黃美健 吳偉

谷氨酰胺對COPD患者外周血單個核細胞中p38MAPK、IL-8及IL-17影響的臨床研究

黃美健 吳偉

目的 通過觀察谷氨酰胺（Gln）對慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者外周血單個核細胞（PBMC）中p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）活性、IL-8及IL-17表達的影響，探討Gln在COPD患者治療中的抗炎作用機制。方法 將32例住院COPD急性加重期（AECOPD）患者設為AECOPD組，經治療后轉為穩(wěn)定期（SCOPD）再設為SCOPD組。收集兩組患者的PBMC，再平均分為加Gln干預的Gln組和不加Gln干預的空白對照組，另選擇16例健康體檢者為健康對照組。采用RT-PCR法檢測各組PBMC中p38MAPK、IL-8及IL-17的表達水平。結果 （1）AECOPD和SCOPD的空白對照組中p38MAPK、IL-8及IL-17的表達均高于健康對照組（均P＜0.05），且急性期增高更加顯著。（2）AECOPD的Gln組中p38MAPK、IL-8及IL-17的表達低于AECOPD空白對照組（均P＜0.01）；SCOPD的Gln組中p38MAPK、IL-8及IL-17的表達低于SCOPD空白對照組（均P＜0.05）。 結論 Gln可抑制COPD患者炎癥細胞中p38MAPK的活化并下調IL-8、IL-17的表達水平。

慢性阻塞性肺疾病 谷氨酰胺 p38絲裂原活化蛋白激酶 白介素-8 白介素-17

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，目前在世界范圍內的發(fā)病率和病死率均逐年增高，嚴重影響著患者的生命質量。急性加重和合并癥更加影響患者整體疾病的嚴重程度，因此深入探討COPD的發(fā)病機制，選擇有效藥物對COPD患者進行規(guī)范化治療，對減輕患者的病痛、延緩病情加重、降低病死率、提高生命質量具有深遠意義[1]。當前研究表明肺部炎癥反應仍是COPD發(fā)病的主要原因之一[2]，炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程與炎癥細胞活性密切相關，炎癥細胞的激活和轉錄是其關鍵環(huán)節(jié)，因此以抑制或阻斷炎癥細胞及促炎因子的活化環(huán)節(jié)為靶點，進而阻斷COPD的進展，以達到治療COPD的目的，是目前國內外研究的熱點。筆者通過觀察谷氨酰胺（glutamine，Gln）對COPD急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonarydisease，AECOPD）和COPD穩(wěn)定期（stable chronic obstructive pulmonary disease，SCOPD）患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38MAPK）、IL-8及IL-17表達水平的影響，進一步探討Gln在COPD治療中的抗炎作用機制，為臨床治療COPD提供新的思路和方法。

1 對象和方法

1.1.1 對象 選取2014年5月至2015年4月杭州市第三人民醫(yī)院呼吸內科住院患者中確診為AECOPD的患者32例，男17例，女15例，年齡56~78（73.2±6.7）歲；上述患者經常規(guī)治療10~20d后，病情穩(wěn)定后再設為SCOPD組；選取杭州市第三人民醫(yī)院同期健康體檢者16例作為健康對照組，男9例，女7例，年齡53~77（67.4±7.3）歲；經詳細詢問病史在近1個月內未患過其他疾病且不吸煙或已戒煙5年以上。所有納入研究的患者均簽署知情同意書，并經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。COPD組與健康對照組性別、年齡等一般情況的差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

1.2 納入與排除標準 納入標準：（1）符合2013年COPD診治指南修訂版[3]的診斷標準。（2）近2周內未接受過糖皮質激素治療（包括靜脈、口服或吸入用藥等）。（3）未高流量吸氧（吸氧濃度≤35%）及未行機械通氣。（4）不吸煙或已戒煙5年以上。排除標準：（1）患有嚴重心腦血管系統疾病、較嚴重的消化系統疾病、腎臟疾病、內分泌、血液系統疾病、惡性腫瘤和重大手術等。（2）合并有可致咳嗽、咳痰、氣短的其他疾病，如支氣管擴張、肺結核、矽肺、閉塞性細支氣管炎、彌漫性泛細支氣管炎等。

