魯遙 張嵐?fàn)?駱豐 陳琳 章浙忠?

冬凌草甲素對(duì)乳腺癌Bcap-37細(xì)胞凋亡影響的研究

魯遙 張嵐?fàn)?駱豐 陳琳 章浙忠?

目的 通過體外無菌培養(yǎng)乳腺癌Bcap-37細(xì)胞，觀察冬凌草甲素對(duì)Bcap-37細(xì)胞的活性以及凋亡的影響，探索冬凌草甲素的抗腫瘤機(jī)制。方法 無菌培養(yǎng)Bcap-37細(xì)胞，冬凌草甲素濃度為0、1、2、4、8、16、32、64μg/ml，作用12、24、36、48h時(shí)，采用MMT法檢測(cè)冬凌草甲素抑制Bcap-37細(xì)胞活性；冬凌草甲素濃度為8μg/ml、32μg/ml，作用24h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)Bcap-37細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 冬凌草甲素對(duì)乳腺癌Bcap-37細(xì)胞有增殖抑制以及誘導(dǎo)凋亡的作用。結(jié)論 冬凌草甲素可抑制乳腺癌Bcap-37細(xì)胞的增殖以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為臨床治療乳腺癌提供了新的依據(jù)。

冬凌草甲素 Bcap-37細(xì)胞 細(xì)胞凋亡

據(jù)2011年全球癌癥統(tǒng)計(jì)，全球新增乳腺癌患者1380000例，占同期新增癌癥患者例數(shù)的23%，死亡率則占同期癌癥死亡率的14%［1］，目前仍無公認(rèn)的最佳治療藥物。隨著新型抗腫瘤藥物的不斷更新，乳腺癌治療后生存率也有所提高，但始終未達(dá)到理想的臨床效果。雖然手術(shù)治療是乳腺癌的首選治療方案，但是晚期乳腺癌以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌仍然威脅患者的生命，如何有效控制乳腺癌的發(fā)展以及促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡是本研究的主要目的。冬凌草甲素是從冬凌草中提取天然類化合物，味甘苦，性微寒，具清熱解毒﹑消炎止痛﹑健胃活血及抗腫瘤之功用，素有“人間仙草”之美稱［2］。本研究將不同濃度冬凌草甲素作用于Bcap-37細(xì)胞，觀察冬凌草甲素對(duì)Bcap-37細(xì)胞的活性以及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 乳腺癌Bcap-37購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所。

1.2 主要試劑 冬凌草甲素（HPLC≥98%）（TAUTO BIOTECH）；PBS緩沖液（PH7.2±0.1）（吉諾生物）；無支原體胎牛血清（FB）（天杭生物）；RPMI 1640培養(yǎng)液（吉諾生物）；噻唑藍(lán)（MTT）﹑二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó)Sigma公司）；0.25%胰蛋白酶（吉諾生物）；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（聯(lián)科生物）；DMEM培養(yǎng)液（吉諾生物）。

1.3 儀器 酶標(biāo)儀（美國(guó)Dynatech公司，型號(hào)MR-4100）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)HEPA CLASS 1003111）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號(hào)CKX31）；熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號(hào)IX71）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)guava 公司，型號(hào)guava easyCyte 6-2L）。

1.4 方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：將Bcap-37細(xì)胞置于DMEM高糖培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代時(shí)，按1：1加入0.25%胰酶和DMEM高糖培養(yǎng)液，待胰酶消化后，離心后收集細(xì)胞懸液至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞傳代3次后可用于實(shí)驗(yàn)。（2）MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力：采用MTT法檢測(cè)，將1.0×104個(gè)/孔的密度細(xì)胞傳代培養(yǎng)于4個(gè)96孔板中。冬凌草甲素濃度設(shè)置為0﹑1﹑2﹑4﹑8﹑16﹑32﹑64μg/ml，培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)置為12﹑24﹑36﹑48h，每組5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)。定時(shí)加入20μl 5 mg/ml MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液，加入150μl DMSO，在570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度值（A570）。細(xì)胞活力計(jì)算公式：細(xì)胞活力（%）=（加藥組A570 -空白組A570）/（對(duì)照組A570 - 空白組A570）×100%。獨(dú)立重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置為：對(duì)照組﹑8μg/ml組和32μg/ml組。將1.0×104個(gè)/孔的密度細(xì)胞傳代培養(yǎng)于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照設(shè)定濃度加入冬凌草甲素培養(yǎng)液，重復(fù)3次，培養(yǎng)24h后低速離心收集細(xì)胞，加入PBS重懸液后洗滌傾去上清液，加入1×binding buffer 500μl重懸細(xì)胞呈單細(xì)胞懸液，然后加入5μl Annexin V和10μl的PI，避光室溫孵育5min后，上機(jī)檢測(cè)；測(cè)定細(xì)胞數(shù)為10000 個(gè)；使用guava 微流式細(xì)胞分析儀Nexin程序。獨(dú)立重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對(duì)Bcap-37細(xì)胞增殖活力的影響 冬凌草甲素濃度能有效地抑制Bcap-37細(xì)胞增殖，呈劑量-時(shí)間依賴性。冬凌草甲素抑制Bcap-37細(xì)胞增殖的最佳抑制濃度為32 μg/ml，最低抑制濃度為8 μg/ ml，最佳作用時(shí)間為24h。32 μg/ml的冬凌草甲素作用于細(xì)胞24h后，Bcap-37細(xì)胞活力為（19.89±2.19）%，明顯低于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1 冬凌草甲素對(duì)Bcap-37細(xì)胞增殖活力的影響

