房芳，柳春燕，陳靠山，2，袁平川，王浩

（1.皖南醫(yī)學(xué)院，蕪湖 241000；2.山東大學(xué)）

蘋果鏈格孢菌胞外多糖及分光光度法改用酶標(biāo)儀法的穩(wěn)定性

房芳1，柳春燕1，陳靠山1，2，袁平川1，王浩1

（1.皖南醫(yī)學(xué)院，蕪湖 241000；2.山東大學(xué)）

通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)多糖含量測(cè)定方法蒽酮法加以改進(jìn)，以全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀代替可見分光光度計(jì)進(jìn)行糖含量測(cè)定，對(duì)蘋果鏈格孢菌胞外多糖在不同溫度、光照、pH值和金屬離子條件下的此測(cè)定方法穩(wěn)定性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，分光光度法改用酶標(biāo)儀法后，其線性關(guān)系良好、穩(wěn)定性及精密度較好，具有可重復(fù)性，且操作簡(jiǎn)便，適用于大樣本測(cè)量分析。蘋果鏈格孢菌胞外多糖在20～80℃下的熱穩(wěn)定性較好，在pH=6的弱酸及Na+溶液中多糖穩(wěn)定性較好，強(qiáng)酸強(qiáng)堿及Cu2+、Fe3+溶液中穩(wěn)定性較差，光照可對(duì)多糖穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。

胞外多糖；蒽酮法；穩(wěn)定性；分光光度法；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀

多糖是除蛋白質(zhì)、核酸、脂肪外的另一類重要的生物大分子物質(zhì)，具有抗腫瘤[1]、抗氧化[2]、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)活性[3，4]。多糖含量的測(cè)定方法有多種：利用多糖的還原性進(jìn)行測(cè)定，如3，5-二硝基水楊酸鹽（DNS）比色法[5]等；利用糠醛縮合顯色法進(jìn)行測(cè)定，如地衣酚-硫酸（鹽酸）法[6]、苯酚-硫酸法[7，8]和蒽酮-硫酸法[9]等，其中苯酚法和蒽酮法又是最為常用的兩種多糖含量測(cè)定方法，具有方便快捷、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好[10]等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)的蒽酮法，采用分光光度法測(cè)定糖含量，操作過(guò)程中需不斷清洗更換比色皿，操作繁瑣，耗樣量大，大樣本分析時(shí)程長(zhǎng)易導(dǎo)致誤差，而酶標(biāo)儀的使用使操作更加簡(jiǎn)便、用樣量少、可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣本、適用于大樣本的分析測(cè)定，蘇穎[11]、趙艷[12]等人利用酶標(biāo)儀測(cè)定蟲草多糖、食用菌多糖結(jié)果表明該法是一種快速準(zhǔn)確的方法。本文將選用蘋果鏈格孢菌胞外粗多糖（一種真菌胞外多糖，MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其具有一定抗腫瘤作用）為原料，以全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀代替可見分光光度計(jì)快速測(cè)定樣品中多糖的含量，并對(duì)多糖的穩(wěn)定性作進(jìn)一步研究，為蘋果鏈格孢菌胞外多糖的研究利用奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 材料

蘋果鏈格孢菌Alternaria maliRoberts菌株由實(shí)驗(yàn)室分離保藏，蘋果鏈格孢菌胞外粗多糖由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器和試劑

酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-TeK公司）；7200型可見分光光度計(jì)（美國(guó)Unico）；電子天平FA2004N（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；數(shù)顯控溫水浴鍋GKC4（上海波洛實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；艾科浦超純水系統(tǒng)AFZ-1001-U（頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司）；96孔單條可拆酶標(biāo)板（Costar）。

蒽酮、葡萄糖、NaCl、KCl、AlCl3、FeCl3、CaCl2、CuSO4、MgSO4、濃H2SO4、無(wú)水乙醇均為分析純（AR）試劑。

2 試驗(yàn)方法

2.1 蘋果鏈格孢菌胞外粗多糖制備

PDA培養(yǎng)基配制：稱取200 g馬鈴薯，去皮后切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，四層紗布過(guò)濾后加入20 g葡萄糖，充分溶解后121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

將蘋果鏈格孢菌（Alternaria maliRoberts）接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫?fù)u床發(fā)酵6 d。發(fā)酵液除去菌絲體后60℃減壓濃縮至原體積的1/4并加入三倍體積95%乙醇，4℃醇沉過(guò)夜。離心收集沉淀，超純水復(fù)溶得到胞外粗多糖溶液，以Sevage法脫蛋白并旋蒸除去有機(jī)溶劑，D301-R陰離子交換樹脂脫色，超純水洗脫，收集洗脫液，選用截留分子量為3 500的透析袋，超純水透析72 h后冷凍干燥即得到胞外粗多糖[13]。

