速準(zhǔn)確，具有良好的靈敏度與重復(fù)性。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)主要是在廣東省人民醫(yī)院的醫(yī)學(xué)研究部中心實(shí)驗(yàn)室完成的，感謝課題組所有成員對(duì)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)與幫助。)

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Analysisofmethylationlevelofbonemarrowmesenchymalstemcellsduringsenescencebyultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry

HE Guo-dong1,2, YANG Xiang-yu2, LI Xiao-hong2, PAN Yu2, YU Xi-yong1
[1.SchoolofPharmaceuticalSciences,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China；2.DeptofMedicalResearch,GuangdongGeneralHospital(GuangdongAcademyofMedicalSciences),Guangzhou510080,China]

AimTo measure the methylation rate of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and determine the methylation rate in the process of senescence.MethodsThe DNA extracted from BMMSCs would be digested into individual deoxynucleosides using enzymatic hydrolysis. To quantify the global genomic DNA methylation rate,we developed a method using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with multiple reaction monitoring to simultaneously measure the levels of 5-methyl deoxycytidine and deoxyguanosine in digested genomic DNA.ResultsThe DNA methylation rate could be analyzed within two minutes after hydrolyzing 1μg DNA for an hour. The detection limit of DNA methylation rate was 5.00×10-4. The coefficient of variance of the intra-day and inter-day precision was within 7.12×10-2and 0.119, respectively. With the subculture of BMMSCs, the methylation rate gradually decreased. The methylation rate of stem cells was the lowest in 4～6 generation, and gradually increased with the subculture.ConclusionsUsing this method, the preliminary data on DNA methylation of BMMSCs in the process of senescence are obtained. The method is simple and convenient for sample preprocessing, and the method is fast and accurate with good sensitivity and repeatability.

ultra performance liquid chromatography; mass spectrometry; bone marrow mesenchymal stem cells; senescence; DNA methylation; enzymatic hydrolysis

時(shí)間：2017-8-20 16:47 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170820.1647.042.html

2017-05-09,

2017-06-08

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(No 81330007, U1601227)；廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No 2015B020225006, 2014A050503047)

何國(guó)東(1988- )，男，碩士生，研究方向：表觀遺傳藥理學(xué)，E-mail: toyakowo@126.com； 余細(xì)勇(1962- )，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)及干細(xì)胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)，通訊作者，E-mail:yuxycn@aliyun.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.09.021

A

：1001-1978(2017)09-1298-06

R329.24；R339.38；R394.2；R446.1