2.2 冬凌草甲素對(duì)Bcap-37細(xì)胞凋亡的影響 8 μg/ ml的冬凌草甲素作用于Bcap-37細(xì)胞24 h后，凋亡比例為5.45±0.21%；32 μg/ml冬凌草甲素作用于Bcap-37細(xì)胞24 h后，凋亡比例為14.85±0.92%，與空白組（1.9±0.17%）相比，早期凋亡細(xì)胞的比例顯著提升，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果提示冬凌草甲素能引起B(yǎng)cap-37細(xì)胞的凋亡，且呈一定的劑量依賴性。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)Bcap-37細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

乳腺癌是全球女性中最常見的一種腫瘤，并且逐漸成為了一種全球性的問題，盡管乳腺癌的預(yù)后有大幅改善，但是在中低收入國(guó)家，乳腺癌的病死率仍較高。乳腺癌的病因尚未完全清楚，從前期研究發(fā)現(xiàn)其可能與內(nèi)源性或外源性雌激素的長(zhǎng)期作用﹑乳腺導(dǎo)管和小葉的不典型增生﹑營(yíng)養(yǎng)狀況﹑遺傳家族史等均有關(guān)聯(lián)，目前常用的治療方法有藥物治療﹑手術(shù)治療﹑放射治療［3-5］，但是新觀點(diǎn)和新研究使人們深入地認(rèn)識(shí)到乳腺癌僅依靠單一的治療方法是不能達(dá)到根治的目的，必須采取綜合治療手段，有效殺死或抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，減少體內(nèi)癌負(fù)荷，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高自身抗癌能力。

冬凌草甲素是從冬凌草中提取的天然類化合物，可作為新型防癌劑，具有抗腫瘤作用［2］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，但作用機(jī)制尚不明確。通過以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素能顯著抑制Bcap-37細(xì)胞的增殖，且最佳抑制濃度為32 μg/ml，32 μg/ml的冬凌草甲素作用于Bcap-37細(xì)胞24h后，細(xì)胞活力為（19.89±2.19）%，明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，8μg/ml的冬凌草甲素作用于Bcap-37細(xì)胞24 h后，凋亡比例為（5.45±0.21）%；32 μg/ml冬凌草甲素作用于Bcap-37細(xì)胞24 h后，凋亡比例為（14.85±0.92）%，與空白組（1.9±0.17%）相比，早期凋亡細(xì)胞的比例顯著提升，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果提示冬凌草甲素能引起B(yǎng)cap-37細(xì)胞的凋亡。

大量的研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素可以從多條通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［6］，生物個(gè)體是一個(gè)整體，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路交織成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，相互調(diào)節(jié)是常見機(jī)制，具體的凋亡程序還需要進(jìn)一步研究。如何更準(zhǔn)確地抑制該信號(hào)通路，如何篩選更為合適的靶向藥物以及存在的安全問題都是應(yīng)當(dāng)考慮的，有待更深入的研究。

［1］ Jemal A,Bray F,Center MM,et al．Global cancer statistics．CA:a cancer journal for clinicians,2011,61(2):69-90．

［2］ 劉淑云,譚英姿,范明松,等．冬凌草甲素研究進(jìn)展．中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥,2012,19(13):17-18．

［3］ 劉建國(guó)．乳腺癌的致病因素及治療原則．中國(guó)社區(qū)醫(yī)師,2012,14(5):48．

［4］ 潘凌霄,鄭文博,高進(jìn)．乳腺癌的綜合治療．求醫(yī)問藥(學(xué)術(shù)版),2012,10(2):270．

［5］ 賈臻,胡夕春．乳腺癌的藥物治療進(jìn)展．藥品評(píng)價(jià),2012,9(6):4-7．

［6］ 金星鏡,丁文評(píng),張蓮,等．冬凌草甲素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116生長(zhǎng)的影響及其機(jī)制研究．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014, 14(23):44-46

Objective To cultivate Bcap-37 cells of breast cancer through aseptic manipulation in vitro，observe the infl uence of oridonin on the activity and apoptosis of Bcap-37 cells，and explore anti tumor mechanism of oridonin. Methods Axenic cultivation of Bcap-37 cells，set the concentrations of oridonin by 0，1，2，4，8，16，32，64ug/ml respectively，after 12，24，36，48 hours，detect the inhibition of oridonin to Bcap-37 cells activity by MMT method；set the concentrations of oridonin by 8 ug/ml，32ug/ml，24 hours later，use fl ow cytometry to detect the effect of apoptosis on Bcap-37 Cells by oridonin. Results Oridonin has the effect on inhibiting the proliferation and inducing apoptosis of Bcap-37 cells. Conclusion Oridonin can inhibit the proliferation of Bcap-37 cells and induce the apoptosis of Bcap-37 cells，thus providing a new reference for the clinical treatment of breast cancer.

Oridonin Bcap-37 cells Apoptosis

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016ZB038）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)科研基金項(xiàng)目（2015ZY10）

310000 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院

*通信作者