何利珍，鐘雪云

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510095；2.暨南大學(xué)，廣東 廣州 510630)

PTEN基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO38及其亞系中表達(dá)的異質(zhì)性研究

何利珍1，鐘雪云2

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510095；2.暨南大學(xué)，廣東 廣州 510630)

目的比較人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO38及其克隆亞系SWOZ1和SWOZ2細(xì)胞株的PTEN(與張力蛋白同源在10號(hào)染色體有缺失的磷酸酶基因)基因表達(dá)的差異，探討膠質(zhì)瘤異質(zhì)性的分子機(jī)制。方法應(yīng)用RT-PCR技術(shù)、PCR-SSCP法及測序分析方法從定量和定性兩方面比較PTEN基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO38及克隆亞系中表達(dá)的差異。結(jié)果PTEN基因在SWO38表達(dá)量最多，SWOZ2次之，SWOZ1表達(dá)量最少；三株細(xì)胞的PTEN基因未發(fā)現(xiàn)有基因突變，其序列長度、堿基組成及排列順序完全相同，經(jīng)BLAST比對后發(fā)現(xiàn)與數(shù)據(jù)庫中4條序列完全匹配，4條序列均為野生型PTEN的mRNA序列。結(jié)論人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO38及 SWOZ1、SWOZ2中，PTEN基因在mRNA水平表達(dá)量明顯不同，這些差異表達(dá)可能是決定兩亞株細(xì)胞表現(xiàn)不同生物學(xué)行為的機(jī)制之一；三株細(xì)胞的PTEN基因均表現(xiàn)為野生型PTEN基因編碼序列，提示可能是相同遺傳背景的表現(xiàn)之一；SWOZ1和SWOZ2兩株細(xì)胞可為進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤異質(zhì)性分子機(jī)制提供良好的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

PTEN；膠質(zhì)瘤；異質(zhì)性；基因表達(dá)；BLAST

腫瘤的異質(zhì)性是腫瘤細(xì)胞在宿主的選擇壓力下所展示的基因可變性或不穩(wěn)定性，它幾乎存在于腫瘤發(fā)育的所有水平，包括瘤間與瘤內(nèi)異質(zhì)性，瘤間異質(zhì)性稱為腫瘤之間的異質(zhì)性，指同類腫瘤不同發(fā)病階段、不同患者或相同患者不同腫瘤部位之間的基因型存在的差異[1]；而腫瘤內(nèi)部不同區(qū)域，隨著疾病的進(jìn)展出現(xiàn)形態(tài)、功能差異的瘤細(xì)胞亞群，則稱為腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性[2，3]。膠質(zhì)瘤是人類常見的顱內(nèi)腫瘤，世界衛(wèi)生組織(WHO)將其分為4級(jí)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastomamultiforme，GBM)是其中最常見的、惡性度最高、侵襲性最強(qiáng)的成人腦腫瘤[4]。最近大規(guī)模基因組分析研究明確GBM是一組異質(zhì)性腫瘤，具有各自獨(dú)特的分子和遺傳特征，美國癌癥基因組圖譜(TCGA)計(jì)劃研究小組根據(jù)GBM基因表達(dá)水平將其分為四類分子亞型：前神經(jīng)元型，神經(jīng)元型，經(jīng)典型和間葉型[5]。目前的研究已發(fā)現(xiàn)，PTEN基因異常可存在于多種腫瘤，被認(rèn)為是繼p53和Rb基因后，又一種改變較廣泛、與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切的抑癌基因。本研究擬在基因水平從定量和定性兩方面比較PTEN基因在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO38及其克隆亞系中表達(dá)的差異，探討膠質(zhì)瘤異質(zhì)性的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SWO38[6]及其克隆亞系SWOZ1和SWOZ2[7]由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室提供，外周血單個(gè)核細(xì)胞自備。TRIzol試劑購自Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司；其余試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SWO38及兩克隆亞系SWOZ1、SWOZ2用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置37 ℃含5%CO2濕化培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2提取細(xì)胞 總RNA 取相同條件下對數(shù)生長期的SWO38、SWOZ1、SWOZ2細(xì)胞，同時(shí)用密度梯度離心法分離正常人外周血的單個(gè)核細(xì)胞。將獲得的四種細(xì)胞用PBS洗滌二次，加入TRIzol試劑(1 ml TRIzol/cm102細(xì)胞)裂解后，加入氯仿(每毫升TRIzol加0.2 ml氯仿)進(jìn)行相分離，轉(zhuǎn)移上層RNA水相于新EP管內(nèi)，經(jīng)異丙醇沉淀離心后，收集提取的細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計(jì)測定RNA的純度和濃度，保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR引物設(shè)計(jì)與合成 PTEN引物序列查自NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)的Nucleotide數(shù)據(jù)庫，并采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增PTEN基因編碼序列的引物：上游-5'ATGACAGCCATCATCAAA3'，下游-5'TCAGACTTTTGTAATTTGTG3'，分片段擴(kuò)增PTEN基因編碼序列的引物：A片段：上游-5'ATGACAGCCATCATCAAAG3'，下游-5'GCCTCTTGTGCCTTTAAA3'，B片段： 上游-5'ATGTGCATATTTATTACATCG3'，下游-5'TTCCTCTGGTCCTGGTAT3'，C片段：上游-5'CAAAGTAGAGTTCTTCCACA3'，下游-5'TCAGACTTTTGTAATTTGTGT3'，所有引物序列均由廣州賽百盛公司合成。

