劉靜靜

摘要：建立了呋喃它酮代謝物（AMOZ）在動物源性食品中殘留的酶聯(lián)免疫吸附檢測法（ELISA）。本研究應用雜交瘤技術制備抗呋喃它酮代謝物的衍生物（CPAMOZ）單克隆抗體，測定單抗特性，并初步應用于AMOZ的ELISA方法檢測。融合后得到1株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株AMOZ-2F7，應用于酶聯(lián)免疫吸附法，在0.0975—6.25μg/L范圍內(nèi)呈較好的線性，半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）為1.011μg/L，與其他幾種結構類似物無交叉反應。本研究建立了AMOZ檢測的ELISA方法，可以實現(xiàn)樣品的快速檢測。

關鍵詞：呋喃它酮代謝物；單克隆抗體；酶聯(lián)免疫吸附法

1主要試劑及儀器

HAT，HT，鼠單抗分型試劑盒，Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司；SP2/0細胞，本實驗室保存。其他試劑均為國產(chǎn)分析純；二氧化碳培養(yǎng)箱，日本三洋；凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；酶標儀，美國Bio-TEK；96孔、24孔培養(yǎng)板，Cost～公司。CPAMOZ-BSA、CPAMOZ-OVA本研究室自制。

2實驗方法

2.1單克隆抗體的制備及特性鑒定

CPAMOZ-BSA免疫Balb/C小鼠共4次，ELISA方法檢測血清，選擇效價高、敏感性好的小鼠用于融合。經(jīng)篩選、亞克隆，建立穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株，并擴大培養(yǎng)，誘生腹水，經(jīng)辛酸一硫酸銨沉淀法純化，-20℃保存。對單克隆抗體的效價、敏感性、亞型進行測定。

2.2ELISA方法的優(yōu)化

2.2.1抗原抗體最適濃度的確定

采用方陣滴定法，橫向用梯度濃度的包被原包被，縱向加入倍比稀釋的單克隆抗體，用間接ELISA法測定吸光度值。

2.2.2抗原抗體最適反應時間的選擇

本研究選用10min、20min、30min、45min、60min作為一抗的作用時間，用間接競爭ELISA法測定IC₅₀值，選擇最佳反應時間。

2.2.3標準曲線的制作

采用最佳ELISA工作條件，加入系列稀釋的NPAMOZ，用間接競爭ELISA法測定吸光度值。

2.2.4特異性的測定

采用競爭ELISA分別檢測抗AMOZ單克隆抗體與其他幾種結構類似物的交叉反應，計算交叉反應率（Cross reaction，CR），CR=（NPAMOZ的IC₅₀/結構類似物的IC₅₀）×100。根據(jù)CR值判定單抗的特異性。

3結果與討論

3.1單抗的制備及特性鑒定

融合后經(jīng)篩選得到1株穩(wěn)定分泌抗體且特異性較好的細胞株，命名為2F7。腹水純化后經(jīng)檢測，效價達到1：1×106。用間接競爭ELISA檢測，繪制標準抑制曲線，計算半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（IC₅₀）為1.084μg/L。單抗亞型經(jīng)測定，與IgG1二抗反應的吸光度值最高，證明抗體為IgG1型。

3.2ELISA方法的優(yōu)化

3.2.1抗原抗體工作濃度的確定

按抗原抗體1：40000、1μg/mL，1：20000、0.5μg/mL，1：10000、0.25μg/mL 3組濃度，用間接競爭ELISA檢測。隨著包被濃度的降低，抑制曲線在上移，IC₅₀值在上升，抗體1：40000和1：20000的曲線比較接近，且抗體1：20000時線性較好，綜合考慮，選擇抗原0.5μg/mL、抗體1：2萬作為AMOZ的ELISA法最佳抗原抗體濃度。

3.2.2抗原抗體反應時間的選擇

隨著抗體和抗原作用時間的增加，抑制曲線呈下移趨勢，且45-60min變化不大，綜合考慮，選擇線性較好的45min，作為AMOz間接競爭ELISA的一抗作用時間。

3.2.3標準曲線的制作

按照ELISA最佳工作條件，以NPAMOZ為橫坐標，以B/B0（B代表不同濃度標準品的A_450mm，B0代表陰性對照的A_450mm）為縱坐標，繪制抗體的抑制曲線。如圖1所示，AMOZ ELISA試劑盒在O.0975-6.25pg/L范圍內(nèi)呈線性，IC50=1.01log/L，線性方程Y=-0.399X+0.5019，R2=0.992。

3.2.4特異性的測定

采用間接競爭ELISA法檢測，AMOZ-2F7抗體與NPAHD、NPAOZ、NPSEM、4-CBA的交叉反應率均小于0.01%，證明單抗與其他幾種結構類似物不發(fā)生反應，該方法具有很高的特異性。

4結論

呋喃它酮屬于小分子物質(zhì)，沒有免疫原性，所以在抗體制備過程中用對羧基苯甲醛將其衍生成CPAMOZ，再通過活化酯法將其衍生物與大分子載體蛋白進行連接，使其具備免疫原性。小分子抗原在雜交瘤細胞篩選過程中常出現(xiàn)效價高、敏感性差的結果。本實驗用不同批次免疫原多次免疫、多次融合，以提高分泌強陽性、高抑制抗體的融合細胞數(shù)量。經(jīng)過篩選，最終得到1株穩(wěn)定分泌抗體的細胞，單抗AMOZ-2F7經(jīng)檢測，效價達到1：1×10⁶。將該抗體應用于ELISA方法檢測，在0.0975-6.25μg/L范圍呈現(xiàn)較好線性，ICso為1.011μg/L，與其他結構類似物無交叉反應。本研究得到的抗體特異性好、敏感性高，建立了ELISA檢測方法，呈現(xiàn)較好性能，為免疫學檢測技術研究和動物源性食品中獸藥殘留的快速檢測奠定了基礎。

（作者單位：河北省科學院生物研究所）