周麗娜， 王洪新， 梁佩芬， 程 焱

α-硫辛酸對(duì)糖調(diào)節(jié)受損大鼠認(rèn)知功能和氧化應(yīng)激影響的初步研究

周麗娜1， 王洪新1， 梁佩芬1， 程 焱2

目的 研究硫辛酸對(duì)糖調(diào)節(jié)受損大鼠認(rèn)知功能和氧化應(yīng)激的影響。方法 雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，對(duì)照組、模型組、硫辛酸低[15 mg/(kg·d)]、中[30 mg/(kg·d)]、高[60 mg/(kg·d)]劑量組。用高脂高糖飼料飼養(yǎng)法建立糖調(diào)節(jié)受損大鼠模型，給予成功的大鼠模型連續(xù)每日灌胃硫辛酸溶液15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg，每日一次，共14 d。用Morris水迷宮法檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠海馬組織的ROS含量值。結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降(P<0.05)，海馬組織內(nèi)ROS水平升高(P<0.05)；與模型組相比，硫辛酸組腦內(nèi)ROS水平下降，大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力提高，尤以中劑量組改變明顯(P<0.05)。結(jié)論 α-硫辛酸對(duì)糖調(diào)節(jié)受損大鼠的認(rèn)知功能有保護(hù)作用，該保護(hù)作用與其抗氧化作用有關(guān)。

糖調(diào)節(jié)受損； α-硫辛酸； 認(rèn)知功能； 氧化應(yīng)激

糖尿病是產(chǎn)生認(rèn)知障礙的相對(duì)獨(dú)立而重要的危險(xiǎn)因素[1]。而研究表明，氧化應(yīng)激是引起糖尿病的發(fā)生及發(fā)展的重要因素[2]。糖調(diào)節(jié)受損(impaired glucose regulation，IGR)是糖尿病的前期狀態(tài)，目前對(duì)于糖調(diào)節(jié)受損階段的認(rèn)知障礙研究仍較少。α-硫辛酸(α-lipoic acid,ALA)是存在于線粒體α-酮酸氧化脫氫酶系中一個(gè)重要的輔助因子，作為強(qiáng)而有效的抗氧化劑被廣泛使用，主要通過(guò)清除體內(nèi)的氧自由基和動(dòng)員機(jī)體內(nèi)源性的抗氧化劑的生成發(fā)揮作用[3]。目前ALA主要應(yīng)用于糖尿病外周神經(jīng)病變，并獲得了良好的療效，但ALA能否改善糖調(diào)節(jié)受損大鼠的認(rèn)知功能障礙，相關(guān)的臨床報(bào)道很少。

本研究建立糖調(diào)節(jié)受損大鼠模型，測(cè)定其認(rèn)知功能、氧化應(yīng)激水平，并研究硫辛酸對(duì)認(rèn)知功能和氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組和模型制備 SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)：SXCK(京)2002-0003]提供。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)，室溫20 ℃～28 ℃，24 h晝夜循環(huán)光照，自由飲水進(jìn)食。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組30只、模型組100只。100只模型組隨機(jī)取80只成功模型組再隨機(jī)分為模型組和硫辛酸低、中、高劑量干預(yù)組，每組20只。故本實(shí)驗(yàn)總共分為5組，對(duì)照組20只，模型組20只，硫辛酸低、中、高劑量干預(yù)組各20只。對(duì)照組給予普通飼料；模型組及硫辛酸組給予高脂高糖飼料。兩組大鼠每日均喂食3次，按每只20 g/日投放飼料，共飼養(yǎng)17 w。第14周進(jìn)行一次葡萄糖耐量試驗(yàn)?？崭寡?.2～7.5 mmol/L或者餐后2 h血糖7.9～10.4 mmol/L為造模成功標(biāo)準(zhǔn)[4]。飼養(yǎng)14 w后，硫辛酸低、中、高劑量組于成功模型大鼠分別連續(xù)每日灌胃硫辛酸溶液15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg，每日一次，共14 d。對(duì)照組和模型組每日灌胃蒸餾水。

