張淑琴，歐陽(yáng)存，宣 博，陳 茜，楊廣笑，何光源，陳明潔

(1.江漢大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430000；2.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430000)

褐藻多糖硫酸酯、舒血寧注射液和丹紅注射液對(duì)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的影響比較

張淑琴1，歐陽(yáng)存1，宣 博2，陳 茜2，楊廣笑2，何光源2，陳明潔2

(1.江漢大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430000；2.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430000)

目的探討褐藻多糖硫酸酯、舒血寧注射液和丹紅注射液對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞增殖及缺糖缺氧保護(hù)的影響。方法在體外培養(yǎng)的SH-SY5Y 細(xì)胞中加入不同濃度的褐藻多糖硫酸酯、舒血寧注射液和丹紅注射液，處理不同時(shí)間，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性；對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞進(jìn)行糖氧剝奪處理，加入不同濃度的三種藥物處理細(xì)胞，分析三種藥物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖及缺氧缺糖導(dǎo)致的細(xì)胞損傷的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三種藥物處理后細(xì)胞的周期變化。結(jié)果三種藥物在一定濃度范圍內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞增殖。0.8 g/L褐藻多糖硫酸酯作用48 h后顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，細(xì)胞增殖率提高63.6%；對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的糖氧剝奪損傷有保護(hù)作用，細(xì)胞增殖率比對(duì)照提高13.5%；明顯增加S期細(xì)胞比例，作用24 h由10.89%增加至18.18%。10%舒血寧注射液作用48 h后顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，細(xì)胞增殖率提高55.0%；對(duì)細(xì)胞糖氧剝奪損傷有保護(hù)作用，細(xì)胞增殖率比對(duì)照提高20.1%；對(duì)細(xì)胞周期無(wú)明顯影響。5%丹紅注射液作用48 h后顯著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞增殖率提高89.4%；明顯增加S期細(xì)胞比例，作用72 h由15.05%增加至22.0%；但對(duì)細(xì)胞缺氧缺糖損傷無(wú)明顯影響。結(jié)論一定濃度的褐藻多糖硫酸酯、舒血寧和丹紅在體外均顯著促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞的增殖，褐藻多糖硫酸酯和舒血寧降低缺氧缺糖導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。三種藥物均具有有效的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。

褐藻多糖硫酸酯，舒血寧，丹紅，SH-SY5Y細(xì)胞，細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期，糖氧剝奪，神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)

腦血管疾病(CVD)是神經(jīng)系統(tǒng)的常見(jiàn)多發(fā)病，是目前導(dǎo)致人類死亡的三大主要疾病之一，并且存活者中有50%～70%的致殘率，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[1]。而腦梗死(缺血性腦卒中)是CVD中最常見(jiàn)的類型，占全部CVD的70%，是一種急性起病的腦血液供應(yīng)障礙疾病，由多種病理因素和危險(xiǎn)因素參與，導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧性壞死，出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損[1，2]。對(duì)于如何提高急性腦梗死的療效，降低死亡率及致殘率，一直是目前的研究熱點(diǎn)。本研究從神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)性著手，觀察褐藻多糖硫酸酯、舒血寧注射液和丹紅注射液幾種藥物的神經(jīng)保護(hù)影響。褐藻多糖硫酸酯是從褐藻中提取的一類硫酸化多糖，主要由巖藻糖和硫酸基組成，具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[2]。舒血寧注射液和丹紅注射液是缺血性腦血管疾病的臨床用藥，其療效得到一定的認(rèn)可，褐藻多糖硫酸酯目前尚沒(méi)有應(yīng)用于臨床。2012年6月至2016年2月作者以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞為材料，通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)與增殖檢測(cè)、細(xì)胞周期分析和缺氧缺糖損傷處理，比較褐藻多糖硫酸酯、舒血寧注射液和丹紅注射液對(duì)人神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響以及對(duì)細(xì)胞缺氧缺糖損傷的保護(hù)作用。希望此研究對(duì)缺血性腦血管疾病的臨床藥物的開(kāi)發(fā)、選擇和使用具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1材料褐藻多糖硫酸酯、胰蛋白酶、MTT以及DMSO均購(gòu)自Sigma公司。丹紅注射液由荷澤步長(zhǎng)制藥有限公司提供，舒血寧注射液由黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司提供。無(wú)支原體胎牛血清FBS購(gòu)自杭州四季青公司，青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)自安特捷生物技術(shù)有限公司。PI檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司，Na2S2O3購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物中心(CTCC)，用含10%FBS和1%雙抗(青霉素-鏈霉素溶液)的DMEM高糖培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞增殖檢測(cè)采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，接種至96孔板2×104個(gè)/孔，待細(xì)胞貼壁后，更換含有不同濃度藥物的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、48或72 h后，每孔加入20 μl 5 g/L MTT溶液，孵育4 h后棄上清，每孔加入100 μl 二甲基亞砜(DMSO)，37 ℃暗培養(yǎng)15 min后，于490 nm測(cè)定光吸收值，以完全培養(yǎng)基為空白對(duì)照。細(xì)胞增殖率=(處理組吸光值/對(duì)照組吸光值)×100%。