2.2 分光光度法改用酶標(biāo)儀法測(cè)定粗多糖含量[14]

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品200 mg，加入超純水定容至1 000 mL，搖勻即得。

2.2.2 待測(cè)樣品溶液制備

精密稱取20 mg胞外粗多糖，加入超純水定容至100 mL，搖勻即得。

2.2.3 蒽酮試劑的配制

稱取蒽酮0.2 g，加入濃硫酸定容至100 mL，宜當(dāng)日配制使用。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

顯色反應(yīng)：準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、 0.6、0.8、1.0 mL（相當(dāng)于葡萄糖0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 mg）于10 mL加塞試管中，超純水補(bǔ)足至1 mL。各試管分別準(zhǔn)確加入0.2%蒽酮試劑4.0 mL，搖勻，于冰水浴中冷卻后移至沸水浴中反應(yīng)10 min，取出置冰水浴10 min。

分光光度法：以空白（0 mg葡萄糖）做參比，采用可見分光光度計(jì)在625 nm波長(zhǎng)下比色，測(cè)定各管溶液的光密度值（OD），以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶標(biāo)儀法：各反應(yīng)試管分別準(zhǔn)確吸取200 μL至96孔單條可拆酶標(biāo)板，使用酶標(biāo)儀于625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值并以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.5 樣品的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取待測(cè)樣品溶液1.0 mL于10 mL加塞試管中，按2.2.4方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，并于625 nm波長(zhǎng)處采用酶標(biāo)儀法及分光光度法分別測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

2.3 測(cè)定方法評(píng)價(jià)

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將0.2 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液依次稀釋為0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 mg·mL-1，6個(gè)梯度，各重復(fù)3次。準(zhǔn)確吸取樣品溶液與此6個(gè)梯度葡萄糖儲(chǔ)備液各1 mL按2.2.4方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，并于0～120 min內(nèi)每隔20 min進(jìn)行測(cè)定，625 nm下采用酶標(biāo)儀法測(cè)定吸光度，記錄并分析數(shù)據(jù)。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取樣品溶液、0.08 mg·mL-1葡萄糖溶液各5份，每份1 mL按2.2.4方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，625 nm下采用酶標(biāo)儀法測(cè)定吸光度，記錄并分析數(shù)據(jù)。

2.3.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

設(shè)置7個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組加0.5 mL樣品溶液，然后分別加入0、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 mg·mL-1葡萄糖溶液各0.5 mL按2.2.4方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，各重復(fù)3次，625 nm下采用酶標(biāo)儀法測(cè)定吸光度，記錄并分析數(shù)據(jù)。

2.4 酶標(biāo)儀法測(cè)定蘋果鏈格孢菌胞外多糖穩(wěn)定性影響因素

采用蒽酮硫酸法，以全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀代替可見分光光度計(jì)在625 nm波長(zhǎng)下測(cè)定蘋果鏈格孢菌胞外多糖在不同溫度、光照、pH值和金屬離子條件下的穩(wěn)定性[15]。

2.4.1 溫度條件

取蘋果鏈格孢菌胞外多糖溶液（經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾）各1.5 mL至離心管中，封口避光條件下分別于20、30、40、50、60、70、80℃恒溫水浴1 h，各重復(fù)3次，酶標(biāo)儀法測(cè)定吸光度。

2.4.2 光照條件

取蘋果鏈格孢菌胞外多糖溶液（經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾）各1.5 mL至離心管中，封口室溫條件下分別光照0、1、2、3、4、5、6 d，對(duì)照組避光放置，各重復(fù)3次，酶標(biāo)儀法測(cè)定吸光度。

2.4.3 pH條件

取蘋果鏈格孢菌胞外多糖溶液（經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾）各2 mL至離心管中，室溫下用0.1 mol·L-1HCl和0.1 mol·L-1NaOH分別調(diào)節(jié)pH至2、4、6、8、10、12，各重復(fù)3次，酶標(biāo)儀法測(cè)定吸光度。

2.4.4 金屬離子條件

取蘋果鏈格孢菌胞外多糖溶液（經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾）各1 mL至離心管中，分別加入離子濃度為0.05 mol·L-1的NaCl、KCl、AlCl3、FeCl3、CaCl2、CuSO4、MgSO4溶液4 mL，各重復(fù)3次，酶標(biāo)儀法測(cè)定吸光度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，以t檢驗(yàn)分析組間顯著性差異，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 兩種測(cè)定方法的葡萄糖濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程比較

采用酶標(biāo)儀法于625 nm測(cè)定溶液吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度-吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=3.816 4x+0.005 1，R2=0.999 7（n=6），葡萄糖溶液濃度在0～0.2 mg·mL-1范圍內(nèi)，酶標(biāo)儀法線性關(guān)系良好。