1.2 行為學(xué)檢測(cè) 飼養(yǎng)第17 w時(shí)，取各組大鼠用Morris水迷宮法[5]進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶功能測(cè)定。先通過(guò)4 d的訓(xùn)練讓大鼠熟悉并游至平臺(tái)上。第5天隱藏平臺(tái),通過(guò)記錄分析系統(tǒng)分析處理潛伏期,考察學(xué)習(xí)能力。第6天撤去平臺(tái),進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)-去除平臺(tái)觀察2 min內(nèi)大鼠在中心區(qū)停留時(shí)間百分比和通過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù),測(cè)試記憶能力。

1.3 活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)檢測(cè) Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，每組大鼠麻醉后斷頭取腦，冰盤上快速分離海馬，用眼科剪將海馬組織剪碎，輕輕研磨組織后經(jīng)300目篩網(wǎng)過(guò)濾，制備單細(xì)胞懸液，然后在室溫下4000 r/min離心3 min，棄上清后加入二氯二氫熒光素-乙酰乙酸醋(2’,7’- dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)工作液，37 ℃避光孵育20 min后應(yīng)用FACS Aria II流式細(xì)胞儀，每個(gè)樣本收集104個(gè)細(xì)胞，以DCF的熒光強(qiáng)度作為ROS含量值。

2 結(jié) 果

2.1 糖調(diào)節(jié)大鼠成模情況 模型組大鼠14 w時(shí)成模率為80%，無(wú)死亡大鼠。

2.2 認(rèn)知功能評(píng)定情況 模型組大鼠逃避潛伏期較對(duì)照組延長(zhǎng)(P<0.05),穿越目標(biāo)區(qū)次數(shù)較對(duì)照組減少(P<0.05)；硫辛酸各干預(yù)組大鼠與模型組相比，逃避潛伏期縮短(P<0.05)，穿越目標(biāo)區(qū)次數(shù)較對(duì)照組增加(P<0.05)，尤以中劑量組改變明顯(P<0.05)，結(jié)果(見表1)。

2.3 治療前后氧化應(yīng)激水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬組織中ROS增高(P<0.05)，α-硫辛酸各干預(yù)組大鼠海馬組織中ROS低于模型組，尤以中劑量組降低明顯(P<0.05)，結(jié)果(見表2)。

表1 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

與正常對(duì)照組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05；與硫辛酸中劑量組比較△P<0.05

表2 大鼠海馬組織中ROS水平

與正常對(duì)照組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05；與硫辛酸中劑量組比較△P<0.05

3 討 論

糖調(diào)節(jié)受損即糖尿病前期，主要包括空腹血糖受損(impaired fasting glucose，IFG)和糖耐量受損(impaired glucose tolerance，IGT)。糖尿病、高血壓病等血管性因素與認(rèn)知功能下降及癡呆相關(guān)，當(dāng)患者處于糖尿病前期即糖調(diào)節(jié)受損階段時(shí)，就已經(jīng)存在血管病變[6,7]。因此，推測(cè)糖尿病前期對(duì)認(rèn)知功能可能有損害，但目前臨床研究較少。本研究通過(guò)建立糖調(diào)節(jié)受損大鼠模型，通過(guò)Morris水迷宮法評(píng)價(jià)大鼠的認(rèn)知功能，結(jié)果顯示模型組大鼠較對(duì)照組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，說(shuō)明在糖尿病前期即糖調(diào)節(jié)受損階段大鼠已出現(xiàn)認(rèn)知功能損害。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在內(nèi)外環(huán)境有害刺激的條件下，促氧化與抗氧化之間的平衡失調(diào)導(dǎo)致體內(nèi)活性氧族(reactive oxygen species，ROS)的生成增加和(或)清除ROS的能力降低，ROS所引起的細(xì)胞和組織的生理和病理反應(yīng)。Brownlee[8]曾提出糖尿病血管并發(fā)癥產(chǎn)生的“統(tǒng)一機(jī)制”學(xué)說(shuō)，其核心為線粒體電子呼吸鏈中因高血糖誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，激活多條糖代謝旁路，最終導(dǎo)致包括糖尿病周圍神經(jīng)病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、大血管病變、心肌病等在內(nèi)的糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生，即氧化應(yīng)激是高糖損傷共同基礎(chǔ)。既往關(guān)于高血糖所致認(rèn)知障礙及氧化應(yīng)激水平的研究主要集中在糖尿病形成后[9,10]，糖尿病前期認(rèn)知障礙與氧化應(yīng)激水平的相關(guān)性研究仍較少。在糖尿病前期階段,由于已存在糖代謝、脂質(zhì)代謝、胰島素代謝及動(dòng)脈粥樣硬化的各種病理生理機(jī)制異常，我們推測(cè)在糖尿病前期可能已經(jīng)存在認(rèn)知障礙及氧化應(yīng)激的異常變化，且三者之間可能存在一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，糖調(diào)節(jié)受損模型大鼠海馬組織內(nèi)ROS水平升高，表明存在腦組織氧化應(yīng)激損傷。證實(shí)氧化應(yīng)激在糖調(diào)節(jié)受損中起重要作用，為臨床應(yīng)用抗氧化冶療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

