柴洪帆，鄭 揚(yáng)，曹 霞

（海南澳美華制藥有限公司，海南 ?？?570311）

·檢驗(yàn)檢測(cè)·

愈創(chuàng)木酚甘油醚和右美沙芬復(fù)方制劑中雜質(zhì)同時(shí)測(cè)定的方法研究

柴洪帆，鄭 揚(yáng)，曹 霞

（海南澳美華制藥有限公司，海南 ?？?570311）

目的 建立可同時(shí)檢測(cè)愈創(chuàng)木酚甘油醚和右美沙芬復(fù)方制劑中有關(guān)物質(zhì)的方法。方法 色譜柱為Waters XBridge C18柱（250 mm× 4.6 mm，3.5 m），流動(dòng)相A為pH＝3.0的磷酸二氫鉀溶液－乙腈（90∶10，V／V），流動(dòng)相B為pH＝2.8的磷酸二氫鉀溶液－乙腈－甲醇（10∶10∶80，V／V／V），梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。結(jié)果 強(qiáng)制降解條件（氧化、酸、堿、高溫、光照）下，主成分與雜質(zhì)均得到了有效檢測(cè)。愈創(chuàng)木酚甘油醚、右美沙芬和其他8種特定雜質(zhì)質(zhì)量濃度在線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。結(jié)論 所建立的方法準(zhǔn)確度、檢測(cè)限、定量限、精密度、耐用性等均符合人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議(ICH)指導(dǎo)原則的要求。

反相高效液相色譜法；愈創(chuàng)木酚甘油醚；右美沙芬；復(fù)方制劑；雜質(zhì)

右美沙芬（dextromethorphan，DM）為 3－甲氧基－17－甲基－（9α，13α，14α）－嗎啡喃氫溴酸一水合物，為白色或類白色結(jié)晶性粉末，無(wú)臭[1]。愈創(chuàng)木酚甘油醚（guaifenesin，GG）為 3－（2－甲氧基苯氧基）丙烷－1，2－二醇，口服后刺激胃黏膜，反射性引起支氣管分泌增加，使痰液稀釋[2]。二者的復(fù)方制劑臨床主要用于治療急、慢性支氣管炎和流行性感冒引起的咳嗽、痰多、咽痛等[3]，也常用于兒童咳嗽的治療[4]。有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)是復(fù)方制劑質(zhì)量控制中最具挑戰(zhàn)性的任務(wù)。愈創(chuàng)木酚甘油醚和氫溴酸右美沙芬收載于美國(guó)藥典（USP35）和歐洲藥典（EP8.0），復(fù)方制劑未見(jiàn)收載。目前，單一組分的檢測(cè)方法得到了廣泛研究[5－8]，但關(guān)于右美沙芬和愈創(chuàng)木酚甘油醚復(fù)方制劑的質(zhì)量研究較少[9－11]。本研究的主要目的是建立愈創(chuàng)木酚甘油醚和右美沙芬復(fù)方制劑的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法，用于監(jiān)控產(chǎn)品的化學(xué)雜質(zhì)，保證產(chǎn)品的安全性和有效性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀，包括Waters Alliance E2695分離系統(tǒng)、Waters 2998光電二極管陣列檢測(cè)器、柱溫箱及 Empower 3色譜工作站；Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）；Binder 720P型藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)箱；XS 105DU型十萬(wàn)分之一電子天平，XP26型百萬(wàn)分之一電子天平（MettlerToledo公司）。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，F(xiàn)isherScientific）；氫溴酸右美沙芬對(duì)照品（DM，批號(hào)為100201－201204），愈創(chuàng)木酚甘油醚對(duì)照品（GG，批號(hào)為100528－201303），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；氫溴酸右美沙芬雜質(zhì)A對(duì)照品（DM－A，批號(hào)為Y0000261，EP）；氫溴酸右美沙芬雜質(zhì)B對(duì)照品（DM－B，批號(hào)為492，LGC）；氫溴酸右美沙芬雜質(zhì)C對(duì)照品（DM－C，批號(hào)為35952，LGC）；氫溴酸右美沙芬雜質(zhì)氮氧化物（DM－N－Oxide，批號(hào)為 32441，LGC）；愈創(chuàng)木酚甘油醚雜質(zhì)A對(duì)照品（GG－A，批號(hào)為C4X－1294－1510，CATO）；愈創(chuàng)木酚甘油醚雜質(zhì)B對(duì)照品（GG－B，批號(hào)為21182，LGC）；愈創(chuàng)木酚甘油醚雜質(zhì)C對(duì)照品（GG－C，批號(hào)為52038，LGC）；愈創(chuàng)木酚甘油醚雜質(zhì) D對(duì)照品（GG－D，批號(hào)為 CX4－1294－1601，CATO）；復(fù)方氨酚美沙芬口服液（批號(hào)為16071401，16072201，16072202，自制樣品）；其他試劑均為分析純。各雜質(zhì)化學(xué)名及簡(jiǎn)寫(xiě)見(jiàn)表1。

