張 林吳潔瓊張 偉張鋒利史 英林俊超

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000）

青柏潰結(jié)湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠療效的研究*

張 林1吳潔瓊2△張 偉2張鋒利2史 英2林俊超1

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000）

目的 觀察青柏潰結(jié)湯對乙酸誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型結(jié)腸黏膜愈合及血清細(xì)胞因子的影響并探討其機(jī)制。方法 將77只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、青柏潰結(jié)湯高劑量組、青柏潰結(jié)湯中劑量組、青柏潰結(jié)湯低劑量組、柳氮磺吡啶組、康復(fù)新液組，各11只，除空白組外其余各組采用乙酸造模。造模后第3開始灌腸給藥，連續(xù)7 d，隨后觀察各組結(jié)腸組織并評分。用ELISA檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）含量。結(jié)果 與模型組比較，各治療組血清TNF-α含量下降、IL-10含量升高。結(jié)論 青柏潰結(jié)湯能明顯減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織的損傷程度，這可能與其下調(diào)TNF-α、上調(diào)IL-10的水平有關(guān)。

青柏潰結(jié)湯 潰瘍性結(jié)腸炎 TNF-α IL-10

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）病情反復(fù)遷延、難以根治［1-2］。長期反復(fù)發(fā)作可誘發(fā)癌變，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［3-4］。筆者在臨床上采用青柏潰結(jié)湯保留灌腸治療UC取得了較好療效。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD雄性大鼠77只，體質(zhì)量220～250 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（陜）2012-003。

1.2 實驗藥物 青柏潰結(jié)湯（藥用黃柏9 g，苦參20 g，大青葉12 g，板蘭根20 g，烏賊骨25 g，炒薏苡仁30 g，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科熬制完成，所得水煎液每毫升含2 g生藥，中、低劑量青柏潰結(jié)湯由高劑量青柏潰結(jié)湯稀釋而來），柳氮磺吡啶（上海信誼天平藥業(yè)有限公司），康復(fù)新液（湖南科倫制藥有限公司，批號M160918）。

1.3 試劑與儀器 水合氯醛 （上海山浦化工有限公司），溶于0.9%氯化鈉注射液配成10%的混合液。冰乙酸（天津市天力化學(xué)試劑有限公司），溶于0.9%氯化鈉注射液配成8%的混合液。水合氯醛TNF-α、IL-10試劑盒（上海橋杜生物科技有限公司，批號RA20040，RA20095）。RT-6100酶標(biāo)分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司），GREEN-30T實驗室級高純水器（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司制造），S.HH.W21.600-S水浴箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）

1.4 模型制備 大鼠禁食不禁水24 h后用10%的水合氯醛（3 mL/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉，8%乙酸1 mL注入距肛門7 cm處的結(jié)腸腔，灌注30 s，然后用5 mL生理鹽水沖洗1次，而后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5 分組與給藥 將健康雄性SD大鼠正常飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為即空白組等體積。0.9%氯化鈉注射液、模型組（等體積0.9%氯化鈉注射液）、青柏潰結(jié)湯高劑量組（2 g/mL）、青柏潰結(jié)湯中劑量組（1 mg/L）、青柏潰結(jié)湯低劑量組（0.5 g/mL）、柳氮磺吡啶組（0.5 g/kg）、康復(fù)新液組（5 mL/kg），除空白組以外，其余各組按上述方法復(fù)制UC模型。造模后第3日每組隨機(jī)取2只做病檢以確定造型成功，然后開始灌腸給藥，每日1次，連續(xù)7 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化。取出距離肛門2 cm以上8 cm處的結(jié)腸段，將其表面清理干凈并縱向剪開腸腔，預(yù)冷0.9%氯化鈉注射液反復(fù)沖洗直至干凈，濾紙吸干水分，肉眼觀察結(jié)腸組織并評分。取病變嚴(yán)重處約1 cm于10%甲醛溶液中固定，行HE染色，顯微鏡下觀察結(jié)腸形態(tài)學(xué)變化并根據(jù)Sykes標(biāo)準(zhǔn)評分［5］。組織病理學(xué)評分為腸上皮形態(tài)與炎癥浸潤積分之和。見表1。2）ELISA法檢測各組大鼠血清里的TNF-α、IL-10含量。按照試劑盒說明書操作。

表1 結(jié)腸組織肉眼大體觀及鏡下病理學(xué)評分依據(jù)

