陳培英 曾秋瓊 孔慶濤 張征 張玲莉 曾梅華 桑紅

(南京總醫(yī)院皮膚科 南京大學醫(yī)學院附屬金陵醫(yī)院，南京 210002)

·論著·

維拉帕米增加伊曲康唑體外抗煙曲霉能力

陳培英 曾秋瓊 孔慶濤 張征 張玲莉 曾梅華 桑紅

(南京總醫(yī)院皮膚科 南京大學醫(yī)學院附屬金陵醫(yī)院，南京 210002)

目的 探討臨床藥物維拉帕米對伊曲康唑體外抗煙曲霉能力的影響。方法 在僅含伊曲康唑 (ITZ)和含有ITZ與維拉帕米 (Vera)的平板上觀察煙曲霉菌落生長情況；顯微鏡下觀察煙曲霉在僅含ITZ和兩藥聯(lián)合的液體培養(yǎng)基中孢子萌發(fā)和菌絲生長情況；使用微量液基稀釋法和E-test方法測試兩個藥物聯(lián)用后的伊曲康唑對煙曲霉最低抑菌濃度。結果 ITZ聯(lián)用Vera比單用ITZ對煙曲霉菌落生長、菌絲萌發(fā)抑制效果更明顯，并且顯著降低了ITZ對煙曲霉的MIC。結論 維拉帕米增加伊曲康唑對煙曲霉的體外抗菌能力。

煙曲霉；伊曲康唑；維拉帕米；抗菌

隨著免疫抑制劑、廣譜抗生素和抗癌藥的廣泛使用，真菌感染現(xiàn)象日漸增多，經(jīng)常出現(xiàn)在器官移植者、造血干細胞移植者、ICU和外科手術患者身上[1]。其中，曲霉感染在血液科和ICU最常見。有流行病學報道約64%的血液學惡性腫瘤患者發(fā)生過霉菌感染，其中90%由曲霉引起[2]。使用免疫抑制劑的患者一旦發(fā)生曲霉感染，死亡率高達85%[3]。據(jù)統(tǒng)計，1970～2010年，侵襲性曲霉病已經(jīng)構成發(fā)展中國家醫(yī)院患者發(fā)病和死亡的主要原因[4]。目前可供臨床使用的抗真菌藥物數(shù)量有限，唑類藥物副作用少，是美國感染疾病協(xié)會指南推薦的治療和預防曲霉感染的一線用藥[5]，但侵襲性曲霉病患者經(jīng)過長時間唑類藥物治療后較易發(fā)生耐藥現(xiàn)象。臨床上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)曲霉對唑類藥物的敏感性呈下降趨勢。國內有研究者在服用了數(shù)月伊曲康唑但曲霉病復發(fā)的患者身上分離到比治療前耐受64倍的曲霉菌株[6]。更令人畏懼的是，很多菌株已經(jīng)進化出多藥耐藥特征[7]。可想而知，如果患者被曲霉耐藥菌感染，勢必增加治療難度，甚至造成感染治療失敗和復發(fā)。因此，有效抑制曲霉對藥物的耐受性和提高現(xiàn)有抗真菌藥物的藥效是治療曲霉感染疾病迫切需要解決的問題。

基于第二信使鈣離子的鈣信號通路參與幾乎所有細胞生理活動，對真菌生長發(fā)育和逆境響應非常重要。此信號通路主要通過調控通路成員或者鈣離子轉運體來改變生物體細胞質中鈣離子濃度進而幫助細胞應對各種環(huán)境刺激和生理信號。已有研究指出，鈣信號通路或其關鍵成員參與實驗室白念珠菌、構巢曲霉、煙曲霉對藥物逆境的響應[8-12]。這些研究結果提示阻斷鈣信號通路可能是克服臨床真菌耐藥和提高現(xiàn)有抗真菌藥物藥效的一條潛在途徑。維拉帕米屬于臨床上鈣離子拮抗類型藥物，被廣泛用于治療心血管疾病。本文研究擬檢測維拉帕米對伊曲康唑抗曲霉能力的影響，為藥物聯(lián)用抗菌研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗煙曲霉系南京總醫(yī)院皮膚科真菌室保存菌株，已經(jīng)經(jīng)形態(tài)學和分子生物學方法鑒定。維拉帕米 (購自上海信誼藥廠有限公司)用無菌雙蒸水配置成20 mg/mL濃度母液。伊曲康唑 (購自sigma)用二甲基亞砜 (DMSO)配置成1 mg/mL濃度母液。所有藥物母液均保存于-20℃冰箱。

