彭紹鵬，劉建雄，崔慶榮，周東春，周 廣，王 超

(1.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省中醫(yī)藥管理局，甘肅 蘭州 730000;3.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000)

·實驗研究·

大黃素對腦出血大鼠血腫周圍腦組織含水量、腫瘤壞死因子-α和谷氨酸表達水平的影響*

彭紹鵬1，劉建雄1，崔慶榮2，周東春1，周 廣3，王 超3

(1.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省中醫(yī)藥管理局，甘肅 蘭州 730000;3.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000)

目的：探討大黃素對腦出血大鼠血腫周圍腦組織含水量、腫瘤壞死因子-α和谷氨酸表達水平的影響及其治療腦水腫的可能機制。方法：取自體股動脈血約100 μL，注入大鼠紋狀體區(qū)域，采用隨機分組法分為大黃素治療組、假手術(shù)組和模型對照組3組，每組30只。假手術(shù)組和模型對照組以生理鹽水灌胃，每次給藥劑量為6 μL /g體質(zhì)量，1 d 2次；大黃素治療組在造模成功后以6 g/L大黃素混懸液灌胃，給藥劑量為100 μg/g體質(zhì)量，1 d 1次。術(shù)后通過大鼠改良Bederson評分進行行為學評定，干濕重法測腦組織含水量，雙抗體夾心ELISA法檢測腦組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，免疫組化法檢測腦組織中谷氨酸(glutamate，Glu)表達。結(jié)果：模型對照組的改良Bederson評分明顯高于同時間點的假手術(shù)組(P<0.05)；各時間點的大黃素治療組的改良Bederson評分均低于同時間點的模型對照組(P<0.05)。模型對照組血腫周圍腦組織含水量、TNF-α和Glu與同時間點的假手術(shù)組對比，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；造模后第5天腦組織含水量、TNF-α和Glu表達均達最高值，3個指標之間呈正相關(guān)性。大黃素治療組血腫周圍腦組織含水量、TNF-α和Glu較同時間點的模型對照組均降低，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且3個指標在第5天均達最高值，3者之間呈正相關(guān)性。結(jié)論：腦出血大鼠出現(xiàn)明顯的腦水腫和神經(jīng)功能損傷，且出血后TNF-α和Glu在第5天達到最高值，可能的生物學效應機制是大黃素抑制炎性因子的釋放、降低谷氨酸的表達水平。

大黃素/作用；腦出血；腦水腫；腫瘤壞死因子-α；谷氨酸；動物；大鼠

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是腦血管病中發(fā)病急、病情嚴重、致殘率和致死率非常高的非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)出血性疾病[1-2]。病理學研究[3-4]發(fā)現(xiàn)：出血后血腫周圍腦組織因腦血流改變、腦組織水腫、炎癥刺激和細胞凋亡等很容易引起氨基酸的釋放，最終導致抑制性和興奮性氨基酸平衡失調(diào)。研究[5]發(fā)現(xiàn)：炎性因子可導致腦出血后腦水腫和繼發(fā)性神經(jīng)損傷。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)屬于前炎性細胞因子，在誘導炎癥反應過程中起重要作用[6]；谷氨酸(glutamate，Glu) 是凝血酶受體重要的激動劑，在腦細胞的能量代謝中具有加速代謝障礙、誘導細胞凋亡的作用[7]。本研究采用自體血腦內(nèi)注射法制備腦出血大鼠模型，予以大黃素干預，檢測了不同時間點血腫周圍腦組織含水量、TNF-α及谷氨酸的表達水平。

1 材料與方法

本實驗采用隨機對照動物實驗，于2016年1月—2016年6月在甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心完成。飼養(yǎng)溫度控制在20～25 ℃，光照充足，自由飲食、飲水，所有的實驗動物操作程序符合《實驗動物管理和使用指南》規(guī)定，并經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學醫(yī)學倫理委員會批準。

1.1 動 物

SPF級6周齡SD大鼠90只，體質(zhì)量(200±20) g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗動物中心提供，批號SYXK(甘)2015-0001-62001000000038。

