劉 麗， 張 可， 王金春， 曹云鵬

阿爾茨海默病患者血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量的研究

劉 麗1， 張 可2， 王金春1， 曹云鵬3

目的 研究阿爾茨海默病(AD)患者血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量的變化，尋求一種可能作為輔助診斷AD的早期生物學(xué)指標(biāo)。方法 選擇42例AD患者和45例認(rèn)知功能正常的健康對(duì)照者分別進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定，采用以O(shè)ptiprep為介質(zhì)的密度梯度離心方法分離血小板脂質(zhì)筏，應(yīng)用點(diǎn)印跡的方法進(jìn)行鑒定后，采用BCA法測(cè)定血小板脂質(zhì)筏內(nèi)蛋白含量，比色法及點(diǎn)印跡定量分析法測(cè)定其內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量。結(jié)果 在離心管25%～30% Optiprep溶液界面處可見(jiàn)一條白色的閃亮環(huán)帶，經(jīng)點(diǎn)印跡法證實(shí)，位于第6層的此白色閃亮環(huán)帶即為脂質(zhì)筏。AD組血小板脂質(zhì)筏內(nèi)蛋白含量略高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.1494)。AD組血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但其與年齡、MMSE評(píng)分無(wú)相關(guān)性。結(jié)論 AD組患者血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量與對(duì)照組相比明顯升高，故血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量的改變?cè)贏D的診斷中有一定的潛在價(jià)值，有望成為一種輔助診斷AD的早期生物學(xué)指標(biāo)。

阿爾茨海默病； 脂質(zhì)筏； β-淀粉樣蛋白； 神經(jīng)節(jié)苷脂GM1

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知、語(yǔ)言等功能障礙，日常生活能力進(jìn)行性減退，并可伴有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙，是導(dǎo)致老年癡呆的主要原因。雖然確切發(fā)病原因還不清楚，但大量資料表明，β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉積在AD的發(fā)病中起到重要的作用。

目前AD的診斷主要依據(jù)臨床判斷、神經(jīng)心理學(xué)測(cè)驗(yàn)評(píng)估及神經(jīng)影像學(xué)改變。臨床診斷的AD患者基本都處于中晚期，治療效果不佳，因此AD的早期診斷及治療十分關(guān)鍵，尋找能幫助AD臨床診斷的生物學(xué)指標(biāo)有著很大的意義。

近年研究表明脂質(zhì)筏在AD的病理發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，參與Aβ致AD發(fā)病的全過(guò)程[1]。而血小板因在Aβ生成方面具有類似于神經(jīng)元的生物學(xué)特性，可能反映了AD疾病中神經(jīng)元的發(fā)病機(jī)制，常被作為AD研究的有用的外周模式系統(tǒng)。因此在本研究中，我們對(duì)阿爾茨海默病(AD)患者血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1進(jìn)行研究，檢測(cè)了臨床診斷為AD的42例患者外周血血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1水平，同時(shí)與45例智能正常老年人外周血血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照分析。探討血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量與AD的關(guān)系，以期尋找到對(duì)AD診斷具有輔助作用的生物學(xué)標(biāo)志物。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 AD組 2014年6月-2016年12月于神經(jīng)內(nèi)科診治的AD患者，所有患者均進(jìn)行MMSE、蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表、日常生活能力量表、臨床癡呆評(píng)定量表、Hachinski缺血量表和漢密頓抑郁量表評(píng)分評(píng)定，均符合美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病及語(yǔ)言障礙和卒中研究所-AD和相關(guān)疾病學(xué)會(huì)(NINDS-ADRDA)制定的“很可能AD”的診斷標(biāo)準(zhǔn)。有甲狀腺功能低下、葉酸、維生素B12缺乏等代謝疾?。挥心X梗死或腦出血(經(jīng)MRI或CT證實(shí))、抑郁癥、癲癇、精神病、帕金森病等神經(jīng)精神疾病者；有活動(dòng)性消化潰瘍，明顯的肝、腎代謝和內(nèi)分泌異常，明顯的泌尿系梗阻和心血管疾病者，近期服用過(guò)降脂藥及抗血小板聚集類藥物的患者均被排除。