1.2 方法

平板接菌法測試菌株對于藥物的敏感性 ①藥物平板的配置：豐富培養(yǎng)基YAG配置，每升培養(yǎng)基包含葡萄糖20 g，酵母粉5 g，微量元素1 mL。根據(jù)實驗需要將適宜體積的藥物母液加入到20 mL液態(tài)培養(yǎng)基YAG中，混勻之后立即倒入無菌平板凝固。藥物平板現(xiàn)配現(xiàn)用，防止藥物失效。② 菌懸液的配置：將上述實驗菌株接種在適宜培養(yǎng)基平板上37℃培養(yǎng)2 d，然后用0.002% Tween 80將平板上孢子洗下來收集到無菌管子里，用無菌水清洗3遍，孢子懸液血球計數(shù)。將計數(shù)好的孢子懸液用無菌水稀釋得到濃度為107孢子懸液，取出2 μL點接在配置好的藥物平板上，放置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d取出觀察生長情況。

液體培養(yǎng)法測試藥物對菌株生長的影響 根據(jù)實驗需要將適宜體積的藥物母液加入到液體培養(yǎng)基YAG中混勻配置成所需工作濃度的含藥培養(yǎng)基，每個藥物濃度組都加入等量菌懸液?；靹蚝筠D移至小培養(yǎng)皿中培養(yǎng)20 h后取出制片，在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)和菌絲生長情況。

藥物敏感性測試 參考CLSI-M38-A2指南使用微量液基稀釋法。根據(jù)實驗需要將適宜體積的藥物母液加入到液體培養(yǎng)基RPMI 1640中混勻配置成工作濃度 (2倍測試濃度)，孢子懸液用RPMI 1640液體培養(yǎng)基配置成工作濃度 (2倍測試濃度)，采用96孔板，按照藥物濃度由高到低順序在每行孔依次加入待測藥物工作液各100 μL，菌懸液100 μL，設立生長對照孔和陰性對照孔，設煙曲霉菌株ATCC MYA-3626為質控菌株。35℃培養(yǎng)48 h取出判讀MIC。與生長對照孔相比100%生長受抑制的藥物最低濃度判讀為MIC。

用E-test方法測試菌株對于藥物的敏感性 操作方法按照說明書所敘述進行。使用YAG培養(yǎng)基作為基底，在液態(tài)培養(yǎng)基溫度適宜情況下添加適當體積維拉帕米藥物母液，混勻后倒入平板冷凝成固體，取100 μL (約106個孢子)測試菌的孢子懸液均勻涂布于平板上。略干后用無菌鑷子夾取E-test試條小心放置于平板中間，保證MIC刻度朝上，最后將平板置于37℃培養(yǎng)48 h后讀取結果。