采分光光度法于625 nm測(cè)定溶液吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度-光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=6.467 1x+0.005，R2=0.999 9（n=6），葡萄糖溶液濃度在0～0.2 mg·mL-1范圍內(nèi)，分光光度法線性關(guān)系良好。

根據(jù)酶標(biāo)儀法計(jì)算得到多糖含量為0.0748mg·mL-1，根據(jù)分光光度法計(jì)算得到多糖含量為0.075 4 mg·mL-1，兩種方法測(cè)定同一樣品結(jié)果相近。

3.2 酶標(biāo)儀法測(cè)定方法的評(píng)價(jià)結(jié)果

3.2.1 酶標(biāo)儀法測(cè)定蘋果鏈格孢菌胞外多糖的穩(wěn)定性

根據(jù)測(cè)定的各溶液顯色反應(yīng)后的吸光值，計(jì)算各溶液中的葡萄糖含量，然后計(jì)算各組的SD值及RSD值，結(jié)果見表1。

表1 酶標(biāo)儀法測(cè)定蘋果鏈格孢菌胞外多糖的穩(wěn)定性Table 1Stability of the determination of Alternaria mali Roberts exopolysaccharides content by multiskan spectrum

各組的RSD值均小于3%，說(shuō)明0～120 min內(nèi)酶標(biāo)儀測(cè)定出各溶液的吸光度是穩(wěn)定的，測(cè)定值不因顯色反應(yīng)后放置時(shí)間的增加而發(fā)生明顯變化，該方法的穩(wěn)定性較高。

3.2.2 酶標(biāo)儀法測(cè)定蘋果鏈格孢菌胞外多糖的重復(fù)性

根據(jù)測(cè)定的吸光值，計(jì)算樣品溶液、葡萄糖儲(chǔ)備液中的葡萄糖含量，結(jié)果見表2。

表2 酶標(biāo)儀法測(cè)定蘋果鏈格孢菌胞外多糖的重復(fù)性Table 2Reproducibility of the determination of Alternaria mali Roberts exopolysaccharides content by multiskan spectrum

從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，5組重復(fù)下的試驗(yàn)結(jié)果很接近，且RSD值均小于3%，說(shuō)明該方法具有良好的重復(fù)性。

3.2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)測(cè)定的7組吸光值，計(jì)算各組的糖含量，進(jìn)一步計(jì)算各組的回收率，結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3The recovery of standard addition

7組加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)的平均值為102.6%，RSD為2.574%，說(shuō)明這種方法有較高的回收率，準(zhǔn)確度較高。通過(guò)以上穩(wěn)定性、重復(fù)性、加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，酶標(biāo)儀法具有較高的穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率，這種方法應(yīng)用于測(cè)定多糖含量，有較高的準(zhǔn)確性。

3.3 蘋果鏈格孢菌胞外多糖穩(wěn)定性影響因素

3.3.1 溫度對(duì)多糖穩(wěn)定性的影響

由圖1可知，不同溫度處理后多糖溶液吸光度值變化不明顯（與20℃組相比，P＞0.05），蘋果鏈格孢菌胞外多糖的熱穩(wěn)定性較好。

圖1 溫度對(duì)多糖穩(wěn)定性的影響(n=3,P＞0.05 vs 20℃組,*P＜0.05 vs 20℃組)Fig.1Effects of temperature on the polysaccharide stability(n=3,P>0.05 vs 20℃group,*P<0.05 vs 20℃group)

3.3.2 光照對(duì)多糖穩(wěn)定性的影響

由圖2可知，通過(guò)對(duì)比光照及避光條件下多糖水溶液吸光度的變化，光照條件可加速多糖的某些反應(yīng)過(guò)程（氧化或腐敗等），起到一定的催化作用。

3.3.3 pH對(duì)多糖穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，蘋果鏈格孢菌胞外多糖在pH＞8的堿性條件下吸光度增加（pH=10，12時(shí)，P＜0.01），或由于在堿性條件下糖分子通過(guò)烯醇化和異構(gòu)化作用使得單糖組成發(fā)生變化，進(jìn)而影響其吸光度，使吸光度上升，堿性進(jìn)一步增加則可破壞糖分子結(jié)構(gòu)使得吸光度下降。在pH＜4的酸性條件下吸光度也有增加（pH=2時(shí)，P＜0.05），但在常溫條件下酸對(duì)糖分子的穩(wěn)定性影響小于堿的影響。因此糖分子宜在弱酸條件下保存，而這與試驗(yàn)中測(cè)得的蘋果鏈格孢菌胞外多糖pH約為6.7相一致。