1.3 方法

1.3.1 實驗試劑及儀器 人淋巴細胞分離液（美國SIGMA公司）；無GInRPMI 1640細胞培養(yǎng)液、L-Gln、磷酸鹽緩沖液（美國GIBCO公司）；氯仿（美國Biotech公司）；TRIzol（加拿大BioBasic公司）；定量試劑盒Power國應用生物系統中國公司）；RT-PCR試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司，D2640A-CK101D]；Du-640紫外分光光度儀（美國Beckman公司）；CFX384 Real-timePCR儀、電泳系統Mini-Proten Tetra System、凝膠成像儀ChemiDoc XRS+System（美國Bio-RAD公司）。

1.3.2 PBMC的提取 清晨空腹抽取靜脈血5ml，置于肝素抗凝管中，加入5ml磷酸鹽緩沖液將靜脈血充分稀釋。室溫下，將4ml人淋巴細胞分離液加入15ml離心管，然后將稀釋后的10ml靜脈血緩慢地沿著管壁加入離心管，使其均勻的覆蓋在人淋巴細胞分離液上，緩慢地將離心管放入離心機內，以2 000r/min離心20min，離心后管自上而下依次為稀釋的血漿層、單個核細胞層、分離液層、紅細胞和粒細胞層，小心緩慢地吸取第2層單個核細胞，轉移到10ml離心管，加入5倍體積磷酸鹽緩沖液液洗滌，后1 000r/min離心10min，棄去上清液，相同條件重復洗滌1次，棄去上清液，位于最底部的沉淀為PBMC，0.4%臺盼藍染色，排除無活性的細胞，活細胞＞90%可采用。

1.3.3 實驗分組 采用無Gln RPMI 1640培養(yǎng)液將上述提取的PBMC調節(jié)細胞濃度至2.0×106個/ml，并接種于24孔培養(yǎng)板內，每孔加入細胞混勻液1ml，其中AECOPD組患者細胞混勻液隨機平均分成兩組：（1）Gln組：PBMC中加入終濃度為8mmol/L的Gln；（2）空白對照組：僅用無Gln RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。SCOPD組患者細胞混勻液隨機平均分成兩組：（1）Gln組：PBMC中加入終濃度為8mmol/L的Gln；（2）空白對照組：僅用無Gln RPMI 1640培養(yǎng)液。健康對照組僅用無Gln RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。所有細胞均在37℃含25%CO2溫箱里培養(yǎng)24h。

1.3.4 RT-PCR法檢測p38MAPK、IL-8及IL-17的表達 采用Real-time PCR法檢測。用Trizol法提取上述培養(yǎng)后細胞的總RNA，并測定RNA的濃度和純度。用RT-PCR試劑盒合成cDNA。PCR引物按照引物設計原則采用Primer 5.0和Beacon designer 7.8設計軟件設計，由上海生物工程有限公司負責合成，詳見表1。

表1 各目的基因引物序列

PCR反應條件：95℃，1min；40個循環(huán)：95℃15s；63℃25s（收集熒光）；熔點曲線分析55~95℃。20μl反應體系如下：雙蒸水8.0μlMix 10.0μl，上游和下游引物各 0.5μl，cDNA模板1.0μl。實驗樣本經定量PCR得到各反應孔循環(huán)數（Ct

值）后運用相對表達量△Ct或2-△△Ct進行相對定量結果分析。其中△Ct=目的基因Ct值－內參Ct值，△Ct值越大說明表達越低，△Ct值越小說明表達越高。

1.4 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 目的基因及內參電泳圖 實驗的電泳條帶和設計的擴增條帶長度全部符合擴增條帶為目的條帶（圖1），電泳圖中無雜質，表明RT-PCR擴增為特異性擴增；RT-PCR擴增顯示各個引物擴增產物熔點曲線圖（圖2），均具有單一主峰，表明引物RT-PCR擴增具有較強的特異性。