1.2.4RT-PCR反應(yīng) 從各細(xì)胞中提取的總RNA分別以1 μg等模板量進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，50 μl反應(yīng)體系含總RNA 1 μl(RNA濃度1 μg/ μl)，20 μmol/L上游與下游引物各1 μl，余反應(yīng)物同試劑盒要求，應(yīng)用β-actin基因保守序列為內(nèi)標(biāo)性對照。先行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄條件：一個(gè)循環(huán)，50 ℃延伸25 min，99 ℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶5 min；然后行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：①擴(kuò)增PTEN基因編碼序列全長及β-actin：先94 ℃變性2 min，然后進(jìn)行35循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃1 min、60 ℃1 min、72 ℃ 20 min，最后72 ℃延伸5 min。②分片段擴(kuò)增PTEN基因編碼序列：先94 ℃變性2 min，然后進(jìn)行35循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃30秒、51 ℃(A、C片段)或50 ℃(B片段) 30秒、72 ℃1 min，最后72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液5 μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖象分析系統(tǒng)測定PTEN基因電泳條帶的光密度、積分值。

1.2.5SSCP檢測 將RT-PCR擴(kuò)增后的DNA樣品(PTEN基因的A、B、C片段)各取4 μl與4 μl變性Loading Buffer混合，95 ℃變性5 min，然后立即置于冰浴中5 min，將8 μl上樣于6%非變性聚丙烯酰胺凝膠，1×TBE為緩沖液，先以300 V電泳5 min，待樣品進(jìn)入凝膠后，在電壓230 V下電泳6 h。銀染后觀察SSCP電泳條帶，如果凝膠中膠質(zhì)瘤細(xì)胞出現(xiàn)與正常人外周血細(xì)胞不同的異常移動(dòng)電泳帶則說明存在突變，即SSCP陽性。

1.2.6測序及序列分析 分別使用A片段下游引物、B片段下游引物和C片段上游引物，由北京博亞公司測序，并將測序后結(jié)果進(jìn)行拼接，形成完整的PTEN基因序列，將拼接完整的PTEN基因序列提交BLAST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢比對并分析。

2 結(jié)果

2.1RT-PCR檢測結(jié)果

2.1.1電泳結(jié)果 PTEN基因在正常人外周血細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO38、 SWOZ1及SWOZ2中均有表達(dá)，SWO38中表達(dá)量最多，SWOZ2次之，SWOZ1表達(dá)量最少，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次結(jié)果均相同。β-actin為內(nèi)參照(圖1)(注：從各細(xì)胞中提取的總RNA分別以1 μg等模板量進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，終產(chǎn)物各取5 μl電泳)。