表1 愈創(chuàng)木酚甘油醚和右美沙芬雜質(zhì)的化學(xué)名及簡(jiǎn)寫(xiě)

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

系統(tǒng)適用性溶液：分別精密稱取愈創(chuàng)木酚甘油醚雜質(zhì)對(duì)照品（GG－A，GG－B，GG－C，GG－D），氫溴酸右美沙芬雜質(zhì)對(duì)照品(DM－A，DM－B，DM－C，DM－NOxide)，氫溴酸右美沙芬對(duì)照品和愈創(chuàng)木酚甘油醚對(duì)照品，分別配制成約含愈創(chuàng)木酚甘油醚雜質(zhì)對(duì)照品0.003 g／L，氫溴酸右美沙芬雜質(zhì)對(duì)照品0.02 g／L，GG 0.6 g／L及DM 4 g／L的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

供試品溶液：精密吸取復(fù)方氨酚美沙芬口服液2.4 g，置10 mL容量瓶中，加入甲醇－水（50∶50）溶液適量，超聲30 min，定容至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2 色譜條件優(yōu)選

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

采用全波長(zhǎng)檢測(cè)，分別對(duì)主成分DM和GG及其他8種已知雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果全部組分在215～230 nm及273～304 nm波長(zhǎng)范圍有最大吸收，由于215～230 nm波長(zhǎng)接近末端吸收，最終選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在此檢測(cè)波長(zhǎng)下，主成分及其他雜質(zhì)均有良好吸收，同時(shí)基線較為平穩(wěn)。特定雜質(zhì)紫外吸收光譜圖見(jiàn)圖1。

2.2.2 流動(dòng)相梯度洗脫條件

起始梯度洗脫條件的流動(dòng)相：流動(dòng)相A為緩沖鹽－乙腈（90∶10，V∶V），流動(dòng)相B為緩沖鹽－乙腈－甲醇（10∶10∶80，V∶V∶V）；緩沖鹽為0.01 mol／L的磷酸二氫鈉和0.004 6 mol／L的正辛烷磺酸鈉水溶液，稀磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0，梯度洗脫條件見(jiàn)表2。分別考察不同的色譜條件下，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中各雜質(zhì)峰和主峰，以及雜質(zhì)峰之間的分離情況，結(jié)果顯示，由于DM－A，DM，DM－N－Oxide極性極為相似，色譜圖中雜質(zhì)峰與主峰重疊而無(wú)法分離（見(jiàn)圖2）。通過(guò)后續(xù)的梯度洗脫條件、緩沖鹽溶液濃度和種類、柱溫等優(yōu)化篩選得到了最終梯度洗脫條件（見(jiàn)表2），系統(tǒng)適用性溶液中主峰和8個(gè)雜質(zhì)峰可達(dá)到分離要求。

圖1 特定雜質(zhì)的紫外吸收光譜圖

表2 流動(dòng)相優(yōu)選過(guò)程中代表性梯度洗脫條件

梯度洗脫起始條件（階段1）篩選：通過(guò)篩選起始條件，調(diào)整主成分在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間出峰，更有利于主成分與其他8個(gè)特定雜質(zhì)的分離。通過(guò)階段1起始流動(dòng)相比例調(diào)整和梯度斜率的變化，最終選擇起始流動(dòng)相A與B比例由85∶15變化為92∶8，使主成分GG的保留時(shí)間由初始的約10 min調(diào)整至約20 min，相應(yīng)DM的保留時(shí)間由21 min調(diào)整至35～38 min。結(jié)果最終選定流動(dòng)相A與B的比例為92∶8作為啟動(dòng)梯度條件。后續(xù)進(jìn)一步考察DM及與其極性相似的組分（DM－A，DM－NOxide）的分離情況。

圖2 優(yōu)化前色譜條件下系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖

梯度變化階段條件（階段2和階段3）篩選：在設(shè)定階段2條件流動(dòng)相比例為50∶50時(shí)分離效果不理想的情況下，保持梯度比例斜率不變，進(jìn)一步考察流動(dòng)相A與B的比例由50∶50變化為40∶60（即梯度5和梯度17）的分離效果，初步確定采用40∶60更有利于DMA，DM，DM－N－Oxide的分離。進(jìn)一步篩選階段3梯度條件的變化（梯度11至梯度17），結(jié)果顯示，流動(dòng)相A比例升高有助于各成分分離，階段3等度洗脫時(shí)效果更佳，進(jìn)一步增加流動(dòng)相A比例后更有利于DM－A，DM，DM－N－Oxide，DM－A，GG－C的分離。篩選過(guò)程中具有代表性的梯度條件參見(jiàn)圖3。

