盧新剛，喻立煒，茍海昕，陳敬賢，吳燁琳，盛暉，王佳祿，朱鼎成

1.復旦大學附屬華東醫(yī)院，上海 200040；2.上海交通大學附屬瑞金醫(yī)院，上海 200025

一指禪推拿對坐骨神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)形態(tài)及功能的影響

盧新剛1，喻立煒1，茍海昕1，陳敬賢2，吳燁琳1，盛暉1，王佳祿1，朱鼎成1

1.復旦大學附屬華東醫(yī)院，上海 200040；2.上海交通大學附屬瑞金醫(yī)院，上海 200025

目的觀察一指禪推拿對坐骨神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)形態(tài)及功能的影響。方法 暴露坐骨神經(jīng)，用顯微持針器鉗夾坐骨神經(jīng)制作坐骨神經(jīng)損傷模型。SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和推拿組，假手術(shù)組暴露神經(jīng)但不夾持。造模7 d后，推拿組大鼠一指禪推法治療30 d，每日1次。30 d后，檢測大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）、右下肢運動功能指數(shù)（BBB），HE染色、免疫組化檢測和電鏡觀察大鼠患側(cè)坐骨神經(jīng)變化。結(jié)果 與模型組比較，推拿組可有效加快SFI恢復，升高BBB，促進坐骨神經(jīng)形態(tài)結(jié)構(gòu)恢復，S-100β蛋白含量升高，促進新生神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)生長及恢復。結(jié)論 一指禪推拿可有效促進大鼠坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)形態(tài)及功能恢復。

一指禪推拿；坐骨神經(jīng)損傷；大鼠

坐骨神經(jīng)損傷主要發(fā)生于幼兒、老年人等，其損傷后神經(jīng)的再生及功能恢復目前尚無特別有效的方法。一指禪推拿操作強調(diào)拇指指面吸定，以快速運動來治療疾病，臨床常用于治療坐骨神經(jīng)痛。然而，一指禪推拿對于神經(jīng)損傷的臨床和基礎(chǔ)研究較少，本實驗觀察一指禪推拿對大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型的神經(jīng)形態(tài)及功能的影響，為臨床應用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SPF級SD大鼠36只，雄性，鼠齡8周左右，體質(zhì)量 150～170 g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物許可證號 SCXK（滬）2013-2016，飼養(yǎng)于復旦大學附屬華東醫(yī)院上海市老年醫(yī)學研究所動物房，12 h/12 h晝夜交替光照，自由攝食飲水。大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為假手術(shù)組、模型組和推拿組，每組12只。

1.2 主要試劑與儀器

水合氯醛（上海凌峰化學有限公司），生理鹽水（上海海尼藥業(yè)有限公司），S-100β抗體（美國Abcam公司，ab11181）。透射電鏡（日本電子有限公司，JEM-1010），切片機[孚光精儀（中國）有限公司，HSK-205]，顯微鏡（尼康中國科技有限公司，E-200），肌電圖儀（武漢天鷹醫(yī)療設備有限公司，M-800C），萬分之一電子天平（上海利康有限公司，F(xiàn)A-114）。

1.3 造模

[1]方法制作大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，俯臥位固定，右側(cè)手術(shù)區(qū)（右側(cè)臀股交界處）剪毛、酒精消毒，沿坐骨神經(jīng)走行方向剪開大約1 cm，在梨狀肌下緣逐步探尋并暴露坐骨神經(jīng)，用顯微持針器鉗夾坐骨神經(jīng)干30 s，松開30 s，再夾30 s，造成神經(jīng)纖維全部斷裂。造模后鉗夾傷處坐骨神經(jīng)組織進行病理學檢查，HE染色顯示神經(jīng)外膜連續(xù)性已經(jīng)消失，神經(jīng)軸突發(fā)生明顯斷裂，電生理檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)有效刺激后無動作電位產(chǎn)生，判斷造模成功[2]。推拿組同模型組。假手術(shù)組采用同樣方法對大鼠進行預處理，暴露坐骨神經(jīng)，但不進行夾持，對神經(jīng)無損傷。

