桑楠,岳慧峰

(山西大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院,山西 太原 030006)

冬季細顆粒物對人支氣管上皮細胞的毒性效應(yīng)

桑楠,岳慧峰

(山西大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院,山西 太原 030006)

細顆粒物(PM2.5)作為冬季多發(fā)的霧霾的主要組成成分,對人呼吸系統(tǒng)有嚴重的毒害作用。實驗采集太原地區(qū)冬季PM2.5,考察其對人支氣管上皮細胞系(BEAS-2B)的毒性效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),處理組細胞內(nèi)能明顯觀察到顆粒物沉積,細胞器結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變,說明PM2.5中超微顆粒能夠進入細胞并且會影響B(tài)EAS-2B細胞中細胞器結(jié)構(gòu)。PM2.5處理細胞后,細胞活性氧自由基(ROS)含量隨著PM2.5濃度的增高而增加,且在30 μg/mL時達到最大。進一步研究發(fā)現(xiàn),細胞超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的含量隨著PM2.5濃度的增高而減少,并在30 μg/mL濃度時,SOD的含量下降為對照組的51.02%,GPX的含量下降為對照的54.10%。另外,細胞培養(yǎng)液中白介素6(IL-6)和IL-8的含量隨著PM2.5濃度的增高而增高,并在30 μg/mL濃度時,IL-6的含量達到對照組的3.18倍,IL-8的含量達到對照的1.90倍。在PM2.5暴露條件下,PM2.5能夠引起細胞發(fā)生氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng),并能抑制抗氧化酶的蛋白表達。

PM2.5;ROS;抗氧化酶;炎性

細顆粒物(PM2.5)是指粒徑小于2.5 μm的顆粒物,也稱之為可吸入顆粒物。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道,每年室外空氣污染引起的過早死亡人數(shù)將近370萬人,其中80%死于心臟病或者中風(fēng),而暴露于PM2.5所引起的呼吸系統(tǒng)疾病以及癌癥導(dǎo)致的死亡人數(shù)占20%[1]。在我國華北地區(qū),作為冬季多發(fā)的霧霾的主要組成成分,PM2.5的健康風(fēng)險也越來越受到重視[2]。大氣中的PM2.5表面攜帶許多有毒物質(zhì)(如多環(huán)芳烴,重金屬等),能長時間停留在大氣中與體表接觸,還能穿過鼻毛,深入呼吸道,積聚在肺部；同時，顆粒物上的有毒物質(zhì)可以通過氣體交換和血液循環(huán)而擴散[3]。流行病學(xué)顯示,PM2.5濃度的上升與心腦血管疾病以及呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率的升高顯著相關(guān)[4]。大量動物體內(nèi)以及體外細胞實驗研究也證明,PM2.5暴露能夠引起細胞氧化應(yīng)激以及炎性反應(yīng)[5-6]。

前人的實驗研究表明,污染物暴露后,細胞活性氧自由基(ROS)水平顯著升高,同時抑制抗氧化酶系統(tǒng)酶的表達,并導(dǎo)致炎性反應(yīng)發(fā)生[7-8]。ROS是細胞氧化代謝的天然副產(chǎn)物,在調(diào)節(jié)細胞存活,細胞死亡,分化,細胞信號傳導(dǎo)和炎癥相關(guān)因子產(chǎn)生中起重要作用[9]。在各種生理狀態(tài)下,ROS作為中間體產(chǎn)生,受到各種解毒酶(如超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和過氧化氫酶(CAT))或不同的抗氧化劑(包括黃酮,抗壞血酸,維生素E和谷胱甘肽(GSH))的影響[10]。ROS既是信號分子，又是炎癥介質(zhì)。炎癥反應(yīng)可以由污染物引發(fā),而ROS的產(chǎn)生也會引起炎癥反應(yīng),并反過來進一步刺激產(chǎn)生ROS[11]。炎癥反應(yīng)中常見的促炎因子有IL-6,IL-8以及IL-1β等。為此,本研究采集太原市小店區(qū)冬季PM2.5,通過對人支氣管上皮細胞進行不同濃度PM2.5染毒,研究PM2.5對細胞氧化應(yīng)激、抗氧化酶和炎性反應(yīng)的影響,考察PM2.5的生物毒性作用,為PM2.5污染健康風(fēng)險評價提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 PM2.5的采集以及懸液的制備

