婁 菲，張 濤，劉睿杰，常 明，金青哲，王興國

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，食品營養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

溫度對裂殖壺菌S31中FAS及PKS基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

婁 菲，張 濤，劉睿杰，常 明，金青哲，王興國

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，食品營養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

以甘油為碳源，測定了搖瓶中裂殖壺菌S31進(jìn)入脂質(zhì)積累期后，溫度對胞內(nèi)油脂脂肪酸組成以及FAS和PKS基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果表明：當(dāng)裂殖壺菌進(jìn)入脂質(zhì)積累階段后，提高發(fā)酵溫度到30℃會減少藻油中DHA的含量，F(xiàn)AS基因的轉(zhuǎn)錄水平比PKS基因的更高；同時，降低發(fā)酵溫度到20℃會提高裂殖壺菌S31藻油DHA的含量，PKS基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于FAS基因的。實(shí)驗結(jié)果表明，溫度對PKS和FAS基因的轉(zhuǎn)錄水平有顯著的影響，從而決定裂殖壺菌S31中藻油脂肪酸組成的變化。

裂殖壺菌；DHA；FAS；PKS；轉(zhuǎn)錄調(diào)控

DHA(C22∶6)是一種重要的n-3系列多不飽和脂肪酸，被許多醫(yī)學(xué)研究認(rèn)定為必需營養(yǎng)成分[1-4]。很多破囊弧菌菌株可以積累大量的甘油三酯(50%～80%干菌質(zhì)量)，且其中多不飽和脂肪酸的比例尤其是DHA和DPA(C22∶5，n-6)非常高[5]。目前普遍認(rèn)為破囊弧菌中存在兩條多不飽和脂肪酸(PUFAs)的合成途徑，其一是“標(biāo)準(zhǔn)”途徑，在此途徑中PUFAs是由C14∶0經(jīng)一系列的延長酶和去飽和酶作用合成的[6]。這個過程需要氧分子的參與，因此又叫需氧DHA生物合成途徑[7]。另一途徑為PKS途徑，它不需要氧分子的參與把雙鍵加到已有的?；溕希窃谥舅岷铣傻倪^程中直接引進(jìn)的，因此又稱為“厭氧”PKS途徑[8]。

裂殖壺菌S31屬于破囊弧菌的一種，可以產(chǎn)生超過40%的DHA和DPA[9]。有研究表明在裂殖壺菌S31體內(nèi)厭氧PKS途徑才是合成DHA和DPA的唯一途徑[10]。作為PKS途徑的補(bǔ)充，F(xiàn)AS途徑則是負(fù)責(zé)其他飽和脂肪酸的合成。并且這兩條途徑存在競爭關(guān)系，因為兩者有重合的反應(yīng)，并且會競爭相同的底物如丙二酰輔酶A或者NADPH來合成相應(yīng)的脂肪酸[11]。

溫度作為發(fā)酵過程中的一個重要影響因素，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用以提高DHA含量[12]。低溫會使藻油中多不飽和脂肪酸的含量增加，但低溫同時會抑制細(xì)胞生長，降低發(fā)酵產(chǎn)量。因此，有人已經(jīng)嘗試兩階段溫度控制發(fā)酵實(shí)驗。當(dāng)采用裂殖壺菌HX-308在30℃條件下發(fā)酵32 h然后轉(zhuǎn)到20℃條件下發(fā)酵12 h，DHA的含量可以達(dá)到51.98%[13]。然而，對于其準(zhǔn)確調(diào)控機(jī)制卻知之甚少，這也阻礙了進(jìn)一步利用該機(jī)制繼續(xù)擴(kuò)大藻油中DHA含量的相關(guān)研究。轉(zhuǎn)錄分析是了解基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)，能夠為環(huán)境響應(yīng)機(jī)制以及細(xì)胞應(yīng)答機(jī)制提供更為深入的見解。因此，本文通過在不同發(fā)酵溫度條件下對裂殖壺菌S31中FAS及PKS脂肪合成酶系的基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行系統(tǒng)研究，闡明其調(diào)控脂肪酸合成的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