1.4 干預方法

推拿組：首先，對推拿醫(yī)師進行相關(guān)推拿訓練，采用一指禪推法（手握空拳，腕掌懸屈，拇指伸直，用拇指的指端、指腹和橈側(cè)偏峰面著力于穴位上，運用腕部的橫向來回擺動以帶動拇指關(guān)節(jié)的屈伸活動），要求能實現(xiàn)推拿操作規(guī)范化，達到直徑約5 mm大拇指末端接觸大鼠，頻率120次/min，接觸力度為4 N，待訓練合格后開始實驗。造模后第7日起，將大鼠固定于大鼠固定架上，參考《實驗針灸學》[3]進行穴位定位，選擇右側(cè)環(huán)跳（后肢髖關(guān)節(jié)后上緣）、陽陵泉（距后三里上外側(cè)5 mm，在腓骨頭前下方凹陷處）、足三里（腓骨小頭下約5 mm），待大鼠安靜后，按照上述推拿標準對上述穴位進行一指禪推拿，每穴2 min，并沿足少陽膽經(jīng)腰部及下肢循行部位一指禪推法移行4 min，注重緊推慢移，全部治療共計10 min。每日1次，共30次。模型組和假手術(shù)組無相關(guān)干預。

1.5 觀察指標

1.5.1 行為學檢測 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（sciatic functional index，SFI）為經(jīng)典反映坐骨神經(jīng)功能指標。參考文獻[4]制作紙箱（80 cm×10 cm×10 cm），行走道上鋪針式打印紙，用印盒將大鼠雙后足染色后在箱中直線行走，在紙上留下 3～4對足印，量取大鼠手術(shù)側(cè)足、正常側(cè)足的相應變量：足印長度（PL），足趾寬度（TS），中間足趾距離（IT）。兩側(cè)足區(qū)分：實驗足一側(cè)（experiment side，E），正常足一側(cè)（normal side，N）。當動物用足背行走或由于足攣縮無法測量PL、TS或IT時，則定PL＝80 mm、TS＝6 mm和IT＝6 mm。測量全部變量后，計算SFI[-38.3（EPLNPL）÷NPL＋109.5（ETS－NTS）÷NTS＋13.3（EIT－NIT）÷NIT－8.8]。SFI＝0為正常值，SFI≤-100為神經(jīng)完全斷離。

1.5.2 大鼠運動功能評價 大鼠右下肢運動功能恢復情況參考Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分[5]，最高分為21分，分數(shù)越高，運動功能越強。

1.5.3 坐骨神經(jīng)病理學形態(tài)觀察 HE染色觀察大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)[6]，石蠟切片染色5 min，脫水10 min，二甲苯透明2 min，中性樹脂封片，普通顯微鏡下觀察神經(jīng)組織特征、結(jié)構(gòu)完整度。S-100β是重要的參與神經(jīng)系統(tǒng)修復的蛋白，表達水平越高神經(jīng)修復活動越強，免疫組化觀察S-100β表達水平[6]。大鼠治療結(jié)束后，取出坐骨神經(jīng)，選取損傷段10 mm，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切成5 μm薄片。60 ℃恒溫箱中烘烤20 min，無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇梯度脫蠟各5 min，PBS洗3次×5 min，配制新鮮的3%甲醇-H2O2溶液，室溫封閉5 min，抗原修復，S-100β一抗37 ℃、孵育1 h，生物素二抗37 ℃、孵育20 min，添加SABC 37℃、孵育20 min，PBS洗4次×5 min，Diaminobezidin（DAB）染色20 min，75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度脫水各5 min，二甲苯透明2 min，封片，鏡檢，各組隨機抽取3張圖片，每張圖片隨機選取2個視野觀察S-100β蛋白表達，用Image-Plus6.0軟件對S-100β蛋白平均光密度進行半定量分析。

1.5.4 坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察 參考文獻[7]電鏡觀察各組大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)。取大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)損傷處10 mm，取新鮮組織2.5%戊二醛前固定2 h，再漂洗，1%鋨酸后固定1 h，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片定位，切片（50 nm），檸檬酸鉛染色。透射電子顯微鏡觀察有髓神經(jīng)纖維髓鞘、軸索、雪旺細胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)和分布情況。生物醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測量有髓神經(jīng)軸突直徑、髓鞘厚度。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