1.1.2 對(duì)照組 對(duì)照組來(lái)自同期體檢中心的健康體檢者，均經(jīng)MMSE評(píng)分、蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表、Hachinski缺血評(píng)分證實(shí)無(wú)明顯記憶障礙，無(wú)認(rèn)知、社交及生活能力受損，無(wú)神經(jīng)精神科疾病史，無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)變性病、無(wú)卒中史及癡呆家族史，近期未服用過(guò)降脂藥及抗血小板聚集類藥物。

1.1.3 該試驗(yàn)得到我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并且所有受試者或其家屬均書(shū)面簽署了知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 血小板的分離 空腹靜脈抽取全血20 ml，檸檬酸鈉抗凝。根據(jù)Colciaghi等[2]的方法并稍作改動(dòng)，200×g室溫離心15 min，小心抽取富含血小板的血漿層，2000×g室溫離心15 min，棄上清。

1.2.2 霍亂毒素β亞基(CTB)標(biāo)記 根據(jù)Blank等[3]的方法，將血小板(1×109)重懸于含有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的霍亂毒素β亞基(CTB-HRP)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，室溫下輕搖1 h，然后用PBS將血小板洗滌兩次，以洗除未結(jié)合的CTB-HRP。

1.2.3 血小板脂質(zhì)筏的制備[4]將普通血小板(1×109)及CTB標(biāo)記血小板(1×109)分別用1 ml 4 ℃預(yù)冷的裂解緩沖液(1% Triton x-100，25 mmol Mes，150 mmol Nacl，1×Protease inhibitor cocktail，pH 6.5)溶解，冰上裂解30 min。向細(xì)胞裂解物中加入2 ml 60%的Optiprep，使其終濃度為40%，將其放入超速離心管底部，上層依次覆蓋30%、25%、5%、0%的Optiprep，200 000×g于4 ℃超速離心5 h，從上到下依次收集離心樣品10份，每份約1 ml。

1.2.4 脂質(zhì)筏的鑒定及點(diǎn)印跡定量法測(cè)定血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量 根據(jù)Shrimpton等[4]的方法，將離心后收集的10層樣品點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上，自然晾干，將此硝酸纖維素膜于含5%BSA的PBST中室溫封閉1 h。傾去封閉液，加入含1 μg/ml辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的霍亂毒素β亞基的PBST，4 ℃孵育過(guò)夜。傾去孵育液，用PBS洗膜3次，每次10 min。加入1 ml混合ECL發(fā)光試劑盒中的液體，鋪在LAS3000 mini化學(xué)發(fā)光成像儀中，采集圖像。根據(jù)Tizon等[5]的方法，使用圖像測(cè)量軟件(Fuji,Japan) 分別測(cè)定每一樣品GM1斑點(diǎn)的灰度，其灰度值代表GM1的表達(dá)水平。

1.2.5 血小板脂質(zhì)筏內(nèi)蛋白含量測(cè)定 采用BCA法，步驟嚴(yán)格參照Micro BCA Protein Assay Kit試劑盒(美國(guó)Pierce公司)提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行。

1.2.6 血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量測(cè)定(比色法) 根據(jù)Blank等[3]的方法，對(duì)由CTB標(biāo)記血小板分離獲得的脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量進(jìn)行測(cè)定。在96孔酶標(biāo)板的每孔加入75 μl待測(cè)樣本和75 μl 3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，室溫避光30 min，加入125 μl終止液，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定并計(jì)算待測(cè)樣本的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用GraghPad Prism 7.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，得出對(duì)照組與AD組血小板脂質(zhì)筏內(nèi)蛋白、神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。對(duì)照組及AD組性別構(gòu)成進(jìn)行卡方一致性檢驗(yàn)，對(duì)照組與AD組年齡、受教育年限、MMSE評(píng)分、血小板脂質(zhì)筏內(nèi)蛋白及神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量的比較采用t檢驗(yàn);對(duì)血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量與年齡、MMSE評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析，并定義P<0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組受試者的一般資料 AD組42例，男19例，女23例，平均年齡(65.88±1.88)歲;對(duì)照組45例，男21例，女24例，平均年齡(66.47±2.06)歲。兩組在年齡、性別和受教育程度構(gòu)成方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。AD組患者的MMSE評(píng)分與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見(jiàn)表1)。

