生曉娜, 李瀟瀟， 張曉煒， 王 珊， 季 光， 鄭為娜， 張國華

阿爾茨海默病患者淋巴細(xì)胞中雙鏈RNA-依賴的蛋白激酶水平與認(rèn)知障礙的相關(guān)性

生曉娜1, 李瀟瀟3， 張曉煒2， 王 珊1， 季 光1， 鄭為娜1， 張國華1

目的 研究雙鏈RNA-依賴的蛋白激酶(the double stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者外周血淋巴細(xì)胞(Peripheral lymphocytes，PBLs)中的表達(dá)及活性；探討其水平及活性改變與AD患者認(rèn)知障礙的相關(guān)性。方法 選取AD、PD及健康老年人各20例，應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測PBLs中總PKR及磷酸化PKR(p-PKR)的表達(dá)，分析比較3組中PKR表達(dá)及活性的差異,并利用皮爾森相關(guān)分析探討PKR表達(dá)及活性與AD、PD病程和病情的關(guān)系。結(jié)果 與正常對照組相比，總PKR、p-PKR蛋白表達(dá)水平在AD患者的PBLs中均明顯升高(P<0.05)，且總PKR的表達(dá)量與AD患者認(rèn)知障礙嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r=0.799，P<0.01)；在PD組PBLs中總的PKR與p-PKR蛋白水平均升高(P<0.05)。結(jié)論 在AD患者中，PKR的異常表達(dá)及活化不僅體現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而且可在PBLs中檢測到，其表達(dá)量與認(rèn)知障礙嚴(yán)重程度成正相關(guān)，有可能成為AD早期診斷及病情評價(jià)的外周標(biāo)記物。

PKR； 阿爾茨海默?。?外周血淋巴細(xì)胞； 認(rèn)知障礙

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是發(fā)生于老年和老年前期、以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，是老年期癡呆的最常見類型，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性全面認(rèn)知功能損害。隨著人口老齡化進(jìn)程，阿爾茨海默病發(fā)病率逐年上升,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，也給家庭和社會(huì)帶來了沉重的生活和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

目前國內(nèi)外在AD領(lǐng)域的研究多為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或尸檢后研究神經(jīng)元的受損情況。然而，早期診斷AD是制定治療策略、控制疾病進(jìn)程的基礎(chǔ)及關(guān)鍵。近期研究表明，在AD中細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控的失衡不僅局限于神經(jīng)元，而且體現(xiàn)在外周血淋巴細(xì)胞。外周血采集方便，易于檢測，深入研究可能對臨床AD的早期診斷及治療具有重要意義，但至今尚無這樣的標(biāo)志物為臨床所應(yīng)用。

雙鏈RNA-依賴的蛋白激酶(the double stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激、細(xì)胞生長、分化和凋亡調(diào)控中起重要作用,是阿爾茨海默病調(diào)節(jié)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，已有研究證實(shí)在神經(jīng)變性疾病患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可檢測到PKR的異常表達(dá)及活化。因此，研究其是否可作為與認(rèn)知功能減退相關(guān)的外周血生物學(xué)標(biāo)記物具有可行性和必然性。

