梁雪云, 姚子昂, 馬斌武， 金毅然， 韓懷欽， 牛建國,5, 何仲義

解偶聯(lián)蛋白2基因-866G/A,Ala55Val及Ins/Del多態(tài)性對寧夏回族人群血清抗氧化物質(zhì)含量的影響分析

梁雪云1, 姚子昂2, 馬斌武3， 金毅然1， 韓懷欽4， 牛建國4,5, 何仲義4

目的 以寧夏地區(qū)回族人群為研究對象，分析UCP2基因多態(tài)性對血清抗氧化物質(zhì)含量的影響。方法 收集寧夏地區(qū)回族正常人群及回族腦缺血患者外周血樣本，提取外周血基因組DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性方法檢測各樣本UCP2基因-866G/A、Ala55Val及Ins/Del多態(tài)性，利用試劑盒檢測血清抗氧化物質(zhì)SOD、TAOC、GSH含量。結(jié)果 寧夏地區(qū)回族健康人群中，UCP2基因-866位點(diǎn)GA基因型血清GSH值(125.78±4.55)U/L低于GG野生型基因型GSH值(130.35±10.68)U/L(P<0.05)；腦缺血患者中Ins/Del位點(diǎn)組Ins/Ins基因型血清GSH值(108.71±8.30)U/L低于Del/Del基因型血清GSH值(116.43±8.24)U/L(P<0.05)。結(jié)論 在一定條件下，UCP2基因-866G/A,Ins/Del多態(tài)性可能影響寧夏地區(qū)回族人群血清GSH值。

解偶聯(lián)蛋白2； 基因多態(tài)性； 回族人群； 抗氧化物質(zhì)

腦缺血是常見多基因疾病，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量[1]。寧夏地區(qū)回族人群中，腦缺血發(fā)病率在逐年升高。尋找到與回族腦缺血人群中具有臨床治療意義的功能性基因，將為在寧夏地區(qū)回族人群中開展腦缺血的防治工作提供有力的幫助。

解偶聯(lián)蛋白2(uncouple protein 2)參與調(diào)控細(xì)胞線粒體功能，為機(jī)體能量代謝的功能性基因[2]。本課題組在研究中發(fā)現(xiàn)，UCP2參與腦缺血的發(fā)病過程[3]。大量研究證明，在不同人群中UCP2存在多位點(diǎn)的基因多態(tài)性[4]?；虻膯魏塑账岫鄳B(tài)性(SNPs)是形成個體間差異的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)[5]。功能性的SNP可能影響基因的表達(dá)水平及蛋白的活性，進(jìn)而影響其在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的功能[6]。機(jī)體內(nèi)抗氧化物質(zhì)對腦缺血患者的預(yù)后有重要的意義，UCP2基因多態(tài)性是否影響體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的含量，目前尚未見到相關(guān)研究。

本研究首次以寧夏地區(qū)回族健康人群及腦缺血患者為研究對象，選擇血清過氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、血清總抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAOC)及谷胱甘肽(glutathione,GSH)為體內(nèi)抗氧化物質(zhì)代表，分析UCP2基因多態(tài)性是否影響回族人群體內(nèi)抗氧化物質(zhì)水平。

1 材料與方法

1.1 研究對象 回族腦缺血患者診斷及正常對照組：腦缺血組71例，來自2014年1月-2015年10月在寧醫(yī)大總院就診的寧夏地區(qū)回族住院患者，年齡50～65歲，均行頭部CT和/或MRI檢查，證實(shí)腦缺血，診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會腦血管病學(xué)組急性缺血性腦卒中診治指南。對照組97例，為同期門診查體寧夏回族健康者,年齡50～65歲。所有研究對象均行生化項目檢查并簽署知情同意書。

1.2 材料與方法

1.2.1 樣本基因組DNA提取 采集外周血經(jīng)抗凝后，采用QIANGEN minikit按試劑盒說明書進(jìn)行基因組DNA提取，利用Nanodrop ND1000測定DNA濃度，用瓊脂糖凝膠電泳判斷DNA質(zhì)量，篩選優(yōu)質(zhì)DNA做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù) 采用Oligo7.0軟件設(shè)計引物。各位點(diǎn)引物序列為：UCP2-866G/A，上游引物 5’-CACGCTGCTTCTGCCAGG AC-3’；下游引物 5’-AGGCGTCAGGAGATGGACCG-3’。Ala55Val(Exon4)，上游引物 5’-CTCCTCTTGGCTTAGATTCCTG-3’；下游引物 5’-GACAGAATCATACAGGCCGAT-3’。Ins/Del (Exon8)，上游引物 5’-TGCCCTCCTTTCTCCGCTTG-3’；下游引物 5’-ATGGACCAGATGACCTACACG-3’。采用常規(guī)PCR擴(kuò)增包含相應(yīng)位點(diǎn)的DNA片段。經(jīng)凝膠電鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物后，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，37 ℃ 4 h。酶切產(chǎn)物電泳后，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)判斷基因分型。圖1為UCP2Ins/Del基因型Ins/Ins、Ins/Del及Del/Del PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳代表性結(jié)果，泳道1為位于470 bp的基因型Ins/Ins，泳道3為420 bp的基因型Del/Del，泳道2為雜合子Ins/Del(見圖1)。