2.2 脂質(zhì)筏的鑒定 離心后，光照情況下在離心管內(nèi)Optiprep 25%～30%交界面處可見(jiàn)一條白色的閃亮的環(huán)帶，即脂質(zhì)筏所在部位。點(diǎn)印跡法檢測(cè)的結(jié)果(見(jiàn)圖1)亦表明，僅第6層中含有GM1，說(shuō)明脂質(zhì)筏位于第6層中，與肉眼所見(jiàn)相符，處于25%～30%密度梯度離心界面的白色環(huán)帶即在第6層中，因此第6層中的環(huán)帶部分就是我們所需制備的脂質(zhì)筏。

2.3 各組受試者血小板脂質(zhì)筏內(nèi)蛋白含量測(cè)定 結(jié)果顯示，對(duì)照組、AD組血小板脂質(zhì)筏內(nèi)蛋白含量均值分別為(189.9±8.29)μg/ml 、(209.3±9.91)μg/ml，兩組比較，AD組略高于對(duì)照組，但P=0.1494，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 各組受試者血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1測(cè)定 應(yīng)用比色法和免疫印跡定量?jī)煞N方法對(duì)血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果均顯示，AD組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)(見(jiàn)圖2)。

2.5 血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量與年齡、MMSE評(píng)分的相關(guān)性分析 血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1與年齡、MMSE評(píng)分無(wú)相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)分別為0.08895(P=0.4126)、0.2397(P=0.1263)。

表1 患者的一般資料

與對(duì)照組相比*P<0.01

圖1 離心后收集的10層樣品中各取10 μl，點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上。應(yīng)用點(diǎn)印跡法進(jìn)行鑒定，僅第6份樣品中含GM1，說(shuō)明分布在第6份樣品中的白色環(huán)帶為脂質(zhì)筏

圖2 AD組與對(duì)照組血小板脂筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量情況

3 討 論

自從1906年阿爾茨海默病被報(bào)道以來(lái)，便有許多學(xué)者致力于AD的研究。雖然目前其確切病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但作為老年斑的主要成份-Aβ在腦組織中的大量沉積被認(rèn)為是AD病理機(jī)制的核心所在，而且是AD最早、最特征性的改變，是AD發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

Aβ由一種跨膜糖蛋白-淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)水解產(chǎn)生。在Aβ的N末端和C末端分別由β和γ分泌酶水解APP，產(chǎn)生完整的Aβ片段。在正常情況下，這并不是主要的代謝途徑，而是由α分泌酶切割后產(chǎn)生的含部分Aβ片段的分泌性APP(APPs)和C末端片段。某些因素使APP基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致APP生成增加，APP基因在α、β和γ分泌酶作用位點(diǎn)附近的突變，促進(jìn)β和γ分泌酶的活性或抑制α分泌酶的活性等都可能使Aβ的生成增加。