據(jù)此，本研究擬通過測定AD患者外周血淋巴細(xì)胞中PKR的蛋白表達(dá)和活化水平，以帕金森病(Parkinson’s disease，PD)患者和同期健康體檢者為對照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，探討外周血淋巴細(xì)胞中PKR水平與AD、PD的關(guān)系及病情進(jìn)程的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究方便有效的AD外周標(biāo)記物和潛在的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象 (1)AD組：系2010年-2011年我院神經(jīng)內(nèi)科門診就診的20例輕至中度AD患者，其中男7例，女13例；年齡55～72歲，平均年齡(66.75±7.79)歲；病程0.5～4 y，平均病程(2.07±1.72)年；簡易精神狀態(tài)檢查(minimental state examination，MMSE)評分在14～18分，平均(15.75±4.16)分；臨床癡呆量表評分(Clinical dementia rating，CDR)≦2。入組AD患者均符合美國國立神經(jīng)病、語言機(jī)能紊亂和卒中研究所及阿爾茨海默病和相關(guān)疾病協(xié)會(huì)(the national institute of neurological and communicative disorders and stroke and the Alzheimer’s disease and related disorders association,NINCDS-ADRDA)的很可能AD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且無家族史。(2)PD組：系2010年-2011年就診本院神經(jīng)內(nèi)科門診的PD患者20例，其中男8例，女12例；年齡52～71歲，平均年齡(64.22±9.23)歲；病程1～4 y，平均病程(2.57±1.05)y；均符合2006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)公布的PD診斷標(biāo)準(zhǔn)，且已排除認(rèn)知功能障礙。(3)健康對照組：系本院同期健康體檢者20例，其中男8例，女12例；年齡55～73歲，平均年齡(65.45±7.73)歲，年齡和性別構(gòu)成比與病例組相比無明顯差異,經(jīng)神經(jīng)心理學(xué)檢查認(rèn)知功能正常。

所有入選對象均排除患有嚴(yán)重心、肝、腎及其它全身性系統(tǒng)性疾病、腦卒中病史、精神系統(tǒng)疾病、手術(shù)史、外傷史和其它重大疾病史。家族中均無癡呆患者。所有入選患者及健康體檢者均由其本人或監(jiān)護(hù)者簽署知情同意書，并提供血樣，過程符合人權(quán)及人道主義和醫(yī)學(xué)倫理。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 所有受檢者均于上午9：00～11：00抽取10 ml靜脈新鮮抗凝血，用人淋巴細(xì)胞分離液分離、收集淋巴細(xì)胞， PBS緩沖液洗滌獲得淋巴細(xì)胞。

1.2.2 提取總蛋白 蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑混合液加入裂解-結(jié)合緩沖液重懸淋巴細(xì)胞，加入抽提試劑去除非蛋白成分，離心、干燥后即可得到總蛋白。以上過程除干燥外均在4 ℃條件下完成。加入2%十二烷基硫酸鈉(SDS)緩沖液，95 ℃水浴溶解沉淀，離心去除不溶物。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測PKR、p-PKR水平 用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白(100 μg)進(jìn)行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，然后恒流下將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上；5%脫脂奶粉室溫封閉后，加入相應(yīng)的一抗(PKR抗體、p-PKR抗體、GAPDH)4 ℃過夜；過夜后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育。采用Odyssey System對圖像進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 AD組與正常對照組total-PKR、p-PKR蛋白水平的比較 與正常對照組相比，total-PKR及p-PKR在AD患者的外周血淋巴細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)(見圖1、表1)。

2.2 PD組與正常對照組total-PKR、p-PKR蛋白水平的比較 與正常對照組相比，在PD患者的淋巴細(xì)胞中，total-PKR蛋白表達(dá)水平顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；p-PKR蛋白表達(dá)水平亦升高(P<0.05)(見圖1、表1)。

2.3 PKR與AD病程及病情的關(guān)系 經(jīng)Pearson相關(guān)分析得出，total-PKR蛋白表達(dá)水平及活化與AD患者M(jìn)MSE評分呈正相關(guān)：(1)total-PKR/GAPDH與MMSE評分：r=0.799，P<0.01;(2)p-PKR/total-PKR與MMSE評分：r=0.674，P<0.05。與病程未見相關(guān)P>0.1(見圖2)。

表1 外周血淋巴細(xì)胞中total-PKR、p-PKR蛋白水平在3組間的比較

與正常對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義*P<0.05

圖1 total-PKR、p-PKR在正常對照組、AD組及PD組外周血淋巴細(xì)胞的Western-blot檢測結(jié)果

圖2 A：total-PKR蛋白表達(dá)水平與AD患者M(jìn)MSE評分的相關(guān)性分析r=0.799，P<0.01；B：p-PKR蛋白表達(dá)水平與AD患者M(jìn)MSE評分的相關(guān)性分析r=0.674，P<0.05