1.2 藥品、試劑與儀器

大黃素標準品, 20 mg/支，中國藥品生物制品檢定所提供，批號110756。稱取大黃素0.6 g，加90 mL 雙蒸餾水、10 mL吐溫-80，配置成質(zhì)量分數(shù)6 g/L 的大黃素混懸液，無菌玻璃瓶盛裝，封口膜封閉瓶口，置4 ℃冰箱備用，使用前復溫至37 ℃且搖勻。小鼠抗大鼠AQP4單克隆抗體，美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，批號20100364；改進型檸檬酸鈉抗原修復液(50×)，上海碧云天公司產(chǎn)品，批號20151026；SAP法檢測試劑盒，北京中杉金橋公司產(chǎn)品，批號20160325；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒，上海碧云天公司產(chǎn)品，批號20151018；RT-PCR試劑盒，武漢博士德公司產(chǎn)品，批號20100364。FA 1104型電子分析天平，上海天平儀器廠產(chǎn)品；動物缺氧活動箱，深圳瑞沃德公司產(chǎn)品，批號20151112；BM-E型生物研究顯微鏡，德國Leica公司產(chǎn)品；Olypums-45型顯微生物照相顯微鏡，日本Olypums公司產(chǎn)品；ND-1000型紫外分光光度計，美國Thermo公司產(chǎn)品；C1000型普通PCR儀、CFX-96型實時定量PCR儀，均為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.3 自體腦出血模型的建立

采用自體血腦內(nèi)注射法。參照王哲等[8]設計的自體腦出血模型造模方法，具體方法如下：以水合氯醛(100 μg/g)腹腔注射麻醉大鼠；固定于腦立體定位儀上；常規(guī)消毒后取中位線位置切開大鼠頭皮，去骨膜，暴露前囟，壓迫止血；用高速牙科顱鉆在顱骨上鉆孔(直徑約2 mm)至硬腦膜，可見坐標為前囟前0.2 mm、旁開3.5 mm、深5.5 mm，即大鼠紋狀體區(qū)域；使用胰島素針取股動脈血約100 μL，立即緩慢勻速(20 μL/min)注射至大鼠紋狀體區(qū)域；注射完畢停留20 min，緩慢拔出胰島素針頭；骨蠟封閉骨孔；消毒并縫合切口。

1.4 動物分組與給藥

將動物隨機分為大黃素治療組、假手術(shù)組和模型對照組3組，每組30只。所有的大鼠在腦立體定位后6 h進行首次灌胃，其后按設計頻率灌胃直至腦立體定位后7 d時給藥結(jié)束。假手術(shù)組和模型對照組以生理鹽水灌胃，每次給藥劑量為6 μL /g體質(zhì)量，1 d 2次；大黃素治療組在造模成功后以6 g/L大黃素混懸液灌胃，1 d 1次，給藥劑量為100 μg/g體質(zhì)量。

1.5 檢測指標

選取出血后5個觀察點，即造模成功后的第1，2，3，5，7 天，每個觀察點觀察6只大鼠。各組均進行行為學檢測，檢測后處死大鼠，取材，石蠟包埋或流式細胞術(shù)檢測。

1.5.1 行為學評定

按照改良Bederson法[9]，在造模成功后的第1，2，3，5，7天分別觀察大鼠的神經(jīng)功能情況，并給出評分。該評分的高低與神經(jīng)損傷程度的嚴重性呈正相關(guān)。0分：神經(jīng)功能基本正常。0.5分：四肢均出現(xiàn)屈曲情況，提尾懸空實驗(+)。1分：前肢存在屈曲。1.5分：僅一側(cè)前肢存在屈曲。2分：側(cè)向推力實驗(+)，前肢可出現(xiàn)屈曲現(xiàn)象。2.5分：抵抗側(cè)推能力下降，同時出現(xiàn)后肢屈曲現(xiàn)象，但大鼠轉(zhuǎn)圈行為不出現(xiàn)。3分：除可以觀察到的2分行為以外，還出現(xiàn)自發(fā)性旋轉(zhuǎn)現(xiàn)象。

