姜 雪，王春月，李蘭洲，王 雪，滕利榮，周毓麟

（吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130012）

蝙蝠蛾擬青霉及蛹蟲草與野生冬蟲夏草活性比較

姜 雪，王春月，李蘭洲，王 雪，滕利榮，周毓麟*

（吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130012）

目的 冬蟲夏草是我國(guó)珍稀藥用資源，具有多種藥理活性。但是天然蟲草產(chǎn)量少需求大，使其成為瀕危資源。通過(guò)研究與其具有相似的化學(xué)成分和藥理作用的蝙蝠蛾擬青霉和蛹蟲草，可以對(duì)其進(jìn)行保護(hù)。方法 利用野生冬蟲夏草、蝙蝠蛾擬青霉和蛹蟲草的有效成分含量測(cè)定，抗疲勞活性，免疫增強(qiáng)活性及體外降血糖活性研究進(jìn)行比較。結(jié)果 3種蟲草均含有多糖，腺苷和蟲草酸；此外，蝙蝠蛾擬青霉和蛹蟲草中的多糖及蟲草酸含量均與冬蟲夏草相當(dāng)；冬蟲夏草具有顯著的降血糖活性、抗疲勞活性和免疫增強(qiáng)活性；蝙蝠蛾擬青霉具有很好的降血糖活性和抗疲勞活性；蛹蟲草具有顯著的免疫增強(qiáng)活性和抗疲勞活性；且三者對(duì)小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)均無(wú)顯著影響，表明三者均對(duì)小鼠無(wú)刺激性。結(jié)論 蝙蝠蛾擬青霉和蛹蟲草與野生冬蟲夏草的藥理作用相似，具有很大的發(fā)展空間。

蝙蝠蛾擬青霉；冬蟲夏草；蛹蟲草；成分含量

目前，我國(guó)蟲草的研究熱點(diǎn)主要有兩方面：一方面是從冬蟲夏草中分離出菌種，通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體，以蝙蝠蛾擬青霉為代表。蝙蝠蛾擬青霉為天然冬蟲夏草中分離到的內(nèi)寄生菌，是天然冬蟲夏草中普遍存在的一種蟲草的無(wú)性型，經(jīng)過(guò)深層發(fā)酵所得的菌絲體與天然冬蟲夏草的主要成分、藥理作用基本相似；另一方面是人工培養(yǎng)蛹蟲草。蛹蟲草，又名北冬蟲夏草、北蟲草等，是蟲草菌寄生在鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲蛹體及幼蟲形成的蟲菌復(fù)合體，與天然冬蟲夏草相比，同樣能夠調(diào)節(jié)全身功能，促進(jìn)抗體形成，提高免疫力，主要有保肺益腎養(yǎng)肝、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等功能[1-4]。本文從蟲草有效成分含量測(cè)定，抗疲勞活性，免疫增強(qiáng)活性及體外等方面對(duì)蝙蝠蛾擬青霉，蛹蟲草和冬蟲夏草進(jìn)行研究[5-8]。通過(guò)有效含量、體外糖消耗實(shí)驗(yàn)、自主活動(dòng)、抗疲勞活性和免疫增強(qiáng)活性等方面對(duì)蝙蝠蛾擬青霉，蛹蟲草和野生冬蟲夏草的活性進(jìn)行比較，以期對(duì)蝙蝠蛾擬青霉和蛹蟲草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 SYNEK GY4型酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰公司）；BP221S型電子天平（德國(guó)塞多利斯公司）；MiniSpin型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；GSY?II型恒溫水浴鍋（北京市醫(yī)療設(shè)備廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；小型粉碎機(jī)FW-100（天津泰斯特）小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀ZZ-6（成都泰盟）；小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒儀（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；動(dòng)物跑步機(jī)FT-200（成都泰盟軟件有限公司）；SPD?10A型高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.1.2 材料 菌種：蛹蟲草子實(shí)體（購(gòu)于沈陽(yáng)乾翔有限公司），蝙蝠蛾擬青霉（本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵獲得），野生冬蟲夏草（來(lái)自西藏那曲冬蟲夏草原產(chǎn)地）。動(dòng)物：健康balb-c小鼠80只，雌雄各半，購(gòu)自吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（遼）2014-001。試劑：0.25 %胰蛋白酶（購(gòu)于北京奧博星），二甲基亞砜（購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），噻唑藍(lán)（購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司）。試劑盒：Mouse IL-2 Elisa Kit（購(gòu)于美國(guó)RND公司），葡萄糖試劑盒-GLU（長(zhǎng)春匯力，YZB/國(guó) 0760-2003，批號(hào)：20060226）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 有效成分含量測(cè)定[9-10]采用小型粉碎機(jī)粉碎冬蟲夏草、蝙蝠蛾擬青霉、蛹蟲草子實(shí)體，粉末過(guò)40目篩。將蝙蝠蛾擬青霉，蛹蟲草和野生冬蟲夏草分別在40 ℃熱水浸提，液料比（mL:g=40:1），提取3 h，提取液8 000 r/min離心10 min，收集上清液，沉淀重復(fù)提取1次，提取液經(jīng)過(guò)40 ℃減壓濃縮，冷凍干燥得到固體粉末的蝙蝠蛾擬青霉，蛹蟲草和野生冬蟲夏草，并采用高效液相色譜法測(cè)定3種蟲草中所含的腺苷，苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量，比色法測(cè)提取液中蟲草酸的含量。