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布時，計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 各組大鼠按上訴藥物治療后：空白組大鼠精神可，活動自如，毛發(fā)光澤，大便顆粒狀，無腹瀉和便血；模型組大鼠精神萎靡，活動明顯減少，毛發(fā)無光澤，大便腹瀉或稀軟，部分可見肉眼血便；治療各組可見不同程度的緩解。

2.2 大鼠結(jié)腸肉眼觀察結(jié)果 見圖1?？瞻捉M大鼠結(jié)腸細(xì)長，腸腔光滑，黏膜皺襞完整清晰。乙酸造模后，病變結(jié)腸黏膜出現(xiàn)充血水腫，伴有糜爛及潰瘍。治療各組的大鼠結(jié)腸潰瘍面減小，充血減輕，以中、低劑量青柏潰結(jié)湯組最好，柳氮磺吡啶組次之，高劑量青柏潰結(jié)湯組及康復(fù)新組較差。

2.3 大鼠結(jié)腸損傷大體評分 見表2。

圖1 各組大鼠治療后結(jié)腸黏膜肉眼觀察結(jié)果

表2 各組大鼠治療后結(jié)腸組織大體評分比較（n）

2.4 各組結(jié)腸組織病理觀察結(jié)果 空白組大鼠具有結(jié)構(gòu)完整的結(jié)腸黏膜，腺體整齊排列，無明顯炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠的結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，局部黏膜壞死、脫落，部分病變可達(dá)肌層，腺體排列紊亂或缺如，部分區(qū)域的細(xì)胞水腫、充血，可見形成的潰瘍，細(xì)胞間質(zhì)有大量浸潤的炎性細(xì)胞；高劑量青柏潰結(jié)湯組、康復(fù)新液組未見明顯愈合跡象，其余各治療組有明顯愈合跡象，中、低劑量青柏潰結(jié)湯組愈合最好，上皮和增生最多，炎性細(xì)胞浸潤最少，柳氮磺吡啶組次之，見圖2，組織學(xué)評分見表3。

圖2 各組大鼠治療后結(jié)腸病理學(xué)結(jié)果（HE染色，20倍）

2.5 各組血清TNF-α、IL-10含量比較 見表4。

3 討 論

用乙酸法復(fù)制結(jié)腸炎模型是常用的UC模型之一，其機(jī)制可能與乙酸的化學(xué)刺激造成的結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡、黏膜屏障結(jié)構(gòu)被破壞有關(guān)［6］，增加腸黏膜通透性，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的浸潤、炎癥介質(zhì)的表達(dá)（TNF-α、IL）等［7］，此方法簡便易行、穩(wěn)定性好、可靠率高、周期偏短、成本較低，適用于開發(fā)新藥和評估療效［8］。

表3 各組大鼠治療后組織學(xué)評分比較（分，±s）

表3 各組大鼠治療后組織學(xué)評分比較（分，±s）

組別 n 組織學(xué)評分空白組 11 -模型組 9 6.60±0.89高劑量青柏潰結(jié)湯組 9 5.33±0.77中劑量青柏潰結(jié)湯組 9 4.42±1.24*低劑量青柏潰結(jié)湯組 9 4.27±1.50*柳氮磺吡啶組 9 5.02±1.18康復(fù)新液組 9 6.33±1.37

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-10含量比較（pg/mL，±s）

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-10含量比較（pg/mL，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與柳氮磺吡啶組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與康復(fù)新液組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n空白組 11模型組 9高劑量青柏潰結(jié)湯組 9中劑量青柏潰結(jié)湯組 9低劑量青柏潰結(jié)湯組 9柳氮磺吡啶組 9康復(fù)新液組 9 TNF-α IL-10 46.35±12.25 80.94±7.93 108.72±23.84△37.52±4.95△△101.42±24.49 41.94±3.94△△67.38±18.84**##69.20±8.40**△△##66.49±18.76**△##66.04±4.73**△△##85.47±18.77*56.96±8.06**##102.95±21.85 42.00±5.99△△

目前人們越來越重視UC的發(fā)病機(jī)制，特別是細(xì)胞因子發(fā)病機(jī)制［9］。促炎性和抑炎性細(xì)胞因子兩者失衡引起的異常被視作UC的重要發(fā)病機(jī)制［10］。TNF-α是公認(rèn)的重要的促炎性細(xì)胞因子之一，由活化的T淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞分泌［11］，其引起腸道黏膜損傷的機(jī)制可能包括生成氧自由基和白三烯、促進(jìn)釋放血小板活化因子、誘導(dǎo)合成一氧化氮［12］，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，用抗TNF單克隆抗體-英夫利昔單抗治療的重癥UC患者病情有所緩解也進(jìn)一步說明了腫瘤壞死因子參與UC的病變過程［8］。IL-10又叫細(xì)胞因子合成抑制因子，目前大多認(rèn)為IL-10是一種負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，其對免疫炎癥發(fā)展過程的多個環(huán)節(jié)皆有阻斷作用，免疫抑制活性具有廣泛性，可抑制多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，周毅等［13］研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)UC大鼠血清1L-10含量降低。