圖1 外周血細(xì)胞和SWO38、 SWOZ1、SWOZ2細(xì)胞中PTEN基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.1.2掃描結(jié)果 在凝膠中可清楚看到SWO38在PTEN基因處的峰值明顯高于SWOZ1和SWOZ2，SWOZ1的峰值最小，見圖2。三株細(xì)胞中，母系SWO38的PTEN基因電泳條帶吸光度值和積分值均明顯大于兩亞系的值，并且，兩亞系SWOZ1和SWOZ2的PTEN基因電泳條帶吸光度值和積分值之和接近于母系SWO38的PTEN基因電泳條帶吸光度值和積分值，見表1。

圖2 SWO38和SWOZ1、SWOZ2細(xì)胞中PTEN基因處電泳條帶縱向掃描分析比較圖

組別峰值積分值SWOZ11363SWOZ221108SWO3831174

2.2SSCP檢測結(jié)果在膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO38及 SWOZ1、SWOZ2中擴(kuò)增得到PTEN基因的A、B、C片段，PAGE電泳后經(jīng)過染色，在凝膠上可以見到清楚的2條帶，此2條帶是DNA解鏈分開后的2條單鏈形成的。與正常對照相比，兩條單鏈形成的條帶相對位置沒有變化，說明三株細(xì)胞均無突變發(fā)生，見圖3。

圖3 SSCP電泳結(jié)果 a：A片段；b：B片段；c：C片段 (N：正常人外周血細(xì)胞，1：SWOZ1，2：SWOZ2，3：SWO38)

2.3測序結(jié)果及序列分析膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO38及 SWOZ1、SWOZ2中擴(kuò)增的PTEN基因編碼序列全長均為1212 bp(含終止密碼)，三者的堿基組成及排列順序亦完全相同，此序列經(jīng)BLAST比對后發(fā)現(xiàn)與數(shù)據(jù)庫中4條序列完全匹配，同一性達(dá)100%，其相似性分?jǐn)?shù)值(S)最大：Score = 2403 bits (1212)，期望值(E)最?。篍xpect = 0.0。這4條序列雖然名稱不同，長度不一，實(shí)際均為野生型PTEN的mRNA序列，含有完整的1212 bp的編碼區(qū)序列。

3 討論

PTEN 位于染色體10q23.3，基因全長210 kb，由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成，mRNA長度為5.5 kb，PTEN蛋白是一條由1209個(gè)核苷酸編碼403個(gè)氨基酸組成的多肽鏈[8]。PTEN作為第一個(gè)屬于磷酸酶家族的抑癌基因，通過激活PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮調(diào)控作用，編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)表現(xiàn)出特異的脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重活性，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和分化、凋亡、細(xì)胞骨架建立和細(xì)胞周期阻滯、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種效應(yīng)[9]。

有關(guān)膠質(zhì)瘤的分子標(biāo)志物有很多種，PTEN僅是其中之一。劉金戈等[10]對人膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn)PTEN的表達(dá)水平在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中差異顯著(P< 0.05)，與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)。侯桂琴等[11]通過RT-PCR和基因測序技術(shù)檢測食管鱗癌細(xì)胞株中PTEN mRNA 的表達(dá)水平及PTEN突變情況，發(fā)現(xiàn)高分化食管癌細(xì)胞株Eca109中PTEN mRNA的表達(dá)水平高于低分化食管癌細(xì)胞株EC9706和Eca109的PTEN mRNA表達(dá)，3株細(xì)胞中均有不同程度的PTEN基因突變，其中5和8外顯子突變明顯。早前研究發(fā)現(xiàn)，大約50%的GMB中同時(shí)存在表皮生長因子受體EGFR基因的擴(kuò)增和突變，擴(kuò)增表現(xiàn)為正常的EGFR表達(dá)水平上升，而突變則產(chǎn)生不依賴于配體的變異型EGFR，又稱EGFRvIII，具有獨(dú)立促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的能力，既能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，又具有對細(xì)胞的損失進(jìn)行修復(fù)的功能[12]。還有人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)，大約70%～80%原發(fā)型GBM和70%的少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤具有hTERT啟動(dòng)子的突變，hTERT啟動(dòng)子的突變是膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的早期事件[13]，增強(qiáng)了端粒酶的表達(dá)水平和端粒酶的活性，TRET的表達(dá)水平與患者的生存期成負(fù)相關(guān)，與膠質(zhì)瘤的惡性程度成正相關(guān)[14]。