2.2 檢測PBMC中p38MAPK、IL-8及IL-17△Ct值變化

2.2.1 各組p38MAPK、IL-8及IL-17△Ct值的比較 見表2。

圖1 目的基因及內參電泳圖（a：p 3 8 M A P K；b：I L-8；c：I L-1 7；d：1 8 s r R N A；M：M a k e r；1~6各目的基因擴增條帶）

圖2 目的基因及內參擴增曲線圖（a：p 3 8 M A P K；b：I L-8；c：I L-1 7；d：1 8 s r R N A）

表2 各組p 3 8 M A P K、I L-8及I L-1 7△C t值的比較

由表2可見，無論是在AECOPD空白對照組還是在SCOPD空白對照組中，p38MAPK表達均高于健康對照組，且急性期更為顯著，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。IL-8和IL-17在AECOPD空白對照組和SCOPD空白對照組中的表達也高于健康對照組，且急性期更加顯著，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

2.2.2 經Gln干預前后各組p38MAPK、IL-8及IL-17△Ct值比較 見表3。

表3 經G l n干預前后p 3 8 M A P K、I L-8及I L-1 7△C t值比較

由表3可見，AECOPD組中用Gln干預的較未用Gln的PBMC中p38MAPK、IL-8及IL-17的表達均下降（均P＜0.01）；SCOPD組中用Gln干預的較未用Gln的PBMC中p38MAPK、IL-8及IL-17的表達均下降（均P＜0.05）。

3 討論

慢性炎癥過程一直被認為是COPD發(fā)生和發(fā)展的病理生理基礎[2]。IL-8是人體內重要的趨化因子，參與了COPD患者中性粒細胞的形態(tài)改變、趨化、脫顆粒等過程，同時又參與誘導氣道上皮細胞IL-8基因的表達，進而導致IL-8進一步的釋放，構成了氣道內的“炎性循環(huán)”[3]，在COPD的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。王彥霞等[4]發(fā)現，COPD急性期患者PBMC中的IL-8和TNF-α水平高于治療后組和對照組。也有學者發(fā)現在COPD小鼠的PBMC中，IL-6和IL-8的表達是顯著增加的，并且抑制p38MAPK通路可以減少IL-6和IL-8的表達[5]。IL-17主要由近年來發(fā)現的新型Th細胞Th17細胞所分泌，有研究表明IL-17可以調節(jié)氣道內中性粒細胞及肺巨噬細胞的趨化和激活，在COPD的發(fā)病中起到極為重要的作用[6]。Zhang等[7]發(fā)現在COPD患者肺組織中的CD4+細胞中IL-17的表達是顯著增加的。p38MAPK是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，作為細胞信號從細胞表面?zhèn)鬟f到細胞內部的重要信使，參與了應激條件下細胞的生長、分化、凋亡以及炎癥等過程。p38MAPK可被TNF-α、IL-8等炎癥因子以及各種氧化應激因子等所激活，影響細胞的轉錄、蛋白質合成以及細胞表面受體表達等過程[8]。Renda等[9]發(fā)現p38MAPK在COPD急性期患者肺泡巨噬細胞中表達是明顯高于健康對照組的，并且與患者的一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，FEV1）和一秒率（FEV1/forced vital capacity，FEV1/FVC）是呈負相關的。有研究表明，COPD患者的肺巨噬細胞和肺支氣管上皮細胞中 p38MAPK的表達是增加的，而使用p38MAPK抑制劑則可減少炎癥介質（TNF-α、IL-8）等的釋放[10]。近年來有學者發(fā)現p38MAPK通過減少IL-17的轉錄進而調控著腦脊髓炎的病理過程[11]。由此可見，p38MAPK通路作為炎性細胞活化、炎癥介質產生的重要的細胞通路，在COPD發(fā)病的炎癥機制中起著重要作用。因此以p38MAPK通路為靶點，選擇一種有效物質來抑制p38MAPK的活化，降低炎癥因子的表達，應該是治療COPD的一種新的思路和方法。