脂質(zhì)筏概念由Brown and Rose在1992年提出[6]，其為膜脂雙層內(nèi)含有特殊脂質(zhì)和蛋白的微區(qū)，富含膽固醇和鞘脂[7]。脂筏具有在4 ℃時(shí)不溶于非離子去垢劑這一特征，筏內(nèi)的特異蛋白亦不溶于這些洗滌劑，利用這一特性，傳統(tǒng)采用Triton x-100裂解細(xì)胞，然后利用蔗糖密度梯度離心法將脂質(zhì)筏分離[8]。而霍亂毒素B亞基(CTB)，因其與脂質(zhì)筏成分之一神經(jīng)節(jié)苷酯GM1特異性結(jié)合，目前廣泛應(yīng)用于檢測(cè)脂質(zhì)筏[8]。脂質(zhì)筏參與許多細(xì)胞過(guò)程，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、病原體入侵、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的胞吞和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、神經(jīng)退行性疾病、血管生成等[7,9,10]。目前研究認(rèn)為脂質(zhì)筏在AD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。神經(jīng)元質(zhì)膜的脂質(zhì)筏是保持在維系神經(jīng)細(xì)胞學(xué)習(xí)及記憶功能等方面起重要作用的樹(shù)突和突觸的穩(wěn)定性所必需的[11]。研究表明，與其它類型的細(xì)胞相比，作為正常大腦記憶中樞的成熟的海馬神經(jīng)元內(nèi)的脂質(zhì)筏更為豐富，進(jìn)一步闡明在AD的發(fā)病過(guò)程中，海馬神經(jīng)元是Aβ寡聚體損害及破壞的最初靶點(diǎn)[12]。脂質(zhì)筏參與Aβ低聚體介導(dǎo)的AD神經(jīng)病理發(fā)生及發(fā)展的3個(gè)過(guò)程：(1)Aβ的生成；(2)Aβ聚集形成低聚體；(3)Aβ低聚體與神經(jīng)元上的受體相結(jié)合而致病，這些均在質(zhì)膜的脂質(zhì)筏微區(qū)內(nèi)進(jìn)行[13,14]。

目前大量研究表明，脂質(zhì)筏及其內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1在AD的Aβ生成過(guò)程中起重要作用。首先，Aβ的產(chǎn)生依賴于脂質(zhì)筏，APP經(jīng)淀粉樣蛋白生成途徑的降解在脂質(zhì)筏區(qū)進(jìn)行，而經(jīng)非淀粉樣蛋白生成途徑的降解在非脂質(zhì)筏區(qū)進(jìn)行[13]。Ehehalt等利用交聯(lián)抗體使APP與BACE在細(xì)胞膜上的脂質(zhì)筏內(nèi)交聯(lián)，之后Aβ的生成量明顯增加，但是當(dāng)脂質(zhì)筏結(jié)構(gòu)破壞時(shí)，Aβ的生成量無(wú)變化[15]。Cordy等研究發(fā)現(xiàn)BACE1(β分泌酶)由非脂質(zhì)筏區(qū)移位至脂質(zhì)筏區(qū)后，sAPPβ及Aβ的產(chǎn)量上調(diào)[16]。Williamson等在從AD患者腦組織中分離的脂質(zhì)筏中發(fā)現(xiàn)大量的Aβ、磷酸化tau蛋白，以及APP、Aβs、BACE1和γ分泌酶等肽酶片段[17]?？梢?jiàn)，脂質(zhì)筏的存在及其結(jié)構(gòu)的完整性是Aβ生成所必需的，BACE1的活性與脂質(zhì)筏結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，Aβ的生成過(guò)程主要發(fā)生在脂質(zhì)筏內(nèi)。

其次，神經(jīng)節(jié)苷脂GM1促進(jìn)Aβ的生成。神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量的改變能夠影響APP的水解過(guò)程，Zha等發(fā)現(xiàn)，外源性神經(jīng)節(jié)苷脂GM1可抑制其α分泌酶活性，并促進(jìn)γ分泌酶活性進(jìn)而使Aβ的生成量增加10倍。相反，應(yīng)用葡糖神經(jīng)酰胺合成酶抑制劑處理HEK293或HeLa細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的水平顯著下降，使Aβ生成減少[17]。Yamamoto[18]等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)通過(guò)瘦素誘導(dǎo)神經(jīng)元脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的表達(dá)下降達(dá)60%時(shí)，可完全阻止Aβ的生成。以上研究結(jié)果均表明，脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量的增加是導(dǎo)致Aβ的生成的重要原因。