裂殖壺菌S31，由美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫(ATCC)獲得，并保存在ATCC790By+培養(yǎng)基中(人工海水中包含：5 g/L 葡萄糖，1.0 g/L酵母提取物及1.0 g/L胨)。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖，30 g/L；氯化鈉，0.3 g/L；酵母膏，5 g/L；硫酸鈉，15 g/L；硫酸鉀，1 g/L；谷氨酸鈉，5 g/L；磷酸氫二鉀，2 g/L；七水硫酸鎂，3 g/L；磷酸二氫鉀，3 g/L；氯化鈣，0.02 g/L；維生素B1，0.005 g/L；維生素B6，0.002 g/L；維生素B12，0.005 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油，100 g/L；酵母提取物，10 g/L；NaCl，0.3 g/L;硫酸鈉，15 g/L；谷氨酸鈉，15 g/L；硫酸鉀，1 g/L；七水硫酸鎂，4 g/L；磷酸二氫鉀，0.1 g/L；氯化鈣，0.05 g/L；維生素B1，0.008 g/L；維生素B6，0.002 g/L；維生素B12，0.008 g/L。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

由于不同初始細(xì)胞數(shù)會嚴(yán)重影響之后的油脂合成及DHA含量[14]，兩組搖瓶均控制在25℃以使其達(dá)到相同的細(xì)胞數(shù)。當(dāng)?shù)春谋M進(jìn)入油脂合成階段時，將其中一組的發(fā)酵溫度上調(diào)為30℃，另一組下調(diào)為20℃。當(dāng)殘余碳源含量低于15 g/L時，發(fā)酵停止。

細(xì)胞干重、總脂含量、脂肪酸組成、甘油質(zhì)量濃度及氨基氮質(zhì)量濃度的測定方法參考文獻(xiàn)[15]。以上指標(biāo)均重復(fù)測定3次，取平均值加標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

取5 g發(fā)酵液在4℃條件下6 000 r/min離心10 min。棄上清，迅速將下層細(xì)胞浸入液氮速凍1 min，然后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱?？俁NA采用SV總RNA提取試劑盒(Promega，USA)按說明書操作。殘余的基因組DNA污染采用10單位的DNAse I(Takara，China)在37℃下30 min，然后在80℃下5 min 使DNAse失活的方法去除。用目標(biāo)基因及參照基因引物，采用RNA-PCR的方法證明RNA樣品不存在基因組DNA污染。RNA的反轉(zhuǎn)錄采用Tiangen反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書條件操作(Tiangen，China)。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)

目標(biāo)基因及參照基因的mRNA水平通過RT-qPCR方法，采用SYBR Green染料法測定。RT-qPCR采用CFX-96 TM系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)的96孔板。

基因的相對表達(dá)水平采用ΔΔCT法。計算方法如下：基因的表達(dá)水平是與參照基因β-actin 作比較的，ΔCT=CT(目標(biāo)基因)-CT(β-actin)。對照組(25℃)的基因表達(dá)水平與調(diào)控組(30℃或20℃)作比較，ΔΔCT=ΔCT(調(diào)控組)-ΔCT(對照組)。相對表達(dá)水平表示為2-ΔΔCT。每個樣品測定3次，取其平均值加標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.4 引物列表

PKS的3個亞基分別由3個基因編碼而成，F(xiàn)AS是單一蛋白。引物序列如表1所示。

表1 PKS(PFA1，PFA2及PFA3)，F(xiàn)AS及ACT基因引物序列

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度調(diào)節(jié)后搖瓶內(nèi)的菌體生長、脂質(zhì)積累及脂肪酸組成

初始發(fā)酵溫度控制在25℃條件下發(fā)酵72 h氮源耗盡，標(biāo)志著菌體進(jìn)入脂質(zhì)積累階段。然后將其中一組溫度上調(diào)為30℃，另一組下調(diào)為20℃。當(dāng)溫度上調(diào)為30℃時，甘油及氨基氮的消耗速度均呈現(xiàn)增長趨勢，如圖1所示。

圖1 溫度上調(diào)為30℃發(fā)酵情況

由圖1可知，當(dāng)甘油質(zhì)量濃度降低為13.2 g/L時，發(fā)酵停止，細(xì)胞干重達(dá)到20.6 g/L且總脂含量為40.99%。而對于溫度下調(diào)組，溫度下調(diào)后甘油及氨基氮的消耗速度均減慢，如圖2所示。

圖2 溫度下調(diào)為20℃發(fā)酵情況

由圖2可知，當(dāng)甘油質(zhì)量濃度為12.4 g/L時發(fā)酵停止，細(xì)胞干重達(dá)到25.5 g/L且總脂含量達(dá)到47.72%。