采樣前,將采樣膜在450℃烘箱中烘干12 h,烘干后在室溫平衡24 h,最后對采樣膜稱重。用TH-150C中流量采樣器采集冬季PM2.5顆粒物,采樣時間段為2012年11月1日至2013年2月28日,流速為100 L/min,每天采樣22 h。采樣結(jié)束后,將采樣膜包被在鋁箔紙4℃保存?zhèn)溆?。在進行實驗之前,將采樣膜剪碎浸泡在適量超純蒸餾水中,超聲震蕩3次,每次震蕩20 min,待膜上顆粒物完全震蕩分離后,用6層紗布過濾多次,收集濾液置于真空冷凍干燥器中干燥至水分完全揮發(fā),收集顆粒物備用。

1.2 人支氣管上皮細胞系(BEAS-2B)細胞的培養(yǎng)及PM2.5暴露

BEAS-2B細胞系購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。將細胞培養(yǎng)在含有體積濃度為10%胎牛血清,100 U/mL鏈霉素以及100 U/mL青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,培養(yǎng)溫度為37℃,濕度為95%,CO2體積分數(shù)為5%。傳代時,取對數(shù)生長期的BEAS-2B細胞,吸去培養(yǎng)液,PBS沖洗兩次,吸去PBS,加胰酶進行消化,消化完畢后,加入預(yù)熱含有胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化,用吸管反復(fù)吹打細胞懸液,確保細胞密度均勻。普通傳代細胞在25 mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),進行細胞實驗時在35 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

PM2.5暴露前,將PM2.5溶于滅菌的生理鹽水中配成不同濃度梯度懸濁液備用。將細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿24 h后,現(xiàn)用現(xiàn)配上述懸濁液,對細胞進行24 h染毒處理(0,1,3,10,30 μg/mL)。每個處理組做3個平行。

1.3 電鏡觀察

將細胞以5×105個/mL濃度接種在培養(yǎng)皿24 h后,用30 μg/mL PM2.5染毒處理24 h,染毒時間完畢后用胰酶消化細胞并將細胞收集于滅菌的2 mL塑料EP管中,離心后用滅菌的PBS洗3次后,收集細胞片用含有體積分數(shù)1%戊二醛和體積分數(shù)4%甲醛的0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH=7.4)固定,用體積分數(shù)2.5%的四氧化鋨后固定處理1 h。最后乙醇梯度脫水、滲透、包埋,切片后用醋酸鈾及枸椽酸鉛雙染色,在80 kV的條件下使用JEM-1011型透射電鏡觀察拍片。

1.4 活性氧自由基ROS檢測

將細胞以5×105個/mL濃度接種在培養(yǎng)皿24 h后,不同濃度PM2.5分別染毒處理24 h。處理時間到后,收集細胞,PBS洗2次,用不含血清的培養(yǎng)基重懸,使用DCFH-DA熒光探針37℃下避光孵育30 min。然后PBS清洗細胞3次,PBS重懸后用流式細胞儀(C6,BD,美國)在530 nm發(fā)射波長和488 nm激發(fā)波長下檢測熒光強度,每次試驗收集10 000個細胞。

1.5 蛋白檢測

將細胞以5×105個/mL濃度接種在培養(yǎng)皿24 h后,不同濃度PM2.5分別染毒處理24 h。處理時間到后,收集細胞,PBS洗2次,洗凈后加入蛋白裂解液100 μL,然后收集細胞并在冰盒中使用玻璃勻漿器對細胞懸液進行充分勻漿,勻漿后收集于1.5 mL塑料離心管并使用1 mL注射器吹打數(shù)次,完成后冰上裂解5 min,待細胞裂解完全后離心15 min(4℃,13 000 r/min),收集上清。上清一部分用考馬斯亮藍法測定其中的蛋白含量。

