章登嵐， 趙以軍， 吳 剛， 程 凱

(湖北工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院 河湖生態(tài)修復(fù)與藻類(lèi)利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068)

不同來(lái)源溶藻菌的分離、鑒定及溶藻效果比較

章登嵐， 趙以軍， 吳 剛， 程 凱*

(湖北工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院 河湖生態(tài)修復(fù)與藻類(lèi)利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068)

為了探究從何種類(lèi)型的自然生境中更易分離得到溶藻微生物，采用高氏1號(hào)培養(yǎng)基分別從水庫(kù)底泥、湖泊底泥、農(nóng)田土壤、林地土壤等四種來(lái)源共36份樣品中分離了7 600株菌，并最終從中篩選得到了5株溶銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)的溶藻菌，其中4株為假單胞菌(Pseudomonassp.)，1株為黃桿菌(Flavobacteriumsp.)，5株菌溶藻效率的變化范圍為62%～95%。結(jié)果表明，當(dāng)采用高氏1號(hào)培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)基時(shí)，湖泊底泥和水庫(kù)底泥中的成功篩選概率最高，農(nóng)田土壤次之，而林地土壤中則難以篩選得到，假單胞菌是較容易篩選得到的溶藻菌。

溶藻微生物；銅綠微囊藻；假單胞菌；黃桿菌

水體富營(yíng)養(yǎng)化引起藍(lán)藻水華的頻發(fā)，造成嚴(yán)重的生態(tài)破壞及巨大的經(jīng)濟(jì)損失，藍(lán)藻毒素也對(duì)人類(lèi)健康有極大威脅[1]。微生物控藻技術(shù)安全、環(huán)保、有效，已備受關(guān)注[1]。溶藻細(xì)菌是能通過(guò)直接或間接方式抑制藻類(lèi)生長(zhǎng)或殺死藻類(lèi)的微生物。許多研究表明水華和赤潮的突然消亡可能與溶藻微生物的感染有關(guān)[2-5]。面對(duì)日益嚴(yán)重的水華問(wèn)題，在物理、化學(xué)和其他生物方法除藻技術(shù)仍存在諸多局限的情況下，采用微生物控藻技術(shù)控制水華和赤潮受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注[6-7]。目前報(bào)道的溶藻微生物大多分離自發(fā)生水華或赤潮的海洋或湖泊[8-12]。而土壤中的微生物種類(lèi)多，數(shù)量大，農(nóng)田土壤土質(zhì)肥沃，具備了微生物所需的營(yíng)養(yǎng)、空氣和水分，是抗生素生產(chǎn)菌的常見(jiàn)分離來(lái)源[13]。此外，Yamamoto等[14]從富營(yíng)養(yǎng)湖泊底泥中成功分離出了溶藻放線菌；Jia等[15]從林地土壤中分離得到了可抑制微囊藻的Trichaptumabietinum；梁锏文等[16]從發(fā)生水華的池塘邊土壤中分離到了高效溶藻的弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)。但目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道何種來(lái)源的環(huán)境樣品中更容易分離得到溶藻微生物。本研究比較了從水庫(kù)底泥、湖泊底泥、農(nóng)田土壤、林地土壤中篩選分離抑制銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)的溶藻微生物的分離效率，并對(duì)分離得到的溶藻微生物進(jìn)行了分類(lèi)鑒定和溶藻能力測(cè)試。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種 銅綠微囊藻(M.aeruginosa，F(xiàn)ACHB-905)，來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)。藻種活化后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度 25 ℃，光照強(qiáng)度 2 000 lx，光暗周期為12 h∶12 h 條件下培養(yǎng)，每天定時(shí)振蕩3～4 次。

1.1.2 菌種來(lái)源 收集湖北省內(nèi)3個(gè)水庫(kù)(棗陽(yáng)市華陽(yáng)河水庫(kù)、十堰市鄖西縣土門(mén)水庫(kù)、棗陽(yáng)市東郊水庫(kù))和4個(gè)湖泊(神龍架林區(qū)大九湖、武漢市關(guān)橋湖、武漢市后湖、武漢市魯湖)的表層底泥、湖北工業(yè)大學(xué)周邊18塊農(nóng)田(包括大蒜地、小麥地、小白菜地、大白菜地、上海青地、草莓地、油菜地、韭菜地、芭蕉地、蠶豆地、茼蒿地、棉花地、蘿卜地、芋頭地、生菜地、桃樹(shù)地、番薯地、芹菜地)和11個(gè)林地(梅花樹(shù)地、竹林地、杉樹(shù)地、雪松地、柳樹(shù)地、棕櫚地、槐樹(shù)地、櫻花樹(shù)地、梧桐樹(shù)地、石楠樹(shù)地、桂花樹(shù)地)的表層土樣，分別取2 g泥/土樣加入20 mL生理鹽水中，加玻璃珠震蕩搖勻。