再者，神經(jīng)節(jié)苷脂GM1促進(jìn)Aβ的聚集。神經(jīng)節(jié)苷脂GM1可使Aβ的構(gòu)象發(fā)生改變，并與Aβ結(jié)合形成神經(jīng)節(jié)苷脂GM1結(jié)合Aβ，即GAβ，是AD早期的病理改變[19]，GAβ如同“種子”一樣啟動(dòng)并加速Aβ的聚集[20,21]。對(duì)AD患者的腦組織進(jìn)行免疫組化研究時(shí)，在老年斑內(nèi)發(fā)現(xiàn)GAβ也支持以上觀點(diǎn)[17]。神經(jīng)節(jié)苷脂GM1與Aβ結(jié)合，即GAβ的生成發(fā)生在老年斑形成之前，在早期AD患者腦內(nèi)，GAβ存在于皮質(zhì)神經(jīng)纖維網(wǎng)內(nèi)，而不是老年斑中[22]。Hong等[22]在存活的AD患者的腦脊液內(nèi)檢測(cè)到GAβ，可見(jiàn)GAβ存在腦組織內(nèi)，并有少量進(jìn)入腦脊液內(nèi)。Kim等從富含神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的鼠腦中分離獲得的脂質(zhì)筏具有促進(jìn)Aβ聚集的功能，并且當(dāng)去除這些脂質(zhì)筏內(nèi)的膽固醇或蛋白后，其對(duì)Aβ聚集的促進(jìn)作用并未受到影響[23]。用CTB阻斷神經(jīng)節(jié)苷脂GM1上Aβ結(jié)合的特異性位點(diǎn)，可消除由Aβ低聚體導(dǎo)致的海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(LTP)受損，說(shuō)明神經(jīng)節(jié)苷脂GM1和Aβ結(jié)合可能是導(dǎo)致下游Aβ對(duì)突觸毒性作用的關(guān)鍵步驟[22]。因此，神經(jīng)節(jié)苷脂GM1具有促進(jìn)Aβ聚集的作用，GAβ的生成可能是Aβ聚集致病的始動(dòng)因素。

Martin等研究發(fā)現(xiàn)，從AD患者腦組織內(nèi)分離獲得的脂質(zhì)筏的構(gòu)成存在異常，與對(duì)照組相比，其更具粘性及有序性[16]。Molander-Melin等[24]對(duì)AD患者額葉腦組織脂質(zhì)筏內(nèi)成分的分析發(fā)現(xiàn)GM1，GM2明顯高于對(duì)照組，而膽固醇及蛋白水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。Pernbert等[25]對(duì)AD患者腦組織的研究同樣發(fā)現(xiàn)額、顳葉皮質(zhì)脂質(zhì)筏內(nèi)GM1和GM2含量增加，并與毒性淀粉樣纖維形成有關(guān)。由于目前很難在AD患者存活的情況下獲取腦細(xì)胞進(jìn)行分析，而血小板的生物化學(xué)和藥理作用方面類似于神經(jīng)元，90%的血源性可溶性Aβ由血小板產(chǎn)生，血小板中含有完整的裂解APP的酶系：α、β、γ分泌酶[26]，血小板中的APP異構(gòu)體濃度與腦中APP異構(gòu)體濃度相當(dāng)[27]，血小板可能反映了AD疾病中神經(jīng)元的發(fā)病機(jī)制。因此血小板常作為AD研究的外周模式系統(tǒng)，我們選擇使用血小板的生化參數(shù)來(lái)探索可作為診斷AD的外周生物學(xué)標(biāo)志物。

在血小板脂質(zhì)筏制備中，之前的研究均使用蔗糖作為梯度離心的介質(zhì)，需要200 000～280 000g離心18 h～24 h以上。本研究中，我們嘗試用Optiprep代替蔗糖作為梯度離心的介質(zhì)，Optiprep是最新研究出的全能型分離液，主要成份為iodixanol，是一種高親水性非離子物質(zhì)，具高密度、低粘度的特點(diǎn)，離心過(guò)程只需要5 h，大大減少了脂質(zhì)筏的制備時(shí)間。之后，我們檢測(cè)了臨床診斷為AD的42例患者外周血血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1及蛋白的水平，同時(shí)與45例智能正常老年人外周血血小板脂質(zhì)筏內(nèi)相關(guān)成分檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照研究。我們發(fā)現(xiàn)，AD患者外周血血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量明顯高于對(duì)照組(P<0.0001)，而脂質(zhì)筏內(nèi)蛋白含量與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P=0.1494)。由于本研究的樣本量相對(duì)較少，所以在后續(xù)的研究中，將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，以便確認(rèn)血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量異常與AD之間是否真正存在相關(guān)性。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示AD患者外周血血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1水平明顯升高，血小板脂質(zhì)筏內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1含量可能作為AD的一種潛在生物標(biāo)志物，并且可能為今后干預(yù)治療提供一定的幫助。