1.5.2 腦組織含水量

按照參考文獻[10]測定方法，在相應的時間點常規(guī)處死大鼠，去除額極后取病變側(cè)腦組織約2 mm厚，采用干濕重法測定腦出血灶周圍腦組織含水量。①腦組織濕重測定： 將腦組織放入事先已稱重的錫紙(A表示)中，然后立即稱量其質(zhì)量(B表示)，B-A即是腦組織濕重。②腦組織干重測定：將腦組織用A包裹，放入電烤箱內(nèi)，溫度100 ℃ 烘干 24 h后取出，待溫度恢復到室溫時稱量質(zhì)量(C表示)，C-A=干重。③腦組織含水量計算：腦組織含水量=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%，字母表示為：(B-C)/(B-A)×100%。

1.5.3 腦組織TNF-α含量

在術(shù)后不同時間點，以手術(shù)針眼為中心取厚約2 mm、質(zhì)量約200 mg的腦組織；充分磨碎使腦組織漿化，制成400 g/L 組織勻漿；4 ℃ 4 000 r/min離心15 min后取上清液，采用雙抗體夾心ELISA法檢測腦組織TNF-α含量，嚴格根據(jù)試劑盒說明書進行。

1.5.4 腦組織Glu表達水平

以手術(shù)針眼為中心取厚約2 mm、質(zhì)量約 200 mg 的腦組織，-70 ℃保存；將組織放入質(zhì)量分數(shù)為40 g/L的多聚甲醛(pH 值7.4)固定液固定4 h；轉(zhuǎn)入100，200，300 g/L 蔗糖PBS浸泡以防冰晶；用0.01 mol/L PBS稍作沖洗；在切片機里連續(xù)切成厚約10 μm的組織切片，甲苯胺藍液顯色定位。采用免疫組化法檢測腦組織中Glu表達，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用陽性細胞計數(shù)法，每張切片在400倍物鏡下分別選取血腫周圍不重復的5個視野(HP)，計數(shù)Glu陽性細胞數(shù)，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠改良Bederson評分對比

模型對照組改良Bederson評分明顯高于同時間點的假手術(shù)組,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各時間點的大黃素治療組的改良Bederson評分均低于同時間點模型對照組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠改良Bederson評分對比 分,

注：與同時間點假手術(shù)組對比,*P<0.05；與同時間點模型對照組對比，#P<0.05。

2.2 各組大鼠腦組織含水量、TNF-α及Glu表達對比

模型對照組血腫周圍腦組織含水量、TNF-α及Glu與同時間點的假手術(shù)組對比，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；造模后第5天腦組織含水量、TNF-α和Glu表達均達到最高值，3個指標之間呈正相關(guān)性。大黃素治療組血腫周圍腦組織含水量、TNF-α和Glu較同時間點模型對照組均降低，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且3個指標在第5天均達最高值，3者之間呈正相關(guān)性。見表2。

級 別時間腦組織含水量/%TNF?α/(ng·L-1)Glu/(μmol·L-1)假手術(shù)組造模后第1天74．23±2．580．96±0．132．73±0．68造模后第2天74．23±2．580．96±0．132．73±0．68造模后第3天74．23±2．580．96±0．132．73±0．68造模后第5天74．23±2．580．96±0．132．73±0．68造模后第7天74．23±2．580．96±0．132．73±0．68模型對照組造模后第1天80．84±1．19?8．64±1．36?10．78±0．68?造模后第2天83．42±1．01?9．03±2．50?22．93±1．79?造模后第3天87．34±0．21?9．80±2．53?32．55±3．80?造模后第5天91．62±1．08?12．38±3．47?37．28±4．20?造模后第7天88．63±1．02?10．57±2．80?7．48±0．46?大黃素治療組造模后第1天77．91±1．16?#5．34±1．01?#7．87±1．12?#造模后第2天79．95±1．02?#5．96±1．04?#17．58±2．83?#造模后第3天82．87±1．04?#6．22±1．55?#24．64±2．68?#造模后第5天86．50±1．01?#7．78±1．85?#26．08±3．13?#造模后第7天84．31±1．02?#3．26±0．58?#5．26±0．84?#