1.4糖氧剝奪損傷處理應(yīng)用氧糖剝奪誘導(dǎo)卒中樣能量障礙是模擬體內(nèi)缺血性損傷最普遍的方法[6]。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種細(xì)胞至96孔板2×104/孔，待細(xì)胞貼壁，藥物孵育24 h后，用2 mmol/L Na2S2O3的無(wú)糖Earle’s液處理，模擬神經(jīng)細(xì)胞缺血時(shí)的缺氧缺糖狀態(tài)，孵育1 h后，更換DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行MTT檢測(cè)。

1.5細(xì)胞周期分析采用PI染色法和流式細(xì)胞術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化計(jì)數(shù)，接種至96孔板2×105個(gè)/孔，細(xì)胞貼壁后，更換含有各種藥物的新鮮培養(yǎng)基，處理48 h后，收集細(xì)胞并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，去上清，每個(gè)樣品加入500 μl緩沖液重懸細(xì)胞，加入100 μl PI，混勻后室溫避光孵育30 min。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。

2 結(jié)果

2.1三種藥物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果表明，三種藥物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖均呈現(xiàn)濃度與時(shí)間相關(guān)性：0.6～2.0 g/L褐藻多糖硫酸酯促進(jìn)細(xì)胞增殖，以0.8 g/L作用最為顯著，作用48 h和72 h細(xì)胞增殖率提高分別為63.6%和150%；高濃度褐藻多糖硫酸酯(>2.0 g/L)作用24 h即呈現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制，作用48 h時(shí)顯著抑制細(xì)胞增殖，4 g/L抑制率達(dá)到40%。0.5～20%舒血寧注射液作用24 h無(wú)顯著影響，作用48 h促進(jìn)細(xì)胞增殖，以10%作用最為顯著，作用48 h和72 h細(xì)胞增殖率提高分別為54.4%和57.5%。0.5%～10%丹紅注射液作用24 h無(wú)顯著影響，作用48 h促進(jìn)細(xì)胞增殖，其中6%促增殖效果最為顯著，作用48 h和72 h細(xì)胞增殖率提高分別為89.5%和98.0%。見(jiàn)圖1。

圖1 三種藥物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響 a:褐藻多糖硫酸酯；b:舒血寧注射液；c:丹紅注射液

2.2三種藥物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞缺糖缺氧損傷的影響褐藻多糖硫酸酯和舒血寧注射液均有效降低缺氧缺糖對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷，與對(duì)照組比較，0.8 g/L 褐藻多糖硫酸酯使細(xì)胞增殖率提高13.5%，10%舒血寧注射液使細(xì)胞增殖率提高20.1%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.001)。丹紅注射液對(duì)細(xì)胞缺氧缺糖損傷沒(méi)有明顯影響。見(jiàn)圖2。

圖2 三種藥物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞缺糖缺氧的影響

2.3三種藥物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞周期的影響細(xì)胞周期分析結(jié)果表明，0.8 g/L 褐藻多糖硫酸酯和6%丹紅注射液均明顯提高S期細(xì)胞比例，表明褐藻多糖硫酸酯和丹紅注射液促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞DNA合成，提高細(xì)胞分裂增殖效率。舒血寧注射液對(duì)細(xì)胞周期無(wú)明顯影響。

表1 三種藥物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞周期的影響 (%)

3 討論

腦梗死的高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率對(duì)患者、家庭、社會(huì)都造成極大的負(fù)擔(dān)，目前對(duì)于腦梗死的診治方方面面都大力開(kāi)展研究，其中，藥物的神經(jīng)保護(hù)也是一個(gè)很重要的方面。

褐藻多糖硫酸酯是從褐藻中提取的一類硫酸化多糖，研究發(fā)現(xiàn)其具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抗凝血、抗炎癥、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[3]，大鼠腦缺血再灌注損傷后使用褐藻多糖鹽酸酯顯示其通過(guò)提高轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)的表達(dá)縮小腦梗死體積，對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠起到神經(jīng)保護(hù)作用[4]，目前均在實(shí)驗(yàn)階段，尚未應(yīng)用于臨床。舒血寧注射液為銀杏葉提取物，主要成分為總黃酮醇苷和銀杏內(nèi)酯，具有抗脂質(zhì)和抗氧化自由基過(guò)氧化作用，擴(kuò)張血管，改善循環(huán)，應(yīng)用于心腦血管缺血性疾病[5，6]。丹紅注射液主要由丹參和紅花兩種中藥材經(jīng)提取而成，其中主要的有效成分為丹參水溶性成分丹參酸、丹參酚酸及紅花水溶性成分紅花黃色素、紅花酚苷和兒茶酚胺等，中醫(yī)認(rèn)為具有活血化瘀、通脈舒絡(luò)等功效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為具有很好的抗炎、降血脂、抗凝抑栓、抗凋亡、神經(jīng)保護(hù)等作用[7，8]，臨床廣泛用于治療高血壓、冠心病、腦血栓、心絞痛等心腦血管疾病[9]，在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)生物學(xué)研究中也顯示丹紅注射液參與抗炎、細(xì)胞分化與凋亡、心血管疾病、抗腫瘤等作用[10]，與臨床治療范疇相吻合。