2 結 果

2.1 維拉帕米聯(lián)合伊曲康唑增加伊曲康唑抑制煙曲霉生長的能力

維拉帕米是鈣離子阻斷藥物，我們推斷它會影響煙曲霉對伊曲康唑藥物逆境的響應。為檢測這點，我們將煙曲霉臨床分離菌株AFS1分別接種到無藥、僅含有伊曲康唑、同時含有伊曲康唑和維拉帕米的平板上進行培養(yǎng)。如圖所示，隨著維拉帕米濃度從100 μg/mL增加到200 μg/mL，兩個藥物聯(lián)用后對菌落生長的抑制作用逐漸增強 (見圖1A)。為了比較菌株生長受抑制程度，我們測量各組菌落直徑。如圖1B所示，在單用維拉帕米或者單用伊曲康唑培養(yǎng)基上的菌落直徑平均值分別達到3.16 cm和1.43 cm，當維拉帕米聯(lián)合濃度達到200 μg/mL時培養(yǎng)基上未見煙曲霉生長。為了觀察是否在液體培養(yǎng)環(huán)境下也存在兩者協(xié)同抗菌作用，將菌株AFS1接種到液體藥物培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如圖1D所示，伊曲康唑單用對菌絲生長有一定抑制作用，但與維拉帕米聯(lián)用后，煙曲霉孢子均無萌發(fā)。為了進一步觀察這種協(xié)同抗菌作用是否在其他菌株中存在，我們將標準菌株A1160和AF293接種在藥物平板上。如圖1C所示，0.1 μg/mL伊曲康唑聯(lián)合200 μg/mL維拉帕米對標準菌株同樣有協(xié)同抗菌作用，但是菌株生長受抑制程度和臨床菌株AFS1不同，這提示伊曲康唑與維拉帕米聯(lián)用對不同來源菌株有不同程度的協(xié)同抗菌作用。

2.2 聯(lián)合維拉帕米降低伊曲康唑對藥物敏感煙曲霉菌株的最低抑菌濃度

進一步測試伊曲康唑與維拉帕米聯(lián)用對煙曲霉生長的抑制作用。用棋盤法將煙曲霉藥物敏感臨床分離菌株AFS1、標準菌株AF293和A1160分別接種在96孔板中含有不同濃度伊曲康唑與200 μg/mL維拉帕米聯(lián)合的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h讀取伊曲康唑最低抑菌濃度。圖2顯示96孔板底部菌絲生長情況，從中明顯看到伊曲康唑單用組從1 μg/mL伊曲康唑濃度開始無菌絲生長，而與200 μg/mL維拉帕米聯(lián)合后從0.5 μg/mL伊曲康唑濃度開始無菌絲生長，這提示聯(lián)合維拉帕米能降低伊曲康唑對藥物敏感菌株的最低抑菌濃度。

2.3 聯(lián)合維拉帕米降低伊曲康唑對煙曲霉耐藥菌株的最低抑菌濃度

為進一步觀察這兩種藥物對耐藥菌株是否同樣存在協(xié)同抗菌作用，我們用E-test法檢測煙曲霉臨床分離菌株AFS1 (ITZ敏感菌株)、耐藥菌株AFR1 (ITZ耐藥菌株)分別在含有及不含有維拉帕米環(huán)境下的伊曲康唑最低抑菌濃度值 (MIC)。加入維拉帕米使伊曲康唑對敏感菌株AFS1的MIC值從1 μg/mL降至0.5 μg/mL (見圖3左)，對耐藥菌株AFR1的MIC值從32 μg/mL降至4 μg/mL (見圖3右)，差異顯著。這些現(xiàn)象都說明聯(lián)用維拉帕米能顯著降低伊曲康唑MIC。

圖1 煙曲霉在不同濃度藥物培養(yǎng)基上菌落圖 (A，C)及菌落直徑 (B)和菌絲生長圖 (D)(Vera.維拉帕米，ITZ.伊曲康唑) 圖2 煙曲霉菌株在不同濃度伊曲康唑與維拉帕米 (200 μg/mL)聯(lián)用下的菌絲生長圖 圖3 伊曲康唑單用和聯(lián)合維拉帕米對煙曲霉敏感菌株 (AFS1)和耐藥菌株 (AFR1)的MIC值

Fig.1 The colonies (A，C) and colony diameters (B) and mycelial growth (D) ofAspergillusfumigatusin different drug media (Vera.verapamil,ITZ.itraconazole) Fig.2 Mycelial growth ofAspergillusfumigatusstrains in the different concentration of itraconazole with or without verapamil (200 μg/mL) Fig.3 MICs of itraconazole with or without verapamil against ITZ-sensitive (AFS1) or ITZ-resistant (AFR1) strains