圖3 梯度洗脫條件篩選

梯度條件優(yōu)化：等度洗脫無(wú)法達(dá)到完全分離，因此變更為梯度洗脫，變化流動(dòng)相A的比例，同時(shí)為達(dá)到全部雜質(zhì)能盡快出峰而得到檢測(cè)，提高階段4的有機(jī)相比例，從而得到優(yōu)化的最終梯度洗脫條件（見(jiàn)表2）。采用優(yōu)化的梯度條件進(jìn)行檢測(cè)，全部組分達(dá)到了分離度要求（圖4）。梯度條件優(yōu)化過(guò)程中具有代表性的梯度條件見(jiàn)圖5。

圖4 最終選定色譜條件下系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖

圖5 梯度洗脫條件優(yōu)化

2.2.3 流動(dòng)相緩沖鹽溶液

緩沖鹽溶液組成：分別采用不同的磷酸鹽（磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀）配制緩沖鹽溶液并配制流動(dòng)相，依法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，不同種類的鹽對(duì)吸收強(qiáng)度有影響，配制相同濃度的緩沖鹽，采用磷酸二氫鉀作為流動(dòng)相時(shí)雜質(zhì)的響應(yīng)值更高，更有利于方法的靈敏度。最終選擇磷酸二氫鉀配制緩沖鹽溶液。

緩沖鹽溶液濃度：分別采用磷酸二氫鉀配制不同濃度的緩沖鹽溶液并配制流動(dòng)相，依法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，緩沖鹽濃度對(duì)峰形有影響。最終選擇磷酸二氫鉀濃度為0.01 mol／L和正辛烷磺酸鈉濃度為0.004 6 mol／L。

緩沖鹽溶液pH：分別調(diào)節(jié)緩沖鹽溶液的不同pH，進(jìn)一步配制成流動(dòng)相，依法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，不同pH的流動(dòng)相對(duì)基線均有一定的影響，pH＝2.8時(shí)基線最平穩(wěn)，更有利于方法的靈敏度。最終選擇緩沖鹽溶液的pH＝2.8。

2.2.4 樣品稀釋劑

分別采用不同的稀釋劑制備供試品加樣溶液（加入限度水平的雜質(zhì)），依法檢測(cè)。結(jié)果顯示，由于不同成分（主成分或雜質(zhì)）的化學(xué)穩(wěn)定性不同，稀釋劑體系會(huì)影響供試品溶液的穩(wěn)定性，采用甲醇－水溶液（50∶50）為稀釋劑時(shí)穩(wěn)定性最佳，能保證供試品加樣溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 色譜柱

所建立的檢測(cè)方法需同時(shí)測(cè)定10種成分，其中3種成分極性與DM極為相似，為保證方法的適用性，進(jìn)行了色譜柱的篩選。分別對(duì)品牌、型號(hào)、常規(guī)參數(shù)等不同的色譜柱行比較試驗(yàn)，最終選擇Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）。

2.2.6 柱溫

在45～55℃范圍內(nèi)對(duì)柱溫進(jìn)行考察，結(jié)果隨著溫度的升高，主峰與雜質(zhì)峰的分離度增大，柱溫為50℃時(shí)分離度良好。

2.3 初步擬訂的檢測(cè)色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，3.5μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為緩沖鹽溶液－乙腈（90∶10），流動(dòng)相B為緩沖鹽溶液－乙腈－甲醇（10∶10∶80），緩沖鹽溶液為0.01 mol／L的磷酸二氫鈉和0.004 6 mol／L的正辛烷磺酸鈉水溶液，稀磷酸調(diào)節(jié)pH為2.8，梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表2的最終條件；流速：0.8 mL／min；柱溫：50℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn)

將樣品經(jīng)高溫、光照、酸、堿和氧化破壞，依法測(cè)定。結(jié)果顯示，樣品在高溫及光照環(huán)境中較穩(wěn)定，基本無(wú)降解；在堿性環(huán)境極不穩(wěn)定，降解產(chǎn)物有待進(jìn)一步明確。同時(shí)，在各降解條件下，DM和GG與輔料峰、各雜質(zhì)峰及降解產(chǎn)物峰均能達(dá)到良好分離，方法專屬性良好。色譜圖見(jiàn)圖6。

圖6 強(qiáng)制降解試驗(yàn)的典型圖譜

2.4.2 檢測(cè)限測(cè)定

取各雜質(zhì)對(duì)照品適量，配制成母液，將母液逐步稀釋，依法進(jìn)樣測(cè)定。將信噪比(S／N)為3∶1時(shí)的進(jìn)樣量作為檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4.3 線性關(guān)系考察