將100 μg樣本作為上樣量加入到硫酸二辛酯-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中電泳,然后將凝膠膜電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。然后用質(zhì)量濃度3%牛血清白蛋白(BSA)封閉,分別加入SOD2,GPX以及CAT蛋白抗體(1∶200稀釋)并在4℃下孵育過夜。孵育完成后用PBS洗膜3次并用熒光二抗(1∶5 000稀釋)孵育2 h。用近紅外雙色激光成像系統(tǒng)Odyssey(LI-COR,美國)掃膜,并用IPwin32軟件處理系統(tǒng)分析目標條帶的光密度值。最終結(jié)果用目的蛋白與β-actin的光密度比值來表示。

1.6 炎性因子IL-6和IL-8檢測

將細胞以5×105個/mL濃度接種在培養(yǎng)皿24 h后,不同濃度PM2.5分別染毒處理24 h。收集細胞培養(yǎng)上清液,一部分用考馬斯亮藍法測定其中的蛋白含量,其余部分根據(jù)上海西唐生物科技有限公司IL-6、IL-8 ELISA試劑盒檢測樣本中IL-6和IL-8炎性因子含量。

1.7 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤差。使用單因素方差分析(ANOVA)以及Fisher最小顯著差異(LSD)檢驗來確定所有處理組與對照組差異。當P<0.05時認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用Origin 8.0進行數(shù)據(jù)分析和圖形生成。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5在BEAS-2B細胞中的沉積

如圖1所示,PM2.5處理細胞24 h后,與對照組相比,處理組細胞內(nèi)能明顯觀察到顆粒物沉積,細胞器結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變,說明PM2.5中超微顆粒能夠進入細胞并且會影響B(tài)EAS-2B細胞中細胞器結(jié)構(gòu)。

Fig.1 Deposition of PM2.5 with lower diameter in cells and its effect on organelle structure(The arrow indicates the deposition of ultrafine particles in PM2.5 in the cell)圖1 PM2.5在細胞內(nèi)的沉積以及對細胞器結(jié)構(gòu)的影響(箭頭表示PM2.5中超微顆粒在細胞內(nèi)的沉積)

2.2 PM2.5暴露對BEAS-2B細胞ROS的影響

如圖2所示,PM2.5處理細胞后,細胞ROS含量隨著PM2.5濃度的增高而增加,且在30 μg/mL時ROS熒光強度達到最大。這說明,PM2.5能夠引起細胞ROS水平顯著上升,導(dǎo)致細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。

Fig.2 Effects of PM2.5 exposure on ROS in BEAS-2B cells (*** P<0.001,vs. control)圖2 PM2.5暴露對BEAS-2B細胞ROS的影響(與對照組相比,*** P<0.001)

2.3 PM2.5暴露對BEAS-2B細胞抗氧化酶的影響

為了進一步考察PM2.5處理細胞后的氧化應(yīng)激反應(yīng),也對幾種抗氧化酶蛋白表達進行了分析。如圖3所示,PM2.5處理細胞后,細胞SOD和GPX的含量隨著PM2.5濃度的增高而減少,并在30 μg/mL濃度時,SOD的含量下降為對照組的51.02%,GPX的含量下降為對照的54.10%。但是CAT的含量僅在3 μg/mL濃度時有顯著下降說明,PM2.5能夠抑制細胞內(nèi)抗氧化酶的表達。

Fig.3 Effects of PM2.5exposure on antioxidant enzymes in BEAS-2B cells(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,vs. control)圖3 PM2.5暴露對BEAS-2B細胞抗氧化酶的影響(與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)

2.4 PM2.5暴露對BEAS-2B細胞炎性反應(yīng)的影響

如圖4所示,PM2.5處理細胞后,細胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-8的含量隨著PM2.5濃度的增高而增高,并在30 μg/mL濃度時,IL-6的含量達到對照組的3.18倍,IL-8的含量達到對照的1.90倍，說明,PM2.5能夠?qū)е录毎l(fā)生炎性反應(yīng)。

Fig.4 Effects of PM2.5exposure on inflammatory response of BEAS-2B cells(*P<0.05, ***P<0.001, vs. control)圖4 PM2.5暴露對BEAS-2B細胞炎性反應(yīng)的影響(與對照組相比,*P<0.05,***P<0.001)