本研究利用RT-PCR法檢測了人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO38及其亞系SWOZ1和SWOZ2中的PTEN 基因表達(dá)情況，研究結(jié)果顯示此三株細(xì)胞PTEN基因表達(dá)量各不相同；用SSCP方法檢測沒有發(fā)現(xiàn)基因突變，考慮有可能是DNA鏈中突變部位未能對單鏈立體構(gòu)象造成影響，形成假陰性結(jié)果；進(jìn)一步測序分析發(fā)現(xiàn)三株細(xì)胞的PTEN基因堿基組成及排列順序完全相同，BLAST比對分析顯示為野生型PTEN編碼序列。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO38及 SWOZ1、SWOZ2中，PTEN的mRNA表達(dá)定性檢測未發(fā)現(xiàn)有突變，定量檢測發(fā)現(xiàn)，SWO38表達(dá)量最多，SWOZ2次之，SWOZ1表達(dá)量最少。其中，SWOZ1和SWOZ2兩株細(xì)胞亞系是2000年從SWO38膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中分離培養(yǎng)出來，兩者惡性程度差別明顯，高低分化顯著不同，具有典型腫瘤異質(zhì)性的特點(diǎn)[15]。本實(shí)驗(yàn)室前期工作中于莉娜等[16]論證了SWOZ1和SWOZ2兩株細(xì)胞亞系存在蛋白質(zhì)水平的異質(zhì)性。本研究以PTEN為靶點(diǎn)比較人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO38及其克隆亞系SWOZ1和SWOZ2在核酸分子水平表達(dá)的差異，結(jié)合測序結(jié)果分析，SWOZ1和SWOZ2兩株細(xì)胞之間既有同源性，又同時(shí)存在有異質(zhì)性。

總之，PTEN基因功能狀態(tài)和基因變異方式與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)行為密切相關(guān)，深入研究此三株細(xì)胞的背景情況，為其將來在腫瘤增殖、分化、轉(zhuǎn)移機(jī)理等方面作為研究模型奠定良好的理論基礎(chǔ)，尤其是SWOZ1和SWOZ2兩株細(xì)胞，既有同源性，又同時(shí)存在有異質(zhì)性，可為進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤異質(zhì)性分子機(jī)制提供良好的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

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TheheterogeneityofPTENgeneexpressioninhumangliomacelllineSWO38anditstwosublines

HELi-zhen1，ZHONGXue-yun2

(1.AffiliatedCancerHospital，GuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510095，China；2.JinanUniversity，Guangzhou510630，China)

ObjectiveTo compare the differences in expression of PTEN gene，that is homologous to tension protein phosphatase gene and missing on the 10thchromosome，in human glioma cell line SWO38 and its two sublines SWOZ1 and SWOZ2 in order to explore the molecular mechanism of tumor heterogeneity of human glioma.MethodsThe differences in quantitative and qualitative PTEN expression in the cell lines were examined by using RT-PCR technique，PCR-SSCP technique and sequence method.ResultsThe levels of PTEN gene expression in the line SWO38 were highest followed by SWOZ2 and SWOZ1 was the lowest.There was no mutation in PTEN gene in the three cell lines.The sequences of PTEN gene in the three cell lines were the same in length，nucleotide constitution and alignment that completely matched with four sequences existed in the international nucleotide database by BLAST，that were mRNA sequence of wild-type PTEN.ConclusionThere is a definite difference in expression of PTEN mRNA in the three cell lines.It suggests that these different gene expressions relate to the different biological characters of those two sublines.The PTEN gene in the three cell lines held the wild-type PTEN and held one of the aspects of identical hereditary background.The SWOZ1 and SWOZ2 are patent as an ideal model in study of the molecular mechanism of the heterogeneity in glioma.

PTEN；Glioma；Heterogeneity；Gene expression；BLAST

R739.4

A

1672-6170(2017)05-0027-04

2017-03-12；

2017-05-23)