治療期間所有大鼠基本情況良好，正常攝食飲水，未發(fā)生活動減少、嘔吐、死亡等現(xiàn)象。

2.2 一指禪推拿對模型大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)的影響

治療前，推拿組和模型組較假手術(shù)組SFI明顯降低（P＜0.01）；治療 30次后，推拿組和模型組 SFI均上升，推拿組上升明顯，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠治療前后SFI比較（±s）

表1 各組大鼠治療前后SFI比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) 治療前 治療后假手術(shù)組 12 0 0模型組 12 -91.36±7.19** -78.25±5.26*推拿組 12 -93.01±6.56** -28.47±3.94#

2.3 一指禪推拿對模型大鼠運動功能評分的影響

治療前，推拿組和模型組較假手術(shù)組BBB評分明顯降低（P＜0.05）。經(jīng)治療30次后，模型組BBB評分較治療前略有上升，推拿組BBB評分上升明顯，與模型組比較差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠治療前后BBB評分比較（±s）

表2 各組大鼠治療前后BBB評分比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) 治療前 治療后假手術(shù)組 12 20.59±4.50 21.37±4.27模型組 12 8.05±2.16* 9.02±2.20*推拿組 12 7.93±2.04* 17.35±4.34#

2.4 坐骨神經(jīng)HE染色和S-100β蛋白免疫組化結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)緊密，無空泡，神經(jīng)外膜連續(xù)完整；模型組坐骨神經(jīng)有明顯的 Wallerian變性并伴隨髓鞘分解，神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)不完整，略有空泡，紡錘體細胞增殖，神經(jīng)纖維有重新連接，相鄰軸突退化，髓鞘塌陷，雪旺細胞有增殖；推拿組損傷坐骨神經(jīng)恢復明顯較好，空泡少，結(jié)構(gòu)相對完整，雪旺細胞增殖明顯，見圖1。S-100β表達水平與神經(jīng)組織損傷后修復強度直接相關(guān)，S-100β表達能促進損傷神經(jīng)軸突再生，促進坐骨神經(jīng)修復[8]，免疫組化結(jié)果顯示，模型組較假手術(shù)組 S-100β蛋白水平上升，推拿組S-100β蛋白水平上升明顯，見圖2。S-100β表達水平半定量結(jié)果見表3。

2.5 坐骨神經(jīng)電鏡觀察結(jié)果

治療后電鏡觀察結(jié)果顯示，假手術(shù)組髓鞘厚，神經(jīng)纖維致密，形態(tài)均勻，神經(jīng)纖維排列整齊；模型組神經(jīng)纖維密度下降明顯，形態(tài)不規(guī)則，髓鞘薄；與模型組比較，推拿組促進神經(jīng)纖維增生、形態(tài)恢復，髓鞘增厚。結(jié)果見圖3、表4。

圖1 各組大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)觀察（HE染色，×200）

圖2 各組大鼠坐骨神經(jīng)S-100β形態(tài)觀察（免疫組化染色，×200）

表3 各組大鼠坐骨神經(jīng)S-100β蛋白定量水平比較（±s，%）

表3 各組大鼠坐骨神經(jīng)S-100β蛋白定量水平比較（±s，%）

注：與假手術(shù)組比較，***P＜0.001；與模型組比較，##P＜0.01

組別 只數(shù) S -1 0 0 β假手術(shù)組 1 2 3 . 5 8 ± 0 . 6 5模型組 1 2 1 4 . 3 5 ± 4 . 1 9***推拿組 1 2 3 6 . 0 1 ± 6 . 5 6***##

圖3 各組大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)（×15 000）

表4 各組大鼠治療后坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學指標比較（±s）

表4 各組大鼠治療后坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學指標比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) 每個橫截面有髓軸突總數(shù)/（× 1 04） 有髓軸突平均直徑/ μ m 軸突與纖維直徑比假手術(shù)組 1 2 0 . 5 3 1 ± 0 . 0 5 2 4 . 9 6 2 ± 0 . 6 5 8 0 . 5 9 6 ± 0 . 0 8 4模型組 1 2 0 . 2 0 3 ± 0 . 0 3 2* 2 . 3 9 3 ± 0 . 2 3 5* 0 . 9 8 6 ± 0 . 0 7 8*推拿組 1 2 0 . 3 5 5 ± 0 . 0 1 7# 3 . 5 0 6 ± 0 . 3 7 4# 0 . 7 5 9 ± 0 . 0 7 0#