注：與同時間點假手術(shù)組對比，*P<0.05；與同時間點模型對照組對比,#P<0.05。

3 討 論

腦出血嚴重危害人類的健康，流行病學研究[11]發(fā)現(xiàn)：我國每年新發(fā)病ICH患者約200萬人，每年的發(fā)病患者約600萬人，死亡率40%～60%，存活患者中伴有不同程度后遺癥者約占80%，給患者家庭及社會造成巨大的經(jīng)濟負擔和精神負擔。研究[12]表明：腦出血時多伴有不同程度的腦水腫和炎性因子釋放。TNF-α是前炎性細胞因子，可直接促進中性粒細胞向病灶區(qū)聚集，誘導受損細胞釋放較多的炎性細胞因子，這與腦出血后周圍腦組織水分含量呈正相關(guān)性[13]。Glu主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是最強的神經(jīng)興奮性遞質(zhì)[14]。在機體正常情況下，Glu作用于突觸后膜的特異性受體，完成興奮性突觸傳遞的生理性作用，常常與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)保持著動態(tài)平衡。研究[15]發(fā)現(xiàn)：Glu含量過高,組織間平衡性被打破，神經(jīng)毒性釋放過度，加重繼發(fā)性腦損傷的程度。因此，探討TNF-α和Glu表達水平在腦水腫的發(fā)病機制中有著重要意義。腦出血屬中醫(yī)學“出血性中風”范疇，病因較為復雜，屬本虛標實之證。相關(guān)研究顯示痰熱腑實證占中風中醫(yī)分型的74.17%，因此在治療中給予通腑療法是十分重要的[16]。近年來，大黃作為瀉下藥的代表性藥物，在腦卒中治療中的應用引起了國內(nèi)外研究者的重視[17]，但大黃在ICH后病理生理過程中的作用機制并不明確；因此，探討大黃素對腦出血后腦水腫及血腫周圍TNF-α和Glu表達水平的影響，對揭示大黃治療腦出血的機制有一定意義?！端貑枴ど鷼馔ㄌ煺摗吩唬骸瓣枤庹?，大怒則行氣絕、而血菀于上，使人薄厥?！贝顺浞终f明了氣血并走于上、逆亂犯腦是中風的基本病機。治以通降之法，給予大黃能起到釜底抽薪的作用，使?jié)釟馔ń?、氣機疏通、氣血下行，最終使神明復蘇，氣復返則生。大黃素主要存在蓼科植物大黃、虎杖、何首烏等的根莖中，是一種蒽醌類物質(zhì)。目前，人們對大黃素認知的主要藥理作用為抗腫瘤、免疫抑制、解痙止咳、利尿、降壓、瀉下等，其中腦中的血藥濃度約為血中藥物濃度的1/5[18]。

從本實驗結(jié)果可以看出，TNF-α和Glu參與了ICH后腦水腫的形成，隨著病情的變化、病程的進展，TNF-α呈動態(tài)發(fā)展，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，大黃素治療組的TNF-α在第5天達最高值，此可提示大鼠ICH后腦水腫癥狀減輕，血腫的TNF-α隨之降低，呈正相關(guān)性。其可能的機制是：TNF-α在ICH后誘導對其敏感的細胞發(fā)生細胞毒性作用，加速細胞凋亡并誘導細胞毒性腦水腫的出現(xiàn)和自由基形成。ICH后腦內(nèi)血腫壓迫局域組織造成局部組織的缺血性再灌注，產(chǎn)生大量的超氧陰離子和炎性反應，激活病灶區(qū)的多形白細胞產(chǎn)生大量氧自由基，自由基導致腦組織微血管內(nèi)皮細胞壞死，引起腦血管通透性增加，進一步加重腦水腫，形成腦組織損傷的惡性循環(huán)。從本實驗結(jié)果可以看出，大黃素干預組大鼠血腫周圍Glu含量變化與模型對照組對比差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與腦組織含水量變化一致，因此，可推斷大黃素通過抑制腦出血血腫周圍組織中Glu的含量來減輕腦出血后腦水腫程度。

綜上所述，TNF-α和Glu在ICH患者的血清中呈高表達，兩者的異常增高提示ICH后血腫的嚴重程度，提示血清中TNF-α和Glu的表達可以作為預測ICH腦水腫病情輕重的重要客觀指標。采用大黃素治療ICH，在縮短血腫吸收時間、減輕腦出血后腦水腫方面作用明確，可能的機制是大黃素抑制TNF-α和Glu的表達。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2017)08-0063-05

R743.34

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.08.28

劉建雄，教授，主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，ljx-512@163.com

甘肅省中醫(yī)藥管理局立項課題(GZK-2016-7)

2016-11-21；

2017-07-03