1.1.3 培養(yǎng)基 銅綠微囊藻培養(yǎng)基：BG11培養(yǎng)基[17-18]；微生物培養(yǎng)基：高氏1號(hào)培養(yǎng)基[19]。

1.2 方法

1.2.1 分離純化微生物 采用平板劃線法從1.1.2所述的36個(gè)環(huán)境樣品中分離微生物。

1.2.2 溶藻能力測(cè)試 將純化后的菌落接種至高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基中，25 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，按1∶10的體積比接種至對(duì)數(shù)期的藻液中，觀察藻液是否出現(xiàn)黃化。為排除高氏1號(hào)培養(yǎng)基對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的影響，對(duì)照組為將高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基按1∶10的體積比添加至藻液中，陰性對(duì)照組為無(wú)任何添加的藻液。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和陰性對(duì)照組均設(shè)置3次重復(fù)，接種菌液后第5天取樣鏡檢計(jì)數(shù)藻細(xì)胞數(shù)。溶藻效率(%)=((Nck-N5)/ Nck)×100%，N5為第5天實(shí)驗(yàn)組的藻細(xì)胞數(shù)，Nck為第5天對(duì)照組的藻細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 溶藻微生物的鑒定 根據(jù)《一般細(xì)菌常用鑒定方法》[20]，用牙簽挑取培養(yǎng)48 h的菌落定容至100 μL的蒸餾水中作為模板，按照如下體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增: 0.2 μL TakaraTaq(15 U/μL)；2 μL 10×Buffer(提取緩沖液)；1.6 μL dNTP Mixture (2.5 mmol/L)；5.8 μL Template(模板)；0.2 μL上游引物(27F)；0.2 μL下游引物(1492R)；10 μL超純水。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s；56 ℃退火1 min；72 ℃延伸1.5 min；共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序，要求雙向測(cè)通，將拼接后的測(cè)序結(jié)果利用Blastn進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)均采用3次重復(fù)，數(shù)據(jù)分析采用SPSS進(jìn)行，均值比較采用單因素方差分析；制圖采用GraphPad Prism 5(誤差量用SD表示，n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶藻菌株的來(lái)源分析

本研究從不同來(lái)源的樣品中共分離了7 600株菌，其中5株能夠有效溶解銅綠微囊藻，見(jiàn)表1。

表1 溶藻菌的分離來(lái)源

由表1可見(jiàn)，水庫(kù)底泥中溶藻菌的篩選率較高，農(nóng)田土壤中的篩選率處于平均水平，而林地土壤中的篩選率則非常低。此外，溶藻菌的平均篩選率低于千分之一，說(shuō)明采用常規(guī)方法分離溶藻菌勢(shì)必需要消耗大量的人力物力。

2.2 菌株的鑒定結(jié)果

分離篩選得到的5株溶藻菌的16S rRNA測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，80%的溶藻菌為假單胞菌，其分離來(lái)源既可以來(lái)自底泥，也可以來(lái)自農(nóng)田土壤；20%的溶藻菌為黃桿菌，其分離來(lái)源僅為農(nóng)田土壤。此外，由于本研究分離得到的5株溶藻菌中僅1株菌(ALPLH4)來(lái)源于發(fā)生藍(lán)藻水華的水體中，其余4株則來(lái)源于農(nóng)田或非藍(lán)藻水華水體，說(shuō)明溶藻菌的分布與水華并無(wú)直接關(guān)聯(lián)，這可能與多數(shù)微囊藻溶藻菌的溶藻方式為分泌胞外溶藻物質(zhì)溶藻[14-16](而非寄生溶藻)有關(guān)。

表2 5株菌16S rRNA序列的Blastn比對(duì)結(jié)果

2.3 溶藻能力測(cè)試

由圖1可見(jiàn)，通過(guò)比較第0天和第5天的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和陰性對(duì)照組的藻細(xì)胞數(shù)明顯增加，說(shuō)明高氏1號(hào)培養(yǎng)基本身對(duì)銅綠微囊藻的影響不大，單因素方差分析也表明第5天的對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；而加入溶藻菌培養(yǎng)液后，各試驗(yàn)組的藻細(xì)胞數(shù)的含量則明顯降低，第5天的溶藻效率的波動(dòng)范圍為62%～95%，單因素方差分析也表明，第5天時(shí)各實(shí)驗(yàn)組的藻細(xì)胞密度均顯著低于第5天的陰性對(duì)照組(P<0.05)。而對(duì)比各實(shí)驗(yàn)組第5天的藻細(xì)胞密度與第0天的陰性對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)除ALPYC2組外均顯著下降(P<0.05)，說(shuō)明ALPYC2只具備抑制微囊藻生長(zhǎng)的能力，而其余4株菌則具有溶藻能力，其平均溶藻效率高達(dá)89.7%。