1.2.3 血清中抗氧化物檢測 分別采用試劑盒檢測血清中SOD、TAOC及GSH,所有操作程序均按試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 樣本臨床基本資料統(tǒng)計結(jié)果 將收集的正常對照組與腦缺血組臨床基本資料比較，結(jié)果顯示：正常對照組性別(男/女)比例為47/50，腦缺血組性別比例為37/34；正常對照組年齡組成為57.55±3.66，腦缺血組年齡組成為58.68±3.86；正常對照組體重為64.15 kg±8.63 kg，腦缺血組體重為65.58 kg±8.25 kg；兩組在性別比例、年齡組成及體重等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)方面無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；腦缺血組血清甘油三酯含量為(1.62±0.58)mmol/L高于正常對照組(1.62±0.58)mmol/L(P<0.05)，兩組樣本血清總膽固醇測量值無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(見表1)。

2.2 寧夏地區(qū)回族健康人群及腦缺血患者血清抗氧化物質(zhì)檢測結(jié)果比較 寧夏地區(qū)回族健康人群及腦缺血患者血清抗氧化物質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)：腦缺血患者血清SOD值為(63.39±6.96)U/ml，明顯低于回族健康人群檢測值(74.89±11.17)U/ml(P<0.05)；腦缺血患者血清TAOC值為(14.18±2.95)U/ml，明顯低于回族健康人群檢測值(20.03±3.98)U/ml(P<0.05)；腦缺血患者血清GSH值為(113.59±8.24)U/L，低于回族健康人群檢測值(127.14±7.21)U/L(P<0.05)(見表2)。

2.3 寧夏地區(qū)回族健康人群及腦缺血患者UCP2基因-866G/A、Ala55Val及Ins/Del不同基因型血清SOD值檢測結(jié)果比較 比較回族健康者及腦缺血患者兩組間及各組內(nèi)UCP2各突變位點(diǎn)不同基因型血清SOD值，結(jié)果顯示：同一基因型腦缺血組SOD值均低于正常對照組(P<0.05)；但腦缺血組及正常對照組同組內(nèi)UCP2各突變位點(diǎn)不同基因型人群血清SOD值無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(見表3)。

2.4 寧夏地區(qū)回族健康人群及腦缺血患者UCP22基因-866G/A、Ala55Val及Ins/Del不同基因型血清TAOC值檢測結(jié)果比較 比較回族健康者及腦缺血患者兩組間及各組內(nèi)UCP2各突變位點(diǎn)不同基因型血清TAOC值，結(jié)果顯示：同一基因型腦缺血組TAOC值均低于正常對照組(P<0.05)；但腦缺血組及正常對照組同組內(nèi)UCP2各突變位點(diǎn)不同基因型人群血清TAOC值無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(見表4)。

2.5 寧夏地區(qū)回族健康人群及腦缺血患者UCP2基因-866G/A、Ala55Val及Ins/Del不同基因型血清GSH值檢測結(jié)果比較 比較回族健康者及腦缺血患者兩組間及各組內(nèi)UCP2各突變位點(diǎn)不同基因型血清GSH值，結(jié)果顯示：同一基因型腦缺血組GSH值均低于正常對照組(P<0.05)；正常健康人群中，GA基因型血清GSH值(125.78±4.55)U/L低于GG野生型基因型GSH值(130.35±10.68)U/L(P<0.05)；腦缺血組Ins/Ins基因型血清GSH值(108.71±8.30)U/L低于Del/Del基因型血清GSH值(116.43±8.24)U/L(P<0.05)；腦缺血組及正常對照組同組內(nèi)UCP2其它突變位點(diǎn)不同基因型人群血清SOD值無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(見表5)。

表1 腦缺血組及正常對照組基本資料比較

與正常組相比*P<0.05

表2 腦缺血組及正常對照組血清抗氧化物質(zhì)檢測結(jié)果比較

與正常組相比*P<0.05

表3 UCP2各突變位點(diǎn)不同基因型腦缺血組及正常對照組血清SOD值

與正常組相比*P<0.05

表4 UCP2各突變位點(diǎn)不同基因型腦缺血組及正常對照組血清TAOC值

與正常組相比*P<0.05

表5 UCP2各突變位點(diǎn)不同基因型腦缺血組及正常對照組血清GSH值

與正常組GG基因型相比△P<0.05；與缺血組Del/Del基因型相比#P<0.05；與正常組相比*P<0.05

M：Marker 1:Ins/Ins；2:Ins/Del；3:Del/Del

3 討 論

人類的基因組序列存在個體差異，包括對疾病的易感性、對同一疾病治療藥物的反應(yīng)性等。基因的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是形成個體間差異的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)[5]。寧夏回族人群因其宗教信仰及居住地理位置等因素具有相對穩(wěn)定的基因遺傳特點(diǎn)，是多種基因疾病譜分析的寶貴人類資源[7]。