3 討論

PM2.5對人體健康產(chǎn)生巨大威脅,而呼吸系統(tǒng)作為首當其沖的靶器官受其影響尤甚,實驗研究表明PM2.5與呼吸系統(tǒng)疾病與日俱增,其中氧化應(yīng)激以及炎性反應(yīng)是其介導(dǎo)臟器損傷的重要途徑[3]。BEAS-2B細胞(永生化的人支氣管上皮細胞),其作為肺部疾病發(fā)生和生物毒性研究的良好細胞模型,廣泛地應(yīng)用于生物和毒理學(xué)研究中[12-13]。

氧化應(yīng)激是指在有害刺激因素作用下,活性氧自由基ROS產(chǎn)生過多或發(fā)生代謝障礙,細胞體內(nèi)氧化及抗氧化體系失衡,導(dǎo)致細胞的生理生化及代謝功能障礙[14]。機體內(nèi)存在著氧化和抗氧化這兩大系統(tǒng),兩個系統(tǒng)共同存在于機體中既相互制約又相互依存?？寡趸到y(tǒng)包括抗氧化酶類；包括SOD、CAT、GPX等;抗氧化非酶類:硫基蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,TRF)、銅藍蛋白 (ceruloplasmin,CER)、維生素C、N-乙酰半胱氨酸、一些水溶性及脂溶性的抗氧化物質(zhì)等。SOD能將超氧化物(O2-)自由基分解為分子氧(O2)或過氧化氫(H2O2),GPX的生物化學(xué)功能是將脂質(zhì)氫過氧化物還原成其相應(yīng)的醇,并將游離過氧化氫還原成水,而CAT能催化過氧化氫分解成水和氧氣。本實驗中PM2.5處理細胞24 h后會明顯上調(diào)ROS的水平,并抑制抗氧化酶的表達。另一研究表明用0、12.5、25 μg/mL的PM2.5刺激BEAS-2B細胞4 h后,ROS水平明顯升高;刺激BEAS-2B細胞8 h后,細胞裂解液中脂質(zhì)過氧化指標MDA以及抗氧化酶SOD的含量顯著升高[15]。100和200 mg/L PM2.5處理MLE-12細胞3 h,胞內(nèi)ROS水平較細胞對照組顯著升高,分別升高 27.6%和 60.7%[16]。另外,還有研究表明太原市PM2.5暴露與大鼠肺泡巨噬細胞存活率、SOD和GSH-Px活性下降,MDA及ROS含量濃度升高相關(guān),且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系[17]。

除了氧化應(yīng)激機制之外,大量研究發(fā)現(xiàn) PM2.5亦能引起機體產(chǎn)生炎性反應(yīng),導(dǎo)致炎性因子,促炎因子等大量表達,形成級聯(lián)反應(yīng),從而對機體造成損傷[18-19]。炎性反應(yīng)是機體常見的一種反應(yīng),既是一種自我防御,但同時也會造成不同程度的自我損傷。促炎細胞因子是從諸如輔助性T細胞(Th)和巨噬細胞等免疫細胞以及促進炎癥的某些其它細胞類型中分泌的一種信號分子(細胞因子)。IL-6和IL-8是兩種典型的促炎細胞因子。本研究表明,PM2.5能夠誘導(dǎo)BEAS-2B細胞產(chǎn)生炎性因子IL-6和IL-8,并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)。太原市以及北京市收集的PM2.5能引起人肺上皮細胞產(chǎn)生炎性因子IL-6及其mRNA的表達增加,而且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系[20]。北京市PM2.5濃度升高及暴露時間延長可能導(dǎo)致機體炎癥反應(yīng)增強(IL-6、TNF-α水平升高),從而造成機體損害[21]，也有研究表明發(fā)動機尾氣顆粒物處理BEAS-2B細胞后能夠引起促炎因子IL-6,IL-8基因表達顯著上升[22]。