[1]Rushworth JV,Hooper NM.Lipid Rafts:Linking Alzheimer’s amyloid-β production,aggregation,and toxicity at neuronal membranes[J].Int J Alzheimers Dis,2011,2011:603052.

[2]Colciaghi F,Marcelo E,Borroni B,et al.Platelet APP,ADAM 10 and BACE alternations in early stages of Alzheimer disease[J].Neurology,2004,62:498-501.

[3]Blank N,Gabler C,Schiller M,et al.A fast,simple and sensitive method for the detection and quantification of detergent-resistant membranes[J].J Immunol Methods,2002,271:25-35.

[4]Shrimpton CN,Gousset K,Tablin,et al.Isolation and analysis of platelet lipid rafts[J].Methods Mol Biol,2004,273:213-228.

[5]Tizon B,Ribe EM,Mi W,et al.Cystatin C protects neuronal cells from amyloid-b-induced toxicity[J].J Alzheimers Dis,2010,19:885-894.

[6]Brown DA,Rose JK.Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface[J].Cell,1992,68:533-544.

[7]Simons K,Ikonen E.Functional rafts in cell membranes[J].Nature,1997,387:569-572.

[8]Cordy JM,Hooper NM,Turner AJ.The involvement of lipid rafts in Alzheimer’s disease [J].Mol Membr Biol,2006,23(2):111-122.

[9]Crane JM,Tamm LK.Role of cholesterol in the formation and nature of lipid rafts in planar and spherical model membranes [J].Biophys J,2004,86(5):2965-2979.

[10]Rajendran L,Simons K.Lipid rafts and membrane dynamic[J].J Cell Sci,2005,118:1099-1102.

[11]Kusumi A,Koyama-Honda I,Suzuki K.Molecular dynamics and interactions for creation of stimulation-induced stabilized rafts from small unstable steady-state rafts [J].Traffic,2004,5:213-230.

[12]Fragoso R,Ren D,Zhang X,et al.Lipid raft distribution of CD4 depends on its palmitoylation and association with Lck,and evidence for CD4 induced lipid raft aggregation as an additional mechanism to enhance CD3 signalion[J].J Immunol,2003,170:913-921.

[13]Ohno-Iwashita Y,Shimada Y,Hayashi M.Plasma membrane microdomains in aging and disease[J].Geriatr Gerontol Int,2010,1:S41-52.

[14]Schenqrund CL.Lipid rafts:keys to neurodegeneration[J].Brain Res Bull,2010,82(1/2):7-17.

[15]Ehehalt R,Keller P,Haass C,et al.Amyloidogenic processing of the Alzheimer β-amyloid precursou protein depends on lipid rafts[J].J Cell Biol,2003,160(1):113-123.

[16]Cordy JM,Hussain I,Dingwall C,et al.Exclusively targeting β-secretase to lipid rafts by GPI-anchor addition up regulates β-site processing of the amyloid precursor protein[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(20):11735-11740.

[17]Ariga T.The pathogenic role of ganglioside metabolism in Alzheimer’s disease-cholinergic neuron-specific gangliosides and neurogenesis[J].Mol Neurobiol,2017,54(1):623-638.

[18]Yamamoto N,Tanida M,Kasahare R,et al.Leptin inhibits amyloid β-protein fibrillogenesis by decreasing GM1 gangliosides on the neuronal cell surface through PI3K/Akt/mTOR pathway[J].J Neurochem,2014,131(3):323-232.