圖1 5株菌的溶藻能力Fig.1 Algicidal ability of the 5 strains

3 討 論

溶藻微生物一般從富營(yíng)養(yǎng)化的海洋、湖泊、池塘或土壤等樣品中分離[2,21-27]。本研究從4種不同來(lái)源的36個(gè)樣品中分離到7 600株細(xì)菌，從中篩選得到5株溶藻菌(其中4株菌為假單胞菌)，其中3株來(lái)自農(nóng)田土壤，其余2株則分別來(lái)自湖泊底泥和水庫(kù)底泥，這些菌的溶藻效率的波動(dòng)范圍為62%～95%。焦一瀅等[28]從湖泊附近土壤中分離得到1株具有溶藻能力的真菌，溶藻效率為82%，張文藝等從太湖支浜底泥中篩選1株芽胞桿菌對(duì)銅綠微囊藻的去除率達(dá)到97.18%[29]，這些溶藻菌的分離來(lái)源及溶藻效果與本研究結(jié)果類(lèi)似，由此可見(jiàn)從湖泊底泥、水庫(kù)底泥和農(nóng)田土壤中更易分離得到具有較強(qiáng)溶藻能力的微生物。此外，考慮到溶藻菌的分離概率低于千分之一，有必要研發(fā)高通量的溶藻菌篩選方法以提高篩選效率。

相關(guān)研究表明，常見(jiàn)的溶解銅綠微囊藻的微生物多數(shù)來(lái)源于富營(yíng)養(yǎng)化的水體[30-38]，其次是土壤[15,28,39]，從水培植物的種植系統(tǒng)[7]、富營(yíng)養(yǎng)化湖泊底泥[40]、鹽田水域[11]也能篩選得到溶藻微生物，其中，具有溶藻能力的假單胞菌報(bào)道較多，說(shuō)明其較容易分離得到，這與本研究的結(jié)果相吻合。

綜上所述，本研究采用高氏1號(hào)作為分離培養(yǎng)基，從湖泊底泥、水庫(kù)底泥和農(nóng)田土壤中均分離得到能夠有效溶解銅綠微囊藻的假單胞菌，但采用傳統(tǒng)方法篩選溶藻微生物的成功率極低，需要開(kāi)發(fā)高通量的溶藻微生物篩選技術(shù)。

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Isolation and Identification of Algae-Lysing Microbes from Different Resources and Comparison of Their Algicidal Efficiency

ZHANG Deng-lan, ZHAO Yi-jun, WU Gang, CHENG Kai

(KeyLab.ofEco-Remediat′nofLakes&Rivers&AlgalUtilizat′nofHubeiProvince，Coll.ofRes. &Environm′tEngin.,HubeiUni.ofTechnol.,Wuhan430068)

In order to probe deeply into which type of natural habitat is easier to isolate algae-lysing microorganisms, 36 samples were collected from reservoir sediments, lake sediments, farmland soil or woodland soil, and 7 600 microorganism strains were separated from this samples adopting Gause 1 medium. 5 algae-lysing strains againstMicrocystisaeruginosawere finally screened, among them 4 strains arePseudomonassp. and 1 strain isFlavobacteriumsp..The algae-lysing efficiency of the 5 strains ranged from 62% to 95%. The results showed that when using Gause 1 medium to isolate algae-lysing microorganisms, lake and/or reservoir sediments, and followed by farmland soil, were the best isolation sources, while woodland soil is not easy to screen. The results also indicated thatPseudomonassp. is the easiest algae-lysing microorganism to screen from.

Algae-lysing microorganism;Microcystisaeruginosa;Pseudomonas;Flavobacterium

湖北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BCB037)；武漢市科技攻關(guān)項(xiàng)目(2014060101010061)

章登嵐 女，碩士研究生。主要研究方向?yàn)槿茉逦⑸?。Tel: 027-59750635，E-mail:zdl_2966@qq.com

* 通訊作者。男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師。主要研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物學(xué)。Tel: 027-59750635，E-mail:chengkaicn@163.com

2016-06-02；

2016-07-28

Q93-331; X172

A

1005-7021(2017)03-0100-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.016