氧化應(yīng)激可以引起炎癥,炎癥也可以引起氧化應(yīng)激[11]。氧化應(yīng)激引起炎性方面:在“生理濃度”下,ROS作為調(diào)節(jié)細胞生長的信號分子,能影響細胞對其他細胞的粘附、分化、衰老和細胞凋亡;慢性或長期ROS的產(chǎn)生被認為是炎性疾病進展的核心[23]。例如超氧化物可以與NO結(jié)合形成過氧亞硝酸鹽等活性氮(RNS),而其結(jié)合速率是SOD將超氧化物歧化速率的3到4倍,同時,RNS又會引起亞硝化應(yīng)激,這增加了ROS引起的促炎癥反應(yīng)[24]。有研究表明,EC-SOD(在線粒體基質(zhì)和細胞外基質(zhì)表達的SOD,即SOD2)基因敲除小鼠對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的嗜中性粒細胞肺炎癥的敏感性增強[25]。也有研究報道在不同炎癥狀態(tài)下均發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽(GSH)含量降低,而GSH是GPX對H2O2解毒過程中的還原劑,這表明氧化應(yīng)激在炎癥反應(yīng)中的重要作用[26]。此外,LPS處理后,小鼠肺中CAT的表達和活性顯著降低。反過來,炎性也可以引起氧化應(yīng)激。在炎癥過程中,活化的吞噬細胞如嗜中性粒細胞和巨噬細胞產(chǎn)生大量的ROS,同時,非吞噬細胞也可以通過促炎因子而產(chǎn)生ROS[27]。例如已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在非小細胞肺癌,IL-6通過增加NADPH氧化酶4(NOX4)的表達而產(chǎn)生ROS[28]。以上研究結(jié)果暗示,ROS的產(chǎn)生可能會引起炎癥反應(yīng),而炎癥反應(yīng)反過來進一步刺激產(chǎn)生ROS,兩者相互影響相互促進。

4 結(jié)論

PM2.5處理BEAS-2B細胞后,能夠引起細胞ROS水平顯著上升并抑制抗氧化酶表達從而導(dǎo)致細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。同時,PM2.5暴露也會引起細胞炎性反應(yīng)。炎癥和氧化應(yīng)激與病理生理過程密切相關(guān)并緊密聯(lián)系,這些研究發(fā)現(xiàn)為進一步的PM2.5污染健康風(fēng)險評價提供理論依據(jù)。

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Toxic Effects of Fine Particulate Matter in Winter on Human Bronchial Epithelial Cells

SANG Nan,YUE Huifeng

(College of Environmental and Resource,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

As the main components of the haze in winter,fine particles (PM2.5) have been considered had a serious toxic effect on the human respiratory system.We collected PM2.5in a peri-urban residential site of Taiyuan and investigated the toxic effect induced by PM2.5. The results showed that PM2.5with lower diameter could enter and deposit in the BEAS-2B cells and affect the organelle structure,implying that PM2.5with lower diameter could pass through the membrane and act directly on the cells. The levels of reactive oxygen species (ROS) increased with the increase levels of PM2.5concentration,and reached the maximum at 30 μg/mL. Furthermore,the contents of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPX) decreased with the increase levels of PM2.5concentration. The content of SOD and GPXsignificantly decreased to 51.02% and 54.10% of the control at 30 μg/mL,respectively. Finally,the levels of IL-6 and IL-8 in the cell culture supernatant increased with the increase levels of PM2.5concentration,and the concentration of IL-6 and IL-8 reached 3.18 and 1.90 fold of that in the control group at 30 μg/mL,respectively. In conclusion,under the current PM2.5exposure conditions,PM2.5can cause oxidative stress and inflammatory response,and inhibit the expression of antioxidant enzymes in cells.

PM2.5;ROS;antioxidant enzyme;inflammation

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.03.029

2017-06-02；

2017-06-29

山西省青年三晉學(xué)者支持計劃；山西省回國留學(xué)人員科研資助項目(2015-006)

桑楠(1973-),女,山西長治人,博士，教授,主要從事環(huán)境毒理學(xué)研究。E-mail:sangnan@sxu.edu.cn

X131.1

A

0253-2395(2017)03-0615-07