調(diào)節(jié)溫度后，細(xì)胞脂肪酸組成及含量也表現(xiàn)出相應(yīng)的變化，見表2、表3。通常將PFAS定義為除DHA和DPA之外的其他脂肪酸。在本研究中，將PPKS定義為DHA和DPA之和。由表2可知，當(dāng)采用30℃的發(fā)酵溫度下，隨著發(fā)酵時間的延長,PFAS升高而PPKS降低。由表3可知，在20℃的發(fā)酵溫度下，隨著發(fā)酵時間延長,PFAS下降而PPKS不斷上升。

表2 溫度上調(diào)為30℃組的脂肪酸組成及含量

表3 溫度下調(diào)為20℃組的脂肪酸組成及含量

2.2 搖瓶發(fā)酵溫度調(diào)節(jié)后FAS及PKS基因的轉(zhuǎn)錄水平變化

目標(biāo)基因的mRNA水平的變化是由RT-qPCR測定的。發(fā)酵72 h進(jìn)入脂質(zhì)積累階段后調(diào)節(jié)溫度，各基因的表達(dá)情況如圖3、圖4所示。

由圖3可知，對于溫度上調(diào)組(30℃)，發(fā)酵時間為72.5 h時，F(xiàn)AS基因的轉(zhuǎn)錄水平降低為原來的32%，而PFA2和PFA3分別降低為原來的29%及32%；而在發(fā)酵時間為75 h時，F(xiàn)AS擴(kuò)大為原來的3倍，而PFA1只有原來的80%。因此，在溫度上調(diào)的過程中，F(xiàn)AS基因相比PKS基因更有優(yōu)勢。

圖3 溫度上調(diào)為30℃后各基因表達(dá)情況

圖4 溫度下調(diào)為20℃后各基因表達(dá)情況

由圖4可知，對于溫度下調(diào)組(20℃)，發(fā)酵時間為73.5 h時，PFA1、PFA2及PFA3的表達(dá)水平均增長為原來的2倍，而FAS基因的表達(dá)水平卻沒有表現(xiàn)出明顯的變化；在發(fā)酵時間為75 h時，PFA1和PFA3分別迅速增長為原來的9倍及10倍，而FAS基因增長為原來的3倍；在發(fā)酵時間超過75 h后，所有目標(biāo)基因的表達(dá)水平均有所下降，但PKS基因相對FAS基因仍具有明顯優(yōu)勢。

在此過程中，PFA1、PFA2及PFA3表現(xiàn)出了不同的變化趨勢，這或許可以解釋為3個亞基在脂肪酸合成過程中起著不同的作用?？梢钥隙ǖ氖牵?個亞基對于維持PKS基因的完整功能是不可或缺的。

3 結(jié) 論

通常來說，較低的發(fā)酵溫度不利于菌體的生長，卻會提高油脂中不飽和脂肪酸的含量，因此兩階段溫度控制策略被廣泛用來提高藻油中DHA的含量。本研究解釋了改變發(fā)酵溫度條件如何影響DHA含量，即其分子生物學(xué)調(diào)控機(jī)制。當(dāng)發(fā)酵溫度升高時，F(xiàn)AS基因比PKS基因更具優(yōu)勢；而當(dāng)發(fā)酵溫度降低時，PKS基因相比FAS基因更具優(yōu)勢。同時，脂肪酸組成的變化情況也與之相吻合。因此推測，裂殖壺菌S31通過調(diào)整脂肪酸組成來適應(yīng)外部環(huán)境如溫度的變化，而這一生物學(xué)過程至少部分是由FAS基因和PKS基因共同轉(zhuǎn)錄調(diào)控的。

除了溫度之外，還有很多其他因素例如碳源、溶氧及金屬離子等影響著DHA的生物合成，并且與FAS基因和PKS基因的表達(dá)水平有關(guān)。因此，后期可以進(jìn)行更多這些因素與基因表達(dá)情況之間關(guān)系的研究。同時了解分子層面的調(diào)控機(jī)制之后，可以嘗試采用基因工程手段使PKS基因過表達(dá)同時抑制FAS基因的表達(dá)或通過一定的手段使其不表達(dá)來進(jìn)一步提高油脂中DHA的基因。

[1] 曹萬新, 孟橘, 田玉霞. DHA 的生理功能及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中國油脂, 2011, 36(3): 1-4.

[2] CRAWFORD M A, CRAWFORD M A, COSTELOE K, et al. Are deficits of arachidonic and docosahexaenoic acids responsible for the neural and vascular complications of preterm babies?[J]. Am J Clin Nutr, 1997, 66(4): 1032S-1041S.