3 討 論

基于鈣離子的鈣信號通路的重要性從高等動物到真核生物真菌一直被強調，它是調節(jié)生命活動的重要環(huán)節(jié)，特別是在真菌響應逆境方面。已有研究提出白念株菌和曲霉中鈣信號通路基因的缺失菌株對藥物環(huán)境敏感[12-14]。唑類藥物伊曲康唑、伏立康唑是侵襲性曲霉病治療的首選藥物。盡管曲霉物種總體對唑類藥物敏感，但獲得性耐藥特征導致藥物抗菌能力呈下降趨勢。真菌在進化上和人類比較接近，造成用于治療真菌感染的藥物非常有限。以前研究多關注新藥開發(fā)，而新型抗菌藥研發(fā)工作又是一個復雜的長期的過程。聯(lián)合用藥是一個潛在的提高當前抗真菌藥物效果的重要途徑。本文分析了臨床上鈣離子拮抗劑類型藥物維拉帕米對伊曲康唑抗煙曲霉能力的影響。我們的數(shù)據(jù)顯示維拉帕米能體外增加煙曲霉菌株對伊曲康唑的敏感性，將伊曲康唑和維拉帕米聯(lián)用可以很大程度降低伊曲康唑對煙曲霉敏感株和耐藥株的MIC值，這與已有文獻報道鈣信號通路重要基因參與曲霉唑類藥物響應途徑的結果是一致的[12]。不同的是，我們側重于探索和發(fā)現(xiàn)臨床藥物中鈣信號阻斷藥物有潛力成為提高唑類抗真菌藥藥效的輔助劑，這也為臨床曲霉感染治療提供一個新思路。

雖然我們的數(shù)據(jù)顯示與200 μg/mL濃度維拉帕米聯(lián)合，伊曲康唑對煙曲霉臨床菌株、標準菌株和耐藥菌株的抗菌作用得到明顯增強，但是這種聯(lián)合抗菌效應在其他類型的煙曲霉敏感菌株和耐藥菌株以及其他曲霉如黃曲霉、黑曲霉、土曲霉等是否也存在這種聯(lián)合抗菌效應，這點仍然需要后期收集大量不同來源不同類型菌株進行大樣本驗證。另外，我們的數(shù)據(jù)提示維拉帕米在100 μg/mL到200 μg/mL濃度與伊曲康唑聯(lián)合有協(xié)同抗菌作用 (見圖1A)，按照一個人體重50 kg和血液重量占人體7%～8%進行簡單粗略估算，維拉帕米體外100 μg/mL濃度尚在臨床給藥安全劑量范圍內。但是，諸如血藥濃度、生物利用度、藥物分布等因素都需要綜合考慮，后期我們必須在動物曲霉感染模型中驗證兩個藥物在體內聯(lián)合是否存在抗菌增效作用。以上工作也提示我們可以從更多鈣離子拮抗藥物中繼續(xù)篩選具有提高抗真菌藥物效果的其他臨床鈣離子拮抗藥物。

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[本文編輯] 施 慧

Verapamil enhances antifungal activity of itraconazole againstAspergillusfumigatusinvitro

CHEN Pei-ying,ZENG Qiu-qiong,KONG Qing-tao,ZHANG Zheng,ZHANG Ling-li,ZENG Mei-hua,SANG Hong

(DepartmentofDermatology,NanjingGeneralHospital,JinlingHospital,SchoolofMedicine,NanjingUniversity,Nanjing210002,China)

Objective To study the effect of verapamil on antifungal activity of itraconazole againstAspergillusfumigatusinvitro.Methods Colony diameters were measured to compare the drug sensitivity when the strains were inoculated on the media with itraconazole alone and in the combination of verapamil.Spore germination were observated by microscope under itraconazole alone and in the combination of verapamil.Testing for susceptibility to itraconazole was carried out by the broth-based microdilution and E-test methods.Results Colony growth and conidia germination and biofilms were inhibited better under the combination of itraconazole and verapamil than that under itraconazole alone.Conclusions Verapamil enhances antifungal activity of itraconazole againstAspergillusfumigatusinvitro.

Aspergillusfumigatus;itraconazole;verapamil;antifungal activity

203-206]

國家自然科學基金 (31500122)

陳培英，女 (漢族)，博士，助理研究員.E-mail:jxcpy@163.com

桑紅,E-mail:shzwqzsl@163.com

R 978.5 R 379.6

A

1673-3827(2017)12-0203-04

2016-12-28