[19]Yuyama K,Ynangisawa K.Sphingomyelin accumulation provides a favorable milieu for GM1 ganglioside-induced assembly of amyloid β-protein[J].Neurosci Lett,2010,481(3):168-172.

[20]Thakur G,Pao C,Micic M,et al.Surface chemistry of lipid raft and amyloid Aβ(1-40) Langmuir monolayer [J].Colloids Surf B Biointerfaces,2011,87(2):369-377.

[21]Okada T,Ikeda K,Wakabayashi M,et al.Formation of toxic Abeta(1-40) fibrils on GM1 ganglioside-containing membranes mimicking lipid rafts:polymorphisms in Abeta(1-40) fibrils[J].J Mol Biol,2008,382(4):1066-1074.

[22]Hong S,Ostaszewski BL,Yang T,et al.Soluble Aβ oligomers are rapidly sequestered from brain ISF in vivo and bind GM1 ganglioside on cellular membranes[J].Neuron,2014,82(2):308-319.

[23]Vetrivel,KS,Meckler X,Chen Y,et al.Alzheimer disease Abeta production in the absence of S-palmitoylation-dependent targeting of BACE1 to lipid rafts[J].J Biol Chem,2009,284:3793-3803.

[24]Molander-Melin M,Blennow K,Bogdanovic N,et al.Structural membrane alterations in Alzheimer brains found to be associated with regional disease development:increased density of gangliosides GM1 and GM2 and loss of cholesterol in detergent resistant membrane domains[J].J Neurochem,2005,92:171-182.

[25]Pernber Z,Blennow K,Bogdanovic N,et al.Altered distribution of the gangliosides GM1 and GM2 in Alzheimer’s disease [J].Dement Geriatr Cogn Disord,2012,33(2/3):174-188.

[26]Chen M,Inestrosa NC,Ross GS,et al.Platelets are the primary source of amyloid β-peptide in human blood[J].Biochem Biophys Res Commun,1995,213(1):96-103.

[27]Borroni B,Agosti C,Marcello E,et al.Blood cell markers in Alzheimer disease:Amyloid precursor protein form ratio in platelets[J].Exp Gerontol,2010,45(1):53-56.

Study on the ganglioside GM1 content of lipid rafts in platelets of patients with Alzheimer’s disease

LIU Li,ZHANG Ke,WANG Jinchun,et al.

(Department of Neurology,Shenyang Fifth People Hospital,Shengyang 110023,China)

Objective To investigate the changes of ganglioside GM1 of lipid raft in platelets in patients with Alzheimer’s disease (AD),in order to find an early biomarker for diagnosis of AD.Methods The neurological functions of 42 patients with AD and 45 subjects with normal cognition were evaluated by neuropsychological examinations.Lipid raft was isolated by Optiprep gradient centrifugation and identified by dot blotting.The protein content was measured by using BCA assay,ganglioside GM1 content using colorimetry and dot blotting analysis.Results A white light-scattering band under light illumination located at interface between 25%～30% Optiprep was detectable,which was revealed by dot-blotting.The lipid raft fraction floats within Optiprep gradient fraction 6.The platelet lever of protein in lipid raft was slightly higher in AD group than that in the control group,but there was no statistically significant difference between the two groups (P=0.1494).The platelet lever of ganglioside GM1 in lipid raft was statistically significantly higher in the AD group than that in the control group (P<0.01),but it was not significantly correlated with the age and the scores of MMSE.Conclusion As compared with normal mental state control,the ganglioside GM1 in lipid raft of the platelets in AD group was significantly increased,which may be associated with AD.The altered ganglioside GM1 in lipid raft of the platelets,probably an early biomarker of AD,is of potential value in clinical diagnosis of AD.

Alzheimer’s disease (AD)； Lipid raft； β-amyloid protein； Ganglioside GM1

2017-04-02；

2017-05-30

沈陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(F16-206-9-27)

(1.沈陽(yáng)市第五人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110023；2. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)發(fā)育細(xì)胞生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110013；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

曹云鵬，E-mail：ypengcao@sina.cn

1003-2754(2017)08-0687-05

R749.1

A