王曉明,范慧康，劉 旸，溫得中

(1.吉林省人民醫(yī)院 病理科，吉林 長(zhǎng)春130021;2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130021；3.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021)

*通訊作者

靶向敲除WT1基因誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡

王曉明1,范慧康2，劉 旸2，溫得中3*

(1.吉林省人民醫(yī)院 病理科，吉林 長(zhǎng)春130021;2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130021；3.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021)

WT1(Wilms’ Tumor Gene 1)基因是一種與癌癥密切相關(guān)的基因，最早發(fā)現(xiàn)于腎母細(xì)胞瘤中[1]。WT1基因主要功能是調(diào)節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄后加工的過(guò)程，同時(shí)具有抑制細(xì)胞分裂和分化的功能[3,4]。有研究表明，在乳腺癌、急性髓系白血病、惡性黑色素瘤等疾病中，WT1均存在異常高表達(dá)的情況，提示W(wǎng)T1可能是誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要因素，抑制/沉默WT1基因的表達(dá)，將有望控制相關(guān)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[5]。

CRISPR/Csa9技術(shù)是第三代基因編輯工具，其原理是通過(guò)gRNA引導(dǎo)，利用Cas9蛋白靶向切割基因組DNA，進(jìn)而達(dá)到基因敲除的目的[6,7]。本研究利用CRISPR/Csa9技術(shù)，針對(duì)WT1基因的第一外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)gRNA，擬在人肺癌A549細(xì)胞中靶向敲除WT1基因，觀察WT1基因敲除對(duì)A549細(xì)胞的生物學(xué)影響、在分子水平上進(jìn)一步探索WT1基因與細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

人肺癌A549細(xì)胞和px459載體由北華大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院免疫教研室提供并保存。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。Bbs I，Solution I購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。Bcl-2，Bax，TP53，β-actin抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。質(zhì)粒試劑盒，DNA提取試劑盒，BCA定量試劑盒，嘌呤霉素，Trizol A+試劑，DH5α，2 × Taq Plus PCR Master Mix均購(gòu)自北京天根公司。熒光定量試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自杭州博日公司。蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京凱基公司。測(cè)序樣品送至吉林庫(kù)美公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后按1∶3傳代，每48 h換液。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%擬進(jìn)行電轉(zhuǎn)染、備用。

1.3 WT1敲除載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

分析人的WT1序列(http://asia.ensembl.org/index.html)：人的WT1基因有10個(gè)外顯子，編碼大約55 kDa的蛋白[2]。選擇第一外顯子區(qū)域，設(shè)計(jì)gRNA(http://crispr.mit.edu/)，gRNA序列見(jiàn)表1。利用Solution I將gRNA連接到px459載體中，并在大腸桿菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得的單克隆質(zhì)粒，送公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。

實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和敲除組兩組。待培養(yǎng)的A549細(xì)胞融合度達(dá)到70%，敲除組選擇鑒定正確的質(zhì)粒，進(jìn)行電轉(zhuǎn)染(BTX-ECM2001，電壓：300v 脈沖長(zhǎng)度：3 ms、脈沖次數(shù)：1次)。電轉(zhuǎn)染后24 h，加入嘌呤霉素，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，培養(yǎng)5天后，收取細(xì)胞備用。對(duì)照組以空載體轉(zhuǎn)染，其它條件同敲除組。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分析

選擇Annexin V-FITC PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，流式細(xì)胞儀(BD)分別對(duì)收取的敲除組及對(duì)照組細(xì)胞樣品進(jìn)行凋亡檢測(cè)分析，具體操作方法按說(shuō)明書(shū)。

1.5 DNA提取及鑒定

利用基因組DNA提取試劑盒分別對(duì)收取的敲除組及對(duì)照組細(xì)胞樣品進(jìn)行提取，擬用于沉默WT1基因的鑒定，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。以基因組為模板，采用2 × Taq Plus PCR Master Mix進(jìn)行擴(kuò)增。具體條件如下：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。紫外凝膠成像儀照相。WT1鑒定引物見(jiàn)表1。

1.6 RNA提取及qPCR分析

利用Trizol 法分別提取敲除組及對(duì)照組細(xì)胞樣品的RNA，擬用于qPCR分析，具體操作方法見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。將提取好的RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，參照其說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。qPCR使用熒光定量試劑盒，進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序采用三步法，具體條件為：①預(yù)變性，95 ℃，3 min；②變性為95 ℃，10 s，退火溫度為59 ℃，15 s，延伸為72 ℃，30 s。共計(jì)40個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)采集設(shè)置在延伸步驟中的72 ℃。③繪制融解曲線，設(shè)置為55 ℃，30 s。共計(jì)81個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每一個(gè)待檢測(cè)樣品均重復(fù)檢測(cè)三次，檢測(cè)數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計(jì)分析。凋亡相關(guān)基因引物見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCT公式計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 gRNA和qPCR引物