3 討論

推拿療法通過手法對人體體表的刺激及產(chǎn)生熱效應，從而加速氣血的運行，起到疏通經(jīng)絡、行氣活血的作用。一指禪推拿為一指禪治法的精華，即以拇指120次/min擺動的頻率持續(xù)作用于所施治的穴位，意圖以指代針，手到病除。手法應柔中寓剛，剛?cè)嵯酀匀岷蜑橘F，用力應深透、有節(jié)律且持久，以指代針、力透豀谷。

坐骨神經(jīng)損傷屬中醫(yī)學“痿癥”范疇，概因經(jīng)絡損傷、氣血經(jīng)脈阻滯、局部失養(yǎng)所致。根據(jù)針灸推拿學“治痿獨取陽明”和“經(jīng)脈所過，主治所及”的理論，治療應當選取足陽明經(jīng)和足少陽經(jīng)穴為主。同時，遵循穴位-神經(jīng)-肌肉相關(guān)取穴原則，選取環(huán)跳、陽陵泉、足三里為主要的施治穴位。環(huán)跳、陽陵泉為足少陽膽經(jīng)經(jīng)穴?！端貑?氣穴論篇》云：“環(huán)跳，足少陽、太陽二脈之會?！痹撗üπъ铒L化濕，可利腰腿、通經(jīng)絡，是治療腰痛、坐骨神經(jīng)痛的常用穴位[9]。陽陵泉，《靈樞?邪氣藏府病形》有“筋急，陽陵泉主之”，是與環(huán)跳配合治療腰腿疾患的要穴。其下為腓總神經(jīng)分為腓淺及腓深神經(jīng)處，支配腓腸肌，是坐骨神經(jīng)主要支配區(qū)域及下肢主要運動功能的靶點[10]。足三里為足陽明經(jīng)要穴，主司調(diào)補氣血，使血有所充，筋有所養(yǎng)，是治療一切下肢痿軟無力的要穴。

實驗結(jié)果表明，一指禪推拿施治于“環(huán)跳”“足三里”和“陽陵泉”，可有效促進大鼠損傷坐骨神經(jīng)恢復，提高損傷側(cè)肢體運動功能，促進損傷坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)修復，保持坐骨神經(jīng)形態(tài)完整，升高損傷坐骨神經(jīng) S-100β表達水平。既往推拿治療坐骨神經(jīng)損傷基礎(chǔ)研究多采用手法模擬治療儀，手法模擬了點、撥、揉等方法。本實驗中醫(yī)師經(jīng)統(tǒng)一培訓后，采用一指禪推拿對3穴推拿治療取得較好療效，表明一指禪推拿是主要的起效手法，確定主要施治穴位為足三里、陽陵泉和環(huán)跳。

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Effects of One Finger Massage on Nerve Morphology and Function of Sciatic Nerve Injury Rats

LU Xin-gang1, YU Li-wei1, GOU Hai-xin1, CHEN Jing-xian2, WU Ye-lin1, SHENG Hui1, WANG Jia-lu1, ZHU Ding-cheng1(1. Huadong Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China; 2. Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China)

ObjectiveTo study the effects of one finger massage on sciatic nerve injury rats. Methods The sciatic nerves were exposed, and the sciatic nerve was held by micro needles to make the sciatic nerve injury model. SD rats were randomly divided into sham-operation group, model group and massage group. In the sham-operation group, the sciatic nerves were exposed but not held. 7 d after the establishment of modeling, rats in massage group

one finger massage for 30 d. After 30 d, SFI and BBB of sciatic nerves were detected. HE staining, transmission electron microscope and immunochemistry assay were used to measure the changes of sciatic nerves. Results Compared with model group, massage group could speed up the recovery of SFI and increase BBB, promote the recovery of sciatic nerve morphology, increased protein level of S-100β, and enhance ultrastructure of newborn nerve growth and recovery. Conclusion One finger massage can effectively promote neurological and functional recovery after sciatic nerve injury in rats.

one finger massage; sciatic nerve injury; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.009

R247.4-03

A

1005-5304(2017)09-0035-04

2016-11-22）

（

2017-01-04；編輯：華強）

上海市科學技術(shù)委員會項目（13401907000）;上海市中醫(yī)藥“杏林新星”行動計劃（ZY3-RCPY-2-2031）