α-硫辛酸(alpha-lipoic acid,ALA)是1951年由Reed首次從豬肝中分離出來(lái)的天然產(chǎn)物[11]，其在體內(nèi)吸收進(jìn)入細(xì)胞后，可還原成二氫硫辛酸并釋放到細(xì)胞外。因此單獨(dú)給予α-硫辛酸后，在體內(nèi)以α-硫辛酸和二氫硫辛酸兩種形式存在，它們協(xié)同作用，共同組成一種“萬(wàn)能抗氧劑”，有水溶性、脂溶性和分子量小等特點(diǎn)，口服和靜脈途徑給藥都可以良好吸收，可以透過(guò)血腦屏障。ALA 是線粒體α-酮酸氧化脫氫酶的一個(gè)輔助因子，通過(guò)清除體內(nèi)的氧自由基和動(dòng)員機(jī)體內(nèi)源性的抗氧化劑如維生素C、維生素E和谷胱甘肽的生成發(fā)揮作用[12]。近幾年主要應(yīng)用于糖尿病外周神經(jīng)病變，并獲得了良好的療效，但是否能夠改善糖調(diào)節(jié)受損大鼠的認(rèn)知功能障礙，未見臨床報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，ALA通過(guò)抗氧化途徑降低了腦內(nèi)ROS水平，改善了大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力?？寡趸呗杂锌赡艹蔀橹委熖钦{(diào)節(jié)受損中認(rèn)知功能障礙的新途徑。

綜上所述，本研究通過(guò)觀察糖調(diào)節(jié)受損大鼠的認(rèn)知功能和海馬組織的氧化應(yīng)激水平，為糖調(diào)節(jié)受損導(dǎo)致認(rèn)知障礙的氧化應(yīng)激機(jī)制提供了理論依據(jù)，為血管性認(rèn)知障礙的治療提供新的途徑。

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A preliminary study of the effects of α-lipoic acid on cognitive function and oxidative stress in rats with impaired glucose regulation

ZHOU Lina,WANG Hongxin，LIANG Peifen，et al.

(Department of Neurology，the Affiliated Fourth Centre Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300140，China)

Objective To study the effects of lipoic acid on cognitive function and oxidative stress in rats with impaired glucose regulation.Methods Male Wistar rats were randomly divided into 5 groups:control group,model group,lipoic acid low 15 mg/(kg/d),medium 30 mg/(kg/d),high 60 mg/(kg/d) dose group.A rat model of impaired glucose regulation was established by feeding with high fat and high sugar diet.The model rats were fed with lipoic acid solution 15,30 and 60 mg/kg daily,1 times daily,with a total of 14 d.The learning and memory abilities of rats were measured by Morris water maze method,and the content of ROS in hippocampus of rats in each group was detected by flow cytometry.Results Compared with the control group,the learning and memory ability of the model group decreased (P<0.05),while the level of ROS in the hippocampus increased (P<0.05).Compared with the model group,the level of ROS in the brain decreased in the lipoic acid group,and the learning and memory ability of the rats increased,especially in the middle dose group (P<0.05).Conclusion Lipoic acid has protective effects on cognitive function in rats with impaired glucose regulation,and its protective effects are related to its antioxidant effects.

Mpaired glucose regulation； α-lipoic acid； Cognitive function； Oxidative stress

2017-04-09；

2017-05-30

(1.天津醫(yī)科大學(xué)第四中心臨床學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300140;2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300052)

程 焱，E-mail：cylfl@sohu.com

1003-2754(2017)08-0700-03

R741.05

A