Gln是人體中的條件性必需氨基酸，具有廣泛的生物學活性，作為免疫系統的主要能量來源，在改善營養(yǎng)不良的COPD患者免疫功能上具有顯著效果。近年來有研究顯示,Gln能下調脂多糖（LPS）刺激下人體PBMC中多種炎癥因子的過度表達[12]。有研究報道Gln能抑制敗血癥小鼠的p38MAPK、NF-κB等通路的激活及細胞因子的表達，實驗組經過Gln治療后肺組織中TNF-α和IL-18的表達顯著降低[13]。Chang-Hoon Lee等[14]發(fā)現通過Gln的干預，可阻斷p38MAPK及其下游通路絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1（MKP-1）通路的激活，減少小鼠氣道內中性粒細胞的增殖和活化。筆者前期研究也發(fā)現Gln可以抑制COPD患者NF-κB的活化，并且可下調炎癥因子TNF-α的表達[16]。因此筆者分析，能否進一步從炎性反應的角度，通過應用Gln來抑制COPD患者肺組織中p38MAPK、IL-8及IL-17等炎癥因子的表達而實現其抗炎作用，從而達到改善和治療COPD，減輕患者痛苦的效果。

本研究采用RT-PCR法檢測經過 Gln干預的COPD急性期患者治療前后外周血PBMC中p38MAPK、IL-8及IL-17表達變化，發(fā)現p38MAPK、IL-8及IL-17在COPD患者炎癥細胞中存在表達，COPD患者治療前、后空白對照組較正常對照組表達量增高，且急性加重期高于穩(wěn)定期，揭示了p38MAPK、IL-8及IL-17在COPD患者的整個病程中長期存在，這也進一步證實了COPD是一種慢性氣道炎癥的實質。實驗結果還發(fā)現經Gln干預后的COPD急性期組和穩(wěn)定期組其p38MAPK、IL-8及IL-17表達顯著低于未予Gln干預的空白對照組，且急性加重期較穩(wěn)定期降低更明顯。證明Gln可抑制COPD患者PBMC中p38MAPK活化，并減少炎癥介質IL-8及IL-17的釋放。

目前國內外尚未見關于Gln對COPD患者PBMC中p38MAPK及IL-8及IL-17表達影響的研究報道。本研究結果表明COPD患者PBMC中分泌的p38MAPK、IL-8及IL-17參與了COPD炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展的整個過程；Gln能明顯抑制 COPD患者PBMC中p38MAPK的活化和降低IL-8及IL-17的表達，從而減輕COPD患者的氣道炎癥，改善患者的病情，減輕其痛苦，為臨床應用Gln治療COPD提供新的理論依據和方法。鑒于本研究限于離體細胞水平及樣本量的局限，有關Gln抗炎作用更深入的分子機制仍有待今后進一步擴大樣本量的臨床研究和發(fā)現。

[1] 中華醫(yī)學會呼吸病學分會慢性阻塞性疾病學組.慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)[J].中華結核和呼吸雜志,2013,36(4): 255-264.

[2] 肖建,杜春玲.慢性阻塞性肺疾病病因及發(fā)病機制研究進展[J].中國老年病學雜志,2014,34(11):3191-3194.

[3] 陶娟,陳虹.細胞因子在慢性阻塞性肺病發(fā)病中的作用[J].西部醫(yī)學, 2010,22(6):1122-1124.

[4]王彥霞,陳瑩,李慶威,等.COPD患者外周血單個核細胞中TNF-α、IL-8和IL-10的測定及意義[J].河北醫(yī)藥,2012,34(3):335-337.

[5] Hongxu W,Shifang Y,Xiaojie W,et al.IInterleukin-33/ST2 signaling promotes production of interleukin-6 and interleukin-8 in systemic inflammation in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease mice[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,450(1):110-116.

[6] Marla ines vargas-rojas,Alejandra raml′rez-vengas,Leonardo limo′n-camacho,et al.Increase ofTh17 cells in peripheralblood of patients with chronic obstructive pulmonary disease[J].Respiratory Medicine,2011,105(11):1648-1654.