SH-SY5Y細(xì)胞株作為擬神經(jīng)細(xì)胞模型，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制和防止措施的研究[11]。本研究以SH-SY5Y細(xì)胞株為材料，通過(guò)神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖檢測(cè)、細(xì)胞周期分析和缺氧缺糖損傷處理，分別將褐藻多糖硫酸酯、舒血寧注射液和丹紅注射液作用于神經(jīng)細(xì)胞，比較三種藥物對(duì)人神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響以及對(duì)細(xì)胞缺氧缺糖損傷的保護(hù)效果，以利于缺血性腦血管疾病的臨床藥物的開(kāi)發(fā)、正確選擇和有效使用。

本研究結(jié)果表明，三種藥物在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性地促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞增殖，作用48 h以6%丹紅注射液效果最為顯著，細(xì)胞增殖率比對(duì)照提高89.5%；作用72 h以8 g/L褐藻多糖硫酸酯增殖效果最佳，細(xì)胞增殖率比對(duì)照提高150%。褐藻多糖硫酸酯和舒血寧注射液均有效降低缺氧缺糖對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷，舒血寧注射液效果尤佳。細(xì)胞周期分析結(jié)果表明，褐藻多糖硫酸酯和丹紅注射液均通過(guò)提高S期細(xì)胞比例，加速細(xì)胞由S期通過(guò)G2期進(jìn)入M期，提高細(xì)胞分裂效率以實(shí)現(xiàn)其促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖作用。

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三種藥物具有一定的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在臨床用藥中急性期48 h內(nèi)使用丹紅注射液，并且濃度控制在6%是否發(fā)揮臨床療效最佳。舒血寧對(duì)低氧低糖狀態(tài)下療效優(yōu)于丹紅，是否說(shuō)明急性期之后舒血寧的療效優(yōu)于丹紅注射液。作用72 h則以8 g/L褐藻多糖硫酸酯增殖效果最佳，并且對(duì)缺血低糖情況下能有效的保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的損害，可以加速細(xì)胞由S期通過(guò)G2期進(jìn)入M期，提高細(xì)胞分裂效率以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖，但更高濃度的褐藻多糖硫酸酯則抑制細(xì)胞的增殖，從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可以展望褐藻多糖硫酸酯有著極好的前景。但作用的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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ComparisonofproliferativeeffectsofFucoidan，ShuxueninginjectionandDanhonginjectiononneuralcells

ZHANGShu-qing1，OUYANGCun1，XUANBo2，ZHENGQian2，YANGGuang-xiao2，HEGuang-yuan2，CHENMing-jie2

(1.DepartmentofNeurology，AffiliatedHospitalofJianghanUniversity，Wuhan430000，China；2.CollegeofLifeScienceandTechnology，HuazhongUniversityofScience&Technology，Wuhan430000，China)

CHENMing-jie

ObjectiveTo investigate the effect of Fucoidan，Shuxuening injection and Danhong injection on proliferation and protection of oxygen-glucose deprivation (OGD) of human SH-SY5Y neuroblastoma cells.MethodsSH-SY5Y cells were treated with different concentrations of Fucoidan，Shuxuening injection and Danhong injection for different time.Cell viability was determined by using MTT assay.SH-SY5Y cells were preconditioned for OGD.After treatment with the three types of drugs with different concentrations，cell viability was detected in order to analyze the effect of the drugs on cell proliferation and injure induced by OGD.Flow cytometry was used to analyze the cell cycle changes.ResultsThe three types of drugs at certain concentration increased the cell proliferation.0.8 g/L of Fucoidan treatment for 48 h，a 63.6% increase in the cell growth was observed.For protection of cell injury caused by OGD，the proliferation rate was increased by 13.5% and percentage of S phase was markedly increased from 10.89% to 18.18% after treatment for 24 h when compared to the controls.10% Shuxuening injection treatment for 48 h，a 55.5% increase in cell growth was found.For protection of cell injury caused by OGD，the proliferation rate was increased by 20.1% but no obvious effect on the cell cycle distribution was observed when compared to the controls.5% Danhong injection treatment for 48 h，a 89.4% increase in the cell growth and a significantly increase in the cell percentage of S phase from 15.05% to 22.0% after 72-hour treatment were observed，but no obvious effect on OGD injury was found.ConclusionFucoidan，Shuxuening injection and Danhong injection at certain concentration significantly increase the proliferation of SH-SY5Y cells.Fucoidan and Shuxuening injection could reduce the cell injury caused by OGD.The three types of drugs all have a protective effect on neural cells.

Fucoidan；Shuxuening injection；Danhong injection；SH-SY5Y cells；Cell proliferation；Cell cycle；OGD；Protective effect on neural cells

武漢市科技攻關(guān)計(jì)劃資助項(xiàng)目(編號(hào)：201260523185)，武漢市衛(wèi)計(jì)委基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：WG16D02)

陳明潔

R741.05

A

1672-6170(2017)05-0037-04

2017-02-26；

2017-05-24)