3.3.4 金屬離子對(duì)多糖穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，加入金屬離子溶液后，K+、Al3+、Ca2+、Mg2+使吸光度稍有降低（n=3，*P＜0.05 vs Na+組），Cu2+、Fe3+使吸光度明顯降低（n=3，**P＜0.01 vs Na+組），可能與多糖與Cu2+、Fe3+間的絡(luò)合作用有關(guān)，試驗(yàn)結(jié)果表明，大多數(shù)金屬離子對(duì)蘋果鏈格孢菌胞外多糖有一定影響。

圖2 光照對(duì)多糖穩(wěn)定性的影響（n=3，**P＜0.01 vs 0天組）Fig.2Effects of sunlight on the polysaccharide stability（n=3，**P＜0.01 vs 0 d group）

圖3 pH對(duì)多糖穩(wěn)定性影響（n=6，*P＜0.05 vs pH=6組，**P＜0.01 vs pH=6組）Fig.3Effects of pH on the polysaccharide stability（n=6，*P＜0.05 vs pH=6 group，**P＜0.01 vs pH=6 group）

圖4 金屬離子對(duì)多糖穩(wěn)定性影響（n=3，*P＜0.05 vs Na+組，**P＜0.01 vs Na+組）Fig.4Effects of metal ions on the polysaccharide stability（n=3，*P＜0.05 vs Na+group，**P＜0.01 vs Na+group）

4 結(jié)論

以上試驗(yàn)表明，分光光度法改用酶標(biāo)儀法測(cè)定多糖含量，其線性關(guān)系良好，穩(wěn)定性及精密度較好，且具有可重復(fù)性，可用于蘋果鏈格孢菌胞外多糖的含量測(cè)定。改進(jìn)后的蒽酮法其操作更加簡(jiǎn)便，無(wú)需更換及清洗比色皿，適用于大樣本測(cè)量分析。每次測(cè)定所消耗的樣品量較少，僅需200 μL即可，96孔板代替比色皿，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，避免因操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)所引起的誤差。但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也需注意多個(gè)問題：蒽酮在光照條件下不穩(wěn)定，蒽酮試劑需現(xiàn)用現(xiàn)配且注意避光保存；濃硫酸易吸水需注意周圍環(huán)境影響，操作需快速準(zhǔn)確；由于每次測(cè)定的加樣量較少，需注意操作帶來(lái)的誤差，加入液體時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生汽泡，液面高度一致，且注意保證板孔內(nèi)的清潔。

蘋果鏈格孢菌胞外多糖的熱穩(wěn)定性較好，酸堿穩(wěn)定性較差，應(yīng)避免與強(qiáng)酸堿溶液混合，多數(shù)金屬離子均對(duì)多糖的穩(wěn)定性有一定的影響，Cu2+、Fe3+影響最大，多糖溶液應(yīng)盡量避免存儲(chǔ)于金屬容器中，光照對(duì)多糖自身穩(wěn)定性影響不大，但可催化加快多糖的其他化學(xué)變化過(guò)程（氧化或者腐敗等），其原因尚不明確，還需進(jìn)一步探討。

通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)多糖含量測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)，可簡(jiǎn)化其操作，更適合大樣本的分析，且通過(guò)對(duì)蘋果鏈格孢菌胞外多糖穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，可為蘋果鏈格孢菌胞外多糖的研究利用奠定基礎(chǔ)。

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Stability of the Alternaria mali Roberts Exopolysaccharides and the Change from Spectrophotometer to Multiskan Spectrum

Fang Fang1，Liu Chunyan1，Chen Kaoshan1，2，Yuan Pingchuan1，Wang Hao1
（1.Wannan Medical College，Wuhu 241000；2.Shandong University）

In order to find an efficient，quick and stable method for determination ofAlternaria maliRoberts exopolysaccharides，the content and stability of exopolysaccharides in light condition，different temperature，pH，metal ions were studied by a multiskan spectrum microplate spectrophotometer.The results showed that the method for mensurating the exopolysaccharide content by multiskan spectrum had good linear relationship，stability and repeatability，the operation was simple and suitable for large sample measurement and analysis.TheAlternaria maliRoberts exopolysaccharides had better thermal stability at 20-80℃and remained stable in weak acid（pH=6）and Na+ion solution，strong acid and alkali solution or Cu2+、Fe3+ions had an impact on the stability of exopolysaccharides，the light could also influence the stability.

exopolysaccharides；anthrone-sulfuric acid method；stability；spectrophotometry；Multiskan Spectrum

Q539

A

1002-2090（2017）04-0072-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.016

2016-08-23

安徽省自然科學(xué)基金（1408085MH197）；安徽省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2015A199）；大學(xué)生科研資助金（WK2015S23）。

房芳（1996-），女，皖南醫(yī)學(xué)院2014級(jí)碩士研究生。

陳靠山，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：ksc313@126.com。