[3] HORROCKS L A, YEO Y K. Health benefits of docosahexaenoic acid (DHA)[J]. Pharmacol Res, 1999, 40(3): 211-225.

[4] UAUY R, HOFFMAN D R, PEIRANO P, et al. Essential fatty acids in visual and brain development[J]. Lipids, 2001, 36(9): 885-895.

[5] 孫冠男, 任路靜, 瞿亮, 等. 裂殖壺菌單細(xì)胞油脂的組分特性分析[J]. 中國油脂, 2013, 38(6): 70-73.

[6] KANG D H, ANBU P, KIM W H, et al. Coexpression of Elo-like enzyme and Δ5, Δ4-desaturases derived fromThraustochytriumaureumATCC 34304 and the production of DHA and DPA inPichiapastoris[J]. Biotechnol Bioproc E, 2008, 13(4): 483-490.

[7] QIU X. Biosynthesis of docosahexaenoic acid (DHA, 22∶6-4, 7, 10, 13, 16, 19): two distinct pathways[J]. Prostag Leukotr ESS, 2003, 68(2): 181-186.

[8] METZ J G, ROESSLER P, FACCIOTTI D, et al. Production of polyunsaturated fatty acids by polyketide synthases in both prokaryotes and eukaryotes[J]. Science, 2001, 293(5528): 290-293.

[9] RATLEDGE C. Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for single cell oil production[J]. Biochimie, 2004, 86(11): 807-815.

[10] LIPPMEIER J C, CRAWFORD K S, OWEN C B, et al. Characterization of both polyunsaturated fatty acid biosynthetic pathways inSchizochytriumsp.[J]. Lipids, 2009, 44(7): 621-630.

[11] HAUVERMALE A, KUNER J, ROSENZWEIG B, et al. Fatty acid production inSchizochytriumsp.: involvement of a polyunsaturated fatty acid synthase and a type I fatty acid synthase[J]. Lipids, 2006, 41(8): 739-747.

[12] 王澍, 呂小義, 張靜雯, 等. 不同碳氮源濃度和培養(yǎng)溫度對裂殖壺菌產(chǎn) DHA 的影響[J]. 中國油脂, 2015, 40(10): 74-77.

[13] ZENG Y, JI X J, LIAN M, et al. Development of a temperature shift strategy for efficient docosahexaenoic acid production by a marine fungoid protist,Schizochytriumsp. HX-308[J]. Appl Biochem Biotech, 2011, 164(3): 249-55.

[14] CHI Z, LIU Y, FREAR C, et al. Study of a two-stage growth of DHA-producing marine algaeSchizochytriumlimacinumSR21 with shifting dissolved oxygen level[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 81(6): 1141-1148.

[15] CHANG G, GAO N, TIAN G, et al. Improvement of docosahexaenoic acid production on glycerol bySchizochytriumsp. S31 with constantly high oxygen transfer coefficient[J]. Bioresour Technol, 2013, 142: 400-406.

InfluenceoftemperatureonFASandPKSgenestranscriptionlevelsofSchizochytriumsp.S31

LOU Fei, ZHANG Tao, LIU Ruijie, CHANG Ming, JIN Qingzhe, WANG Xingguo

(Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

Using glycerol as carbon source, the effects of temperature on the cellular oil fatty acid composition, FAS and PKS genes transcription levels were measured afterSchizochytriumsp. S31 entering lipid accumulation stage in shake flask. The results showed that after the cells entering lipid accumulation stage, when the fermentation temperature increased to 30℃, the DHA content in algal oil decreased, and the FAS gene transcriptional level was higher than that of PKS. When the fermentation temperature decreased to 20℃, the DHA content in algal oil increased and the PKS gene transcriptional level was significantly higher than that of FAS. All these datas showed that temperature had significant effects on PKS and FAS genes transcriptional levels, which determined the changes of fatty acid composition in algal oil ofSchizochytriumsp. S31.

Schizochytrium； DHA； FAS； PKS; transcriptional regulation

2016-10-17；

：2017-02-23

江蘇省自然科學(xué)基金(BK20140156)

婁 菲(1991)，女，在讀碩士，研究方向為脂質(zhì)科學(xué)與技術(shù)(E-mail)freya0427@aliyun.com。

常 明，副教授(E-mail)changming@aliyun.com。

Q936;Q812

：A

1003-7969(2017)08-0089-04

生物工程