腦缺血的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。腦缺血的發(fā)病與機(jī)體細(xì)胞能量代謝水平紊亂相關(guān)，腦缺血發(fā)生后，體內(nèi)產(chǎn)生的大量過氧化物若不及時清除，將導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞對腦缺血的易感性升高，對機(jī)體造成嚴(yán)重的損害[8]。體內(nèi)各種抗氧化物參與機(jī)體清除多余過氧化物質(zhì)，為重要的機(jī)體保護(hù)物質(zhì)之一。體內(nèi)抗氧化物水平的高低決定在應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體能否有效地清除多余過氧化物。本研究結(jié)果證實(shí)，腦缺血后，體內(nèi)抗氧化物水平明顯降低。這與腦缺血后，體內(nèi)產(chǎn)生大量的過氧化物消耗了抗氧化物有關(guān)。

UCP2基因參與調(diào)控細(xì)胞線粒體功能，為維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的功能性基因[2]。已有研究證明，UCP2基因參與腦缺血的發(fā)病過程[9]。有研究者證實(shí)，UCP2通過參與神經(jīng)元線粒體氧化磷酸化過程降低神經(jīng)元過氧化物水平[10]。本課題組在以往研究中發(fā)現(xiàn)，UCP2功能缺陷能夠影響體內(nèi)抗氧化物GSH水平，但其具體機(jī)制仍未闡明[3]。

大量研究證明，UCP2具有基因多態(tài)性。功能性的SNP可能影響基因的表達(dá)水平及蛋白的活性，進(jìn)而影響其在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的功能[11]。UCP2-866G/A、UCP2 Ala55Val和UCP2 Ins/Del被證明在一些特定人群與糖尿病的發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)[12]。還有研究證明，以上3個位點(diǎn)的多態(tài)性影響UCP2基因表達(dá)水平及蛋白功能，影響細(xì)胞的能量代謝[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在寧夏地區(qū)回族健康人群中，UCP2基因-866位點(diǎn)GA基因型血清GSH值低于GG野生型基因型GSH值；腦缺血患者中Ins/Del位點(diǎn)組Ins/Ins基因型血清GSH值低于Del/Del基因型血清GSH值。這可能與基因位點(diǎn)突變后導(dǎo)致UCP2基因功能不穩(wěn)定相關(guān)。

本研究首次以寧夏地區(qū)回族人群為研究對象，分析UCP2基因多態(tài)性對血清抗氧化物質(zhì)含量的影響。為臨床腦缺血的治療及預(yù)后判斷提供了理論依據(jù)。

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Effects of single nucleotide polymorphism of UCP2-866G/A,Ala55Val,Ins/Del on serum antioxidant level in Ningxia Hui Population

LIANG Xueyun，YAO Ziang,MA Binwu,et al.

(Ningxia Human Stem Cell Research Institution,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China)

Objective To explore the effects of single nucleotide polymorphism of Uncouple protein 2 (UCP2)-866G/A,Ala55Val,Ins/Del on serum antioxidant level in Ningxia Hui population.Methods After extracted genomic DNA from the collected peripheral blood,the single nucleotide polymorphisms of UCP2-866G/A,Ala55Val,Ins/Del were tested by PCR-RELF method.The levels of serum antioxidant were measured by kit.Results In normal group,the serum GSH level was lower in UCP2-866 GA genotype than that in UCP2-866 GG genotype.In stroke group,the serum GSH level was lower in UCP2 Ins/Ins genotype than that in UCP2 Del/Del genotype.Conclusion The single nucleotide polymorphisms of UCP2-866G/A and UCP2Ins/Del may have effects on the serum GSH level in Ningxia Hui population in different conditions.

Uncouple protein 2; Single nucleotide polymorphism; Hui population; Antioxidants

2017-04-01；

2017-05-30

國家自然科學(xué)基金項目(81460197)；國家自然科學(xué)基金項目(81460186)；寧夏自然科學(xué)基金項目(NZ14130)；寧夏高等學(xué)校科研項目(NGY2013055)

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院寧夏人類干細(xì)胞研究所，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)2015級研究生，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，寧夏 銀川 750004；4.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，寧夏 銀川 750004；5.寧夏顱腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004)

何仲義，E-mail:hzy-008@163.com

1003-2754(2017)08-0703-04

R743.3

A