青柏潰結(jié)湯是我科的院內(nèi)方，引用此方治療UC患者已有10余年，從開始運(yùn)用此方到現(xiàn)在，約有500個UC患者接受青柏潰結(jié)湯治療，取得了不錯的臨床療效。UC在中醫(yī)學(xué)屬于“久痢”范疇，病位在大腸，基本病機(jī)為濕熱蘊(yùn)腸、氣滯絡(luò)瘀?；顒悠诙嘁姼雇础⒏篂a（大便為黏液膿血樣）、里急后重等癥，濕熱蘊(yùn)腸，氣血不調(diào)為其主要表現(xiàn)［14］。自擬青柏潰結(jié)湯（原名潰結(jié)Ⅰ號方）灌腸治療，組方中的大青葉和板藍(lán)根清熱、解毒、涼血，清除疫毒之邪；黃柏和苦參清熱、燥濕，清除內(nèi)蘊(yùn)臟腑濕熱。配炒薏苡仁利水、滲濕、清熱、排膿，清腸道腐敗膿血，佐烏賊骨制酸止痛、收斂止血。使用青柏潰結(jié)湯灌腸可清熱化濕、調(diào)和氣血［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，局部黏膜壞死、脫落，部分病變可達(dá)肌層，腺體排列紊亂或缺如，部分區(qū)域的細(xì)胞水腫、充血，可見形成的潰瘍，細(xì)胞間質(zhì)有大量浸潤的炎性細(xì)胞；高劑量青柏潰結(jié)湯組、康復(fù)新液組未見明顯愈合跡象，其余各治療組有明顯愈合跡象，中、低劑量青柏潰結(jié)湯組愈合最好，上皮和增生最多，炎性細(xì)胞浸潤最少，柳氮磺吡啶組次之，說明青柏潰結(jié)湯具有明確緩解UC的功效，且治療效果優(yōu)于西藥對照組柳氮磺吡啶及中藥對照組康復(fù)新液。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，模型組的TNF-α高于治療組，IL-10則低于治療組。綜上所述，青柏潰結(jié)湯可能是通過降低細(xì)胞因子TNF-α，升高IL-10來抑制UC的炎癥反應(yīng)，關(guān)于青柏潰結(jié)湯治療UC具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深究。

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Study on Effects of Qingbai Kuijie Decoction on Ulcerative Colitis Rats

ZHANG Lin，WU Jieqiong，ZHANG Wei，et al.Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Shanxi，Xianyang 712000，China.

Objective：To observe the effect of Qingbai Kuijie Decoction on the healing of colonic mucosa and serum cytokines in rats with ulcerative colitis induced by acetic acid.Methods：77 male SD rats were randomly divided into the control group，the model group，high dose group of Qingbai Kuijie Decoction，middle dose group of Qingbai Kuijie Decoction，low dose group of Qingbai Kuijie Decoction，sulfasalazine group and Kangfuxin Decoction group，11 cases in each.Except the control group，the remaining groups were modeled with acetic acid.Three days after modelling，the rats were given enema for 7 days.Then the colon tissues of each group were observed and scored.Serum levels of TNF-α and IL-10 were detected by ELISA.Results：Compared with the model group，the serum levels of TNF-α decreased and the content of IL-10 increased in the other groups.Conclusion：Qingbai Kuijie Decoction can significantly alleviate the damage degree of colon tissue in rats with ulcerative colitis，which may be related to the down-regulation of TNF-α and up-regulation of IL-10.

Qingbai Kuijie Decoction；Ulcerative colitis；IL-10；TNF-α

R285.5

A

1004-745X（2017）08-1352-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.08.011

2017-05-26）

陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院院內(nèi)培育課題（2016QN02）；陜西省中醫(yī)藥管理局第五批省級中醫(yī)藥重點學(xué)科-中醫(yī)脾胃病學(xué)（陜中醫(yī)藥發(fā)［2013］43號）

△通信作者（電子郵箱：2962128717@qq.com）