[7] Zhang Jianquan,Chu Shuyuan,Zhong Xiaoning,et al.Increased expression of CD4+IL-17+cells in the lung tissue of patients with stable chronic obstructive pulmonary disease(COPD)and smokers[J].InternationalImmunopharmacology,2013,15(1):58-66.

[8] Chung K F.p38 mitogen-activated protein kinase pathways in asthma and COPD[J].Chest,2011,139(6):1470-1479.

[9] Renda T,Baraldo S,Pelaia G,et al.Increased activation of p38 MAPKin COPD[J].Eur Respir J,2008,31(1):62-69.

[10] Kate Gaffey,Sophie Reynolds,Jonathan Plumb,et al.Increased phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase in COPD lungs[J].Eur Respir J,2013,42(1):28-41.

[11] Kana Namiki,Hirofumi Matsunaga,Kento Yoshhika.Mechanism for p38α-mediated ExperimentalAutoimmune Encephalomyelitis[J],J BiolChem,2012,287(29):24228-24238.

[12] 王立明,王新穎,潘莉雅,等.谷氨酰胺抑制單個核細胞細胞因子過度表達的研究[J].腸外與腸內營養(yǎng),2010,17(1):29-31.

[13] Singleton K D,Wischmeyer P E.Glutamine attenuates inflammation and NF-kappaB activation via Cullin-1 deneddylation [J].Biochem Biophys Res Commun,2008,373(3):445-449.

[14] Chang-Hoon Lee,Hae-Kyoung Kim,June-MoKim.Glutamine Suppresses Airway Neutrophilia by Blocking Cytosolic Phospholipase A2 via an Induction of MAPK Phosphatase-1[J].The Journalof Immunology,2012,189(11):5139-5146.

[15] 周凌燕,黃美健,居建剛,等.谷氨酰胺對慢性阻塞性肺疾病患者外周血核因子κB及腫瘤壞死因子α表達的影響[J].中國新藥與臨床雜志,2013,32(11):918-920.

Effect of glutamine on p38MAPK,IL-8 and IL-17 expression in PBMC of patients with chronic obstructive pulmonary disease

HUANG Meijian,WU Wei.Department of Respiratory Medicine,Hangzhou Third People's Hospital,Hangzhou 310009，China

Chronic obstructive pulmonary disease Glutamine p38MAPK IL-8 IL-17

2 0 1 6-0 9-1 8）

（本文編輯：嚴瑋雯）

d o i：1 0.1 2 0 5 6/j.i s s n.1 0 0 6-2 7 8 5.2 0 1 7.3 9.1 5.2 0 1 6-1 4 5 1

3 1 0 0 0 9杭州市第三人民醫(yī)院呼吸科（黃美?。话不蔗t(yī)科大學杭州臨床學院呼吸科（吳偉）

黃美健，E-m a i l：h m e i j i a n@1 6 3.c o m

【 Abstract】 Objective To investigate the effects of glutamine on the p38MAPK,IL-8 and IL-17 expression in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)of patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD). Methods Thirty-two patients with acute exacerbation of COPD(AECOPD)and 32 patients with stable COPD(SCOPD)were enrolled in the study.Venous blood samples were collected and PBMCs were isolated.The patients were equally divided into the Gln intervention group and blank control group.Sixteen healthy subjects served as normal control group.The expression levels of p38MAPK,IL-8 and IL-17 in PBMCs were detected by real-time PCR.Results The expression of p38MAPK,IL-8 and IL-17 in AECOPD and SCOPD blank control groups were higher than those in normal control group(P＜0.05),while the difference was more marked in AECOPD blank control group.The expression of p38MAPK,IL-8 and IL-17 in AECOPD and SCOPD Gln groups were significantly lower than those in AECOPD and SCOPD blank control groups,respectively(P＜0.01,P＜0.05). Conclusion Glutamine may exert an anti-inflammatory role in COPD patients by inhibiting p38MAPK cell signaling pathway and reducing the expression of IL-8 and IL-17.