3 討 論

凋亡，作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的明確機(jī)制之一，在神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞凋亡是AD神經(jīng)元死亡的最主要形式，其與細(xì)胞周期有著緊密的聯(lián)系，因而細(xì)胞周期重啟的失調(diào)逐漸為人們研究AD中神經(jīng)元死亡提供了新視角。雙鏈RNA-依賴的蛋白激酶-PKR，分子量68 kD，為保守雙鏈RNA結(jié)合分子家族成員。細(xì)胞中的PKR主要分布在細(xì)胞質(zhì)，小部分散在分布于核漿。研究表明[1]，低濃度的dsRNA具有活化PKR的作用，而高濃度的dsRNA卻抑制該活化作用。激活的PKR通過促使轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化，促進(jìn)凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。其次，PKR和P38/MAPK通路之間有確定的聯(lián)系，PKR可以通過IKK和P38途徑影響NF-κB通路上基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)凋亡，但是這一過程內(nèi)在復(fù)雜的路徑仍需進(jìn)一步研究[2,3]。再次，IL1、TNF、dsRNA、LPS、IFNs等應(yīng)激相關(guān)信號分子都通過PKR來激活NF-κB通路，啟動(dòng)凋亡程序。如果沒有PKR的活化，NF-κB通路雖然能繼續(xù)作用，但是其作用強(qiáng)度會(huì)減弱[2,4]。細(xì)胞周期蛋白的起始翻譯和調(diào)控參與記憶的形成，它包括兩條通路：mTOR和PKR。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是PI3K/Akt信號通路下游的激酶，與GSK3β并駕齊驅(qū)，PKR為聯(lián)系二者的中間調(diào)節(jié)激酶。同時(shí)，P53也可以在分子水平聯(lián)系PKR信號通路和mTOR信號通路[1]。

這些研究結(jié)果都表明，PKR參與多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中很多傳導(dǎo)通路和信號因子經(jīng)研究已證實(shí)與神經(jīng)變性疾病密切相關(guān)。所以，研究PKR在以阿爾茨海默病為主的神經(jīng)變性病中的表達(dá)具有現(xiàn)實(shí)意義和可行性。最新的研究表明，在AD中，凋亡和細(xì)胞周期失調(diào)不僅局限于中樞神經(jīng)元，而且存在于外周細(xì)胞[5]；與此同時(shí)亦有研究顯示PKR蛋白表達(dá)水平與PD和HD(亨廷頓病)患者海馬區(qū)的神經(jīng)元缺失有關(guān)[6,7]。

據(jù)此，本研究檢測了正常對照者、AD和PD患者外周血淋巴細(xì)胞中total-PKR與p-PKR的蛋白水平。結(jié)果顯示，相較于正常對照組，AD患者淋巴細(xì)胞中total-PKR及其活化形式p-PKR水平均顯著升高，結(jié)果與Julien Couturier等[8,9]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及尸檢中觀察到AD大腦海馬PKR活性增高相一致，這表明PKR蛋白水平的改變不僅發(fā)生在中樞神經(jīng)元，而且存在于外周血淋巴細(xì)胞，可能為AD患者所特有的系統(tǒng)性表現(xiàn)之一，極有可能成為用于AD診斷的外周標(biāo)記物。但是，近來人們對PKR在腦組織中的表達(dá)水平的研究存在爭議，國外有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和尸檢表明[10]p-PKR在AD轉(zhuǎn)基因小鼠和患者大腦中表達(dá)明顯增加，而總的PKR表達(dá)不增加或減少。對于這樣的結(jié)果，我們認(rèn)為與人種、遺傳學(xué)、方法學(xué)上的差異有關(guān)，并且PKR在外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)與在腦組織細(xì)胞中的表達(dá)，存在一定的差別。總的來說，有一點(diǎn)大家的看法是一致的：PKR水平與神經(jīng)退行性疾病特別是阿爾茨海默病相關(guān)。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，AD患者外周血淋巴細(xì)胞與神經(jīng)元在凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制上可能存在相同的缺陷，這為研究其機(jī)制和潛在的治療靶點(diǎn)提供了一種可行、方便的外周細(xì)胞模型。