1.2.2 體外糖消耗實(shí)驗(yàn)研究[11-12]HepG2 細(xì)胞用含10 %胎牛血清的 DMEM 高糖培養(yǎng)基在37 ℃，5 %的CO2條件下培養(yǎng)，隔天更換細(xì)胞培養(yǎng)液。待細(xì)胞增值到80 %左右，PBS 沖洗 3 遍，加0.25 %含 0.02 % EDTA的胰蛋白酶消化。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將HepG2 細(xì)胞以104 個(gè)/孔 接種于 96 孔板中。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常對(duì)照組、蛹蟲草水提物組、野生冬蟲夏草子實(shí)體水提物組、蝙蝠蛾擬青霉菌絲體水提物，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的劑量分為125、250、500 μg/mL 3個(gè)濃度。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，各組分別加入不同的含藥培養(yǎng)基，正常對(duì)照組加不含血清的培養(yǎng)基。繼續(xù)于在37 ℃，5 % CO2條件下培養(yǎng)24 h ，測(cè)定培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，計(jì)算葡萄糖消耗量。檢測(cè)結(jié)束后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄培養(yǎng)基，加 150 μL DMSO，充分震蕩使其完全溶解，490 nm 下測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率，達(dá)到 90 % 以上即認(rèn)為此濃度對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響。

1.2.3 飼養(yǎng)動(dòng)物 健康balb-c小鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組20只，分別灌胃蛹蟲草子實(shí)體水提物（CM，0.5 g/kg），野生冬蟲夏草子實(shí)體水提物（CS，0.15 g/kg）和蝙蝠蛾擬青霉菌絲體水提物（PHC，0.2 g/kg），灌胃7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.4 自主活動(dòng)研究 將各組灌胃后小鼠置于安靜陰涼處，靜置30 min，放入自主活動(dòng)箱中，蓋上避光板，使小鼠適應(yīng)2 min后，記錄小鼠5 min內(nèi)的站立次數(shù)和活動(dòng)次數(shù)，5 min后，將小鼠取出，打印測(cè)試結(jié)果。

1.2.5 抗疲勞活性研究[13-14]耐力跑實(shí)驗(yàn)：末次給藥后30 min，將小鼠置于FT-200動(dòng)物跑步機(jī)中，放置好動(dòng)物后，對(duì)小鼠進(jìn)行訓(xùn)練，使其了解逃離帶電區(qū)域，將轉(zhuǎn)速設(shè)為20 r/min，電流調(diào)到最高，記錄小鼠5 min內(nèi)被電擊的次數(shù)。疲勞轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)：末次給藥30 min后，將各組小鼠分別放在轉(zhuǎn)棒儀上，使肌肉處于靜力緊張狀態(tài)，20 r/min。各組小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)訓(xùn)練，小鼠在轉(zhuǎn)棒上跌落3次后，開始記錄小鼠由于肌肉疲勞從轉(zhuǎn)棒上跌下的時(shí)間。負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)：末次灌胃后30 min，將小鼠放入水中游泳，水深30 cm，水溫（25±1.0）℃，鼠尾根部負(fù)荷5 %體質(zhì)量的鉛塊，記錄小鼠自游泳開始至力竭，作為小鼠的力竭游泳時(shí)間。以小鼠頭部沉水后超過(guò)8 s還無(wú)法上浮，并且放在平面上不能完成翻正反射作為力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.6 免疫增強(qiáng)活性研究[15-16]小鼠眼眶取血，用Mouse IL?2 Elisa Kit試劑盒檢測(cè)小鼠血漿中IL-2含量，450 nm處測(cè)定OD值，比較3種蟲草對(duì)小鼠IL-2含量的影響。

2 結(jié)果

2.1 有效成分含量檢測(cè)結(jié)果 見表1。

表1 有效成分含量檢測(cè)結(jié)果 %

結(jié)果表明：從3種有效成分的含量檢測(cè)中可以看出蛹蟲草和蝙蝠蛾擬青素的主要化學(xué)成分與野生冬蟲夏草相似。

2.2 體外糖消耗實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果 見表2。

表2 對(duì)Hep-G2細(xì)胞糖消耗率的影響 %

結(jié)果顯示，在濃度相同的情況下，蝙蝠蛾擬青素菌絲體水提物對(duì)Hep-G2細(xì)胞的糖消耗率影響最為明顯，即有顯著的降血糖活性，野生冬蟲夏草水提物次之，蛹蟲草水提物的影響最弱。