表3 檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果

取各雜質(zhì)對(duì)照品適量，配制系列對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（X，μg／mL）和峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得回歸方程。結(jié)果表明，主成分和各雜質(zhì)對(duì)照品質(zhì)量濃度在線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。根據(jù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定法進(jìn)一步計(jì)算校正因子，用于雜質(zhì)含量的計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 線性關(guān)系考察結(jié)果

表5 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果(%)

2.4.4 精密度試驗(yàn)

平行配制6份供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積的 RSD≤1.5%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取加樣供試品溶液，分別于配制0，2，4，6，8，10，12，18，20，24 h時(shí)各進(jìn)樣測(cè)定1次。結(jié)果主峰峰面積的RSD為 1.6%（n＝10），各限度水平的雜質(zhì)峰面積的RSD≤5.0%（n＝10），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 耐用性試驗(yàn)

分別考察了不同批號(hào)色譜柱、流動(dòng)相配比、流速和柱溫的微小波動(dòng)對(duì)系統(tǒng)適用性溶液中各峰分離度的影響。結(jié)果上述條件微小變化及色譜柱批號(hào)變化后，各物質(zhì)峰之間仍能達(dá)到基線分離，雜質(zhì)峰之間分離度均不小于1.2，表明方法的耐用性良好。

2.5 樣品檢測(cè)

取3批樣品，依法進(jìn)樣測(cè)定，以加校正因子主成分自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的含量。結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

經(jīng)查詢文獻(xiàn)，右美沙芬復(fù)方制劑的法定標(biāo)準(zhǔn)或藥典標(biāo)準(zhǔn)皆未收載其有關(guān)物質(zhì)檢查方法，因此，建立其有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)與控制方法對(duì)于產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有重要意義。右美沙芬復(fù)方制劑中，氫溴酸右美沙芬和愈創(chuàng)木酚甘油醚的穩(wěn)定性具有差異，同時(shí)規(guī)格相差較大（氫溴酸右美沙芬為3 g／mL，愈創(chuàng)木酚甘油醚為20 g／L），為保證質(zhì)量，需要明確各雜質(zhì)的歸屬并進(jìn)行控制，且需要檢驗(yàn)方法具有較高的專屬性和靈敏度。

復(fù)方制劑中主成分氫溴酸右美沙芬和愈創(chuàng)木酚甘油醚極性相差較大，DM－C，DM，DM－N－Oxide，DM－A和GG－C極性相似，為有關(guān)物質(zhì)方法的研究帶來(lái)了挑戰(zhàn)。采用高效液相色譜法分析，能夠?qū)崿F(xiàn)較好的分離效果。因此，本研究中采用反相高效液相色譜梯度洗脫條件進(jìn)行設(shè)計(jì)，分別對(duì)梯度洗脫條件、緩沖鹽的種類和溶液濃度、柱溫、色譜柱等色譜條件進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，在擬訂色譜條件下，主成分DM和GG、防腐劑苯甲酸鈉（BN）、DM和GG的8個(gè)已知雜質(zhì)，以及其他雜質(zhì)均可達(dá)到良好分離，從而建立了行之有效的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法，可用于產(chǎn)品的質(zhì)量控制[12]。進(jìn)一步對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果表明，方法的準(zhǔn)確度、檢測(cè)限、定量限、精密度、耐用性等均符合ICH指導(dǎo)原則的要求。

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Simultaneous Determination of Impurities in Guaifenesin and Dextromethorphan Compound Preparation

Chai Hongfan，Zheng Yang，Cao Xia
（Hainan Bright Future Pharmaceutical Co.，Ltd.，Haikou，Hainan，China 570311）

Objective To establish a method for simultaneous determination of guaifenesin and dextromethorphan compound preparation.Methods The chromatographic column was Waters XBridge C18column（250 mm×4.6 mm，3.5μm）.The mobile phase A consisted of pH＝3.0 monopotassium phosphate solution－acetonitrile（90∶10，V／V），the mobile phase B consisted of pH＝3.0 monopotassium phosphate solution－acetonitrile－methanol（10∶10∶80，V／V／V），gradient elution，the detection wavelength was 280 nm.Results Under the conditions of forced degradation（oxidation，acid，alkali，high temperature，light），the principal components and impurities were effectively detected.Guaifenesin，dextromethorphan and other 8 kinds of specific impurities had a good linear relationship in the concentration range.Conclusion The established method is validated according to ICH guidelines with respect to accuracy，limits of inspection，limits of quantification，precision and durability.

RP－HPLC；guaifenesin；dextromethorphan；compound preparation；impurity

R927

A

1006－4931(2017)16－0018－06

2016－12－07；

2017－04－28)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.16.006

柴洪帆，女，碩士研究生，中級(jí)工程師，研究方向?yàn)樗幤焚|(zhì)量控制，（電子信箱）wangy1580＠163.com。