此外，我們的結(jié)果表明AD患者淋巴細(xì)胞中PKR的蛋白水平及活化與認(rèn)知障礙嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。MMSE評分越低，外周血淋巴細(xì)胞中PKR的表達(dá)水平及活化也就越高。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)PD患者外周血淋巴細(xì)胞中PKR蛋白表達(dá)水平較正常對照組升高，但是由于目前關(guān)于PKR和PD的研究很少，因此本結(jié)果提示作為神經(jīng)變性疾病，在PD中，凋亡及其調(diào)控通路的改變可能不僅局限于中樞神經(jīng)元，同樣存在于外周血。

凋亡是神經(jīng)變性疾病最主要的病理機(jī)制之一，PKR在AD動(dòng)物模型和尸檢中雖然有一定的研究，然而鮮見其在人外周血淋巴細(xì)胞中的研究，在PD外周血淋巴細(xì)胞中的研究國內(nèi)外未見報(bào)道。此外，不加干預(yù)、直接檢測其中的激酶含量在國內(nèi)未見報(bào)道。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AD患者淋巴細(xì)胞中PKR的表達(dá)水平及磷酸化水平均顯著升高，并且PKR在淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平及其活化與AD患者的疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)提示PKR或可做為一條信號通路中的一點(diǎn)或多條信號通路的聯(lián)絡(luò)點(diǎn)與其他蛋白或蛋白激酶一起聯(lián)合用于AD患者早期外周血標(biāo)志物的檢測，從而成為研究AD、PD的另一可行手段，用于病情的早期診斷及評價(jià)，并且由于它的廣泛表達(dá)及便于檢驗(yàn)而應(yīng)用于疾病的人群篩查。

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The relationship between cognitive impairment and the double stranded RNA-dependent protein kinase level in peripheral lymphocytes of Alzheimer’s disease

SHENG Xiaona,LI Xiaoxiao,ZHANG Xiaowei,et al.

(Department of Neurology,the Second Hospital of Hebei Medical University，Key Laboratory of Hebei Neurology,Shijiazhuang 050000,China)

Objective To investigate PKR and its activated status levels of expression in peripheral lymphocytes (PBLs) of Alzheimer’s disease(AD),and to discuss the relationship of this change and cognitive disfunction.Methods Healthy control,AD and PD were set up,containing 20 cases respectively.PKR and phospholated PKR (p-PKR) levels of expression in lymphocytes were detected by Western blotting and the changes of total and activated PKR levels were analyzed in three groups.The relationships of PKR and p-PKR expression levels and diseases durations and severities of AD and PD were discussed by Pearson’s correlation analysis.Results Both total PKR and activated status levels were augmented in PBLs of AD patients compared with controls (P<0.05) and total PKR and p-PKR levels were positively correlated with the cognitive severity (r=0.799，P<0.01).Both PKR and p-PKR levels were increased in lymphocytes of PD patients compared with controls (P<0.05).Conclusion The abnormal expressions of PKR and p-PKR were not only in central neurological system but also in PBLs.Total PKR and p-PKR levels were positively correlated with the cognitive severity of AD patients.Thus PKR may be a potential peripheral biomarker in early diagnosis and cognitive function estimations during AD processes.

PKR; Alzheimer’s disease; Peripheral lymphocytes； Cognitive impairment

2017-04-23；

2017-05-30

河北省重點(diǎn)研發(fā)自籌項(xiàng)目(科技惠民工程)(No.162777151)；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.H2017206156)

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；河北省神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050000; 2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科,河北 石家莊 050000；3.北京四季青醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京 100097)

張國華,E-mall:zhangguohua1983@sina.com

1003-2754(2017)08-0692-04

R749.1

A