2.3 自主活動(dòng)結(jié)果 蛹蟲草子實(shí)體（CM）明顯減少小鼠5 min內(nèi)的站立的次數(shù)（P＜0.05），說(shuō)明對(duì)小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生了一定程度的抑制效應(yīng)，其安全性有待進(jìn)一步研究；野生冬蟲夏草（CS）子實(shí)體與蝙蝠蛾擬青霉菌絲體水提物（PHC）對(duì)小鼠5 min內(nèi)站立與自主活動(dòng)次數(shù)均無(wú)顯著影響，說(shuō)明二者對(duì)小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)刺激性，具有良好的安全性。

2.4 抗疲勞活性研究結(jié)果 與空白組相比，蛹蟲草子實(shí)體（CM）和蝙蝠蛾擬青霉水提物（PHC）能顯著提高小鼠的游泳時(shí)間，減少小鼠所受電擊的次數(shù)并提高了疲勞轉(zhuǎn)棒時(shí)間，具有極好的抗疲勞活性。野生冬蟲夏草能減少小鼠所受電擊的次數(shù)（P＜0.05），提高小鼠的疲勞轉(zhuǎn)棒時(shí)間(P＜0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體,蛹蟲草子實(shí)體與野生冬蟲夏草均具有明顯的抗疲勞活性。

2.5 免疫增強(qiáng)活性研究結(jié)果 小鼠血漿中的IL-2水平有所提高（P＜0.05），證明蛹蟲草子實(shí)體和野生冬蟲夏草對(duì)小鼠有一定的免疫增強(qiáng)活性，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體水提物對(duì)小鼠血漿IL-2水平無(wú)顯著性影響，初步證明蝙蝠蛾擬青霉（PHC）不能夠增強(qiáng)正常小鼠機(jī)體的免疫活性。

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體水提物，蛹蟲草子實(shí)體與野生冬蟲夏草均屬于蟲草類真菌，都含有多糖，腺苷和蟲草酸，且蛹蟲草和蝙蝠蛾擬青霉中多糖和蟲草酸的含量與野生冬蟲夏草相當(dāng)[17]。初步證明二者可以起到與野生冬蟲夏草相當(dāng)?shù)谋＝⌒ЧＴ跐舛认嗤那闆r下，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體水提物對(duì)Hep-G2細(xì)胞的糖消耗率影響最為明顯，即有顯著的降血糖活性，野生冬蟲夏草水提物次之，蛹蟲草水提物的影響最弱，故蝙蝠蛾擬青霉可以作為降血糖藥物，同時(shí)還具有一定的抗疲勞活性，無(wú)刺激性且安全性較高。蛹蟲草具有顯著的抗疲勞活性和免疫增強(qiáng)活性，但對(duì)小鼠有一定的刺激，安全性有待進(jìn)一步研究。綜合以上結(jié)果可以得出，蝙蝠蛾擬青霉水提物和蛹蟲草子實(shí)體在醫(yī)療和保健領(lǐng)域具有很大的發(fā)展空間，二者的進(jìn)一步開發(fā)利用將為人類的醫(yī)療事業(yè)乃至生態(tài)環(huán)境帶來(lái)一大進(jìn)步。

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Activity comparisonstudy onPaecilomyces Hepiali, Cordyceps Militaris and Wild Cordyceps Sinensis

JIANG Xue, WANG Chunyue, LI Lanzhou, WANG Xue, TENG Lirong, ZHOU Yulin*
(College of Life Science, Jilin University, Changchun 130012, China)

Objective Cordyceps sinensis is a rare medicinal resource in our country which has a wide range of pharmacological activities. But natural Cordyceps sinensis has less yield and large market demand, which becomesan endangered resources. We can protect Cordyceps sinensis by studying Paecilomyces hepialid and chinese caterpillar fungus, which have similar chemical composition and pharmacological effects with Cordyceps sinensis. Methods Compare Paecilomyces hepialid and Cordyceps Militaris with Wild Cordyceps Sinensis on active components, antifatigued action, immuno-enhancing activity and in vitro hypoglycemic activity. Results All of this three caterpillar funguses have polysaccharides, adenosine and cordycep, moreover, the content of cordycep and polysaccharides in Paecilomyces hepialid and Cordyceps Militaris are equivalent with those in Cordyceps Sinensis; Cordyceps sinensis has great hypoglycemic activity, immuno-enhancing activity and anti-fatigued activity; Paecilomyces hepialid has great anti-diabetes activity and some anti-fatigued activity; Cortices militaris has great immuno-enhancing and antifatigued activity; And they all have no signifcant effect on mice’s autonomic activities, which indicates that they have no irritation on mice. Conclusion The pharmacological action of Paecilomyces hepialid and Cortices militaris is similar to that of Cordyceps sinensis, which has great potential for development.

Paecilomyces hepialid; Cordyceps Sinensis; Cordyceps Militaris; component content

R285.1

A

2095-6258(2017)04-0544-04

2016-11-02）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.04.010

吉林省“雙十工程”重大科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目“冬蟲夏草菌的發(fā)酵粉關(guān)鍵技術(shù)攻關(guān)及產(chǎn)品開發(fā)”（20130201006ZY）。

姜 雪（1994 -），女，碩士研究生，主要從事微生物與生化藥學(xué)研究。

*通信作者：周毓麟，男，碩士，電話-13756146186，電子信箱-zhouyl@jlu.edu.cn