注：*,用于DNA鑒定；#,用于qPCR。

1.7 蛋白提取及Western Blot分析

利用蛋白提取試劑盒分別對(duì)收取的敲除組及對(duì)照組細(xì)胞樣品進(jìn)行蛋白提取，擬用于WesternBlot分析，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。從樣品中提取到的蛋白，利用BCA方法進(jìn)行蛋白定量。配制12%丙烯酰胺凝膠，120 V，90 min，電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、加入一抗(Bcl-2，Bax，P53)過(guò)夜、加入二抗，避光孵育1 h。以β-actin作為內(nèi)參，曝光拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1WT1基因靶向敲除表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

選擇人的WT1基因第一外顯子區(qū)域，設(shè)計(jì)gRNA進(jìn)行切割(圖1A)。Sanger測(cè)序結(jié)果顯示，3例細(xì)胞單克隆樣品均有不同程度的堿基缺失(圖1B)。凝膠電泳結(jié)果顯示，對(duì)照組與WT1敲除組均出現(xiàn)的明顯條帶(圖1C)。qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在A549細(xì)胞中，WT1敲除組表達(dá)顯著降低(P<0.01)(表2)。

A schematic diagram of gRNA targeting the WT1 gene loci; B Sanger sequencing of WT1;

2.2 靶向敲除WT1基因后，對(duì)人肺癌A549細(xì)胞細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)

流式細(xì)胞儀分析顯示，對(duì)照組的凋亡率為(9.23 ±0.6 %)，WT1敲除組凋亡率為(16.2±0.4%)，差異顯著(P<0.01)(圖2，表2)。

圖2 細(xì)胞凋亡分析

TestnConWT1?KOPvalueApoptosis39．233±0．622716．200±0．41630．0007?Bcl?2gene31．000±0．04080．575±0．08540．0041?Baxgene31．075±0．04791．400±0．08160．0139#TP53gene30．933±0．08820．785±0．40990．7416

*,P<0.01；#,P<0.05

2.3 相關(guān)凋亡基因和蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，WT1敲除組中Bcl-2的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，Bax表達(dá)上升(P<0.05)，而TP53表達(dá)差異并不顯著(表2)。Western Blot結(jié)果顯示，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax表達(dá)上升，TP53蛋白表達(dá)無(wú)變化(圖3)。

圖3 Bcl-2，Bax，P53蛋白表達(dá)

3 討論

WT1作為一種與癌癥密切相關(guān)的基因，一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，在乳腺癌、急性髓系白血病、腎母細(xì)胞瘤等腫瘤疾病中呈高表達(dá)[8]。抑制其過(guò)表達(dá)，可干擾腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡。在以往的研究中，通常使用RNA干擾的方法沉默WT1的表達(dá)[9,10]。但RNA干擾的方法本質(zhì)是在轉(zhuǎn)錄水平，也就是RNA水平進(jìn)行干預(yù)，因此并不能完全沉默目的基因[11]。與此相反，CRISPR/Csa9技術(shù)是在基因組水平對(duì)WT1進(jìn)行切割，這就導(dǎo)致WT1基因序列的改變，進(jìn)而引起基因功能的喪失[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇人肺癌A549細(xì)胞做為靶細(xì)胞，利用CRISPR/Csa9技術(shù)成功構(gòu)建WT1基因靶向敲除表達(dá)載體，擬用于轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，觀察敲除靶基因WT1后，人肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)展情況。

在成功獲得了低表達(dá)WT1基因的靶細(xì)胞后，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：在靶向敲除WT1基因后，人肺癌A549細(xì)胞凋亡顯著。這一結(jié)果與之前在HepG2[14]和人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞[15]的報(bào)道一致。

有學(xué)者研究報(bào)道，WT1的異常表達(dá)可能會(huì)影響B(tài)cl-2/Bax的表達(dá)[13]，這提示靶向敲除WT1基因后，A549細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制可能與Bcl-2/Bax等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)異常有關(guān)。qPCR及WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲除WT1后，A549細(xì)胞Bcl-2表達(dá)下降、Bax表達(dá)上升，但TP53并沒(méi)有變化。這提示靶向敲除WT1會(huì)影響凋亡基因Bcl-2/Bax的表達(dá)變化，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，靶向敲除WT1基因會(huì)引起靶腫瘤細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax表達(dá)發(fā)生變化，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這為進(jìn)一步研究WT1基因與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展及腫瘤治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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1007-4287(2017)08-1433-04

王曉明(1978-)，吉林省人民醫(yī)院病理科，助理研究員、醫(yī)